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1、海水类固醇激素的测定高效液相色谱-串联质谱法（征求意见稿）编制说明海水类固醇激素的测定高效液相色谱-串联质谱法编制组二O二三年十二月项目名称：海水类固醇激素的测定高效液相色谱-串联质谱法项目统一编号：2022-4802本标准主要起草单位：广西壮族自治区海洋环境监测中心站、广西壮族自治区北海生态环境监测中心、上海第二工业大学、广东海洋大学、广西壮族自治区钦州生态环境监测中心。本标准主要起草人：任朝兴、蓝文陆、韦业、高桂兰、龙慧琴、王其春、吴鑫、房琴、苏子幸、张文武、王永峰、廖丽、赵利容、张鹏、张际标、黄仕英、吴茂银。1任务来源12标准制定的必要性和意义12.1 类固醇激素的分类、来源及危害12.
2、2 本标准研究的目标化合物的基本信息22.3 现行环境监测分析方法标准的实施情况和存在问题53国内外相关分析方法研究53.1 主要国家、地区及国际组织相关分析方法研究53.2 国内相关分析方法研究54标准编制工作过程64.1 成立标准编制小组64.2 查询国内外相关标准和文献资料74.3 确定标准制订技术路线，制订原则74.4 编写标准草稿和编制说明草稿84.5 方法验证工作84.6 编写标准征求意见稿和编制说明85标准制修订的基本原则和技术路线85.1 标准制修订的基本原则85.2 标准的适用范围和主要技术内容85.3 标准制修订的技术路线86方法研究报告106.1 方法研究的目标106.2
3、 方法原理106.3 试剂和材料106.4 仪器的选择106.5 样品106.6 分析步骤116.7 结果计算与表示197方法验证217.1 方法验证方案217.2 方法验证过程227.3 方法验证结论228重大分歧意见的处理经过和依据229自我承诺23参考文献23附件一方法验证报告28海水类固醇激素的测定高效液相色谱-串联质谱法编制说明1任务来源根据广西标准化协会关于下达2022年第四十六批团体标准制修订项目计划的通知（桂标协（2022）99号）文件精神，由广西环境科学学会提出，广西壮族自治区海洋环境监测中心站、广西壮族自治区北海生态环境监测中心、上海第二工业大学、广东海洋大学、广西壮族自治
4、区钦州生态环境监测中心共同起草的团体标准海水类固醇激素的测定高效液相色谱-串联质谱法（项目编号：2022-4802）o2标准制定的必要性和意义2.1 类固醇激素的分类、来源及危害类固醇激素是一类由胆固醇合成代谢具有生物活性的化合物。根据其生物学功能可以分为性激素和肾上腺皮质激素。性激素主要包括雌激素、雄激素和孕激素，肾上腺皮质激素包括糖皮质激素和盐皮质激素，许多类固醇激素药物已经广泛用于人类和动物的治疗。人工合成的糖皮质激素如地塞米松、强的松、强的松龙等广泛用于治疗各种炎症包括关节炎、结肠炎、哮喘、支气管炎、皮疹、过敏、鼻子和眼睛的炎症。人工合成的孕激素如焕诺酮，焕诺孕酮等用于避孕治疗、子宫异
5、常出血、更年期症状和某些癌症治疗。人工合成的雄激素如康力龙，甲睾酮，群勃龙等不仅用于临床治疗，还在养殖业尤其是肉牛养殖中作为雄性促生长剂的使用以及用于提高运动员成绩的促进剂。环境中的类固醇激素主要来自于人和动物的排泄物如尿液和粪便以及人工合成的类固醇激素的使用和排放。经过人和动物排泄过程，类固醇激素会通过污水处理厂出水口或者人为直接排放进入到环境中。类固醇激素是内分泌干扰物的一种，由于其在极低的浓度下（ngL）的水平就可能对生物体的生殖、神经和免疫系统产生严重危害，导致生物体的内分泌系统失衡，因而备受公众和科学界的广泛关注。前人对于环境中类固醉激素进行了大量研究，在地表水、污水处理厂、水产养殖
6、场、畜禽养殖场、污泥、土壤和生物体中均有检出。Zhang等利用建模的方法估算7种类固醇激素在中国流域的排放量,并预测它们在环境中的归趋,发现类固醇激素每年总排泄量中人体排泄物占38%,动物排泄物占62%,每年经过处理进入环境的类固醇激素排放量是2486吨，大约有83%的类固醇激素进入水体环境。海洋是地球水域集中地，人类生产和使用的大部分类固醉激素会通过入海污染源途径进入海洋环境。近年来，海洋环境中类固醇激素也越来越受到学者的重视，部分学者对爱尔兰都柏林湾、南海海陵湾、南海流沙湾、广东大亚湾等和广西北海湾等研究了类固醇激素污染分布特征及生态风险评价。其中在南海海陵湾区域类固醇激素的检出浓度范围为
7、0.04-40ngL1,风险系数等级依次从污水排放场到码头、养殖区、旅游区再到近海地区降低。2.2 本标准研究的目标化合物的基本信息本标准研究的目标化合物的基本信息如下表2-1o表2-1本标准研究的目标化合物的基本信息化合物英文名称CAS号分子量分子式结构式理化性质诺龙Nondrolone434-22-0274.398CisHaQHr?OH结晶固体，熔点：120T25C雄烯二酮Androstensdione63-05-8286.416此6。2熔点：170-173oC表睾酮EpiTestosterone481-30-1288.42CigHzeOzOH白色或奶油色白色结晶粉末，熔点：218-220
8、oC甲睾酮17-Methyltestosterone58-18-4302.451CaoHaoOsHO白色结晶性粉末，无臭，无味，溶于乙醇、甲醇、乙酷和其他大多数有机溶剂，微溶于植物油，几乎不溶于水，熔点：162-168块诺酮Norethindrone68-22-4298.42C2OH26O2H(C白色结晶粉末，不溶于水，微溶于乙醇，略溶于丙酮，溶于氯仿，熔点：205-206C孕酮（黄体酮）Progesterone57-83-0314.46C21H3OO2白色结晶性粉末，无臭，溶于醇、丙酮和二氧六环，微溶于植物油，不溶于水，熔点：128-132oC甲地孕酮Megestrol3562-63-834
9、2.47C22H3OO3白色或微黄色结晶性粉末，无臭。在空气中稳定。熔点202209C,极易溶于氯仿，溶于丙酮，略溶于乙酸乙酯，微溶于无水乙醇，不溶于水甲羟孕酮Medroxyprogesterone520-85-4344.5C2211323H3C港H白色或类白色结晶性粉末，无臭。不溶于水，易溶于氯仿，微溶于无水乙醇。熔点202208C可的松Cortisone53-06-5360.44C21HasOs白色结晶性粉末，溶于乙醇、丙酮和冷甲醇，极少溶于乙酸、苯和氯仿，微溶于水，水溶液呈中性。在浓硫酸中呈深红色溶液，并有深绿色荧光。熔点：223-2280C氢化可的松（皮质醇）Hydrocortison
10、e50-23-7362.46C21H3oO5ozOHoh白色或类白色结晶性粉末，不溶于水，难溶于乙微，微溶于氯仿，溶于丙酮、乙醇地塞米松Dexamethason50-02-2392.46C22H29FO5hovjoh白色或类白色结晶性粉末，无臭，甲醇、乙醇、丙酮或二氧六环中略溶，在三氯甲烷中微溶，在乙醛中极微溶解，在水中几乎不溶，熔点：255-264oC雌酮（雌酚酮）Estrone53-16-7270.37ClaH22O2HO”0i白色板状结晶或结晶性粉末几乎不溶于水，溶于二氧六环、毗噬和氢氧化碱溶液，微溶于乙醇（1：400）丙酮、苯、氯仿、乙醛和植物油。17-雌二醇17alt)ha-Eslr
11、adiol57-91-0272.38C)8H24O2粉末，溶于乙醇、丙酮及碱性水溶液，略微溶于乙醛及氯仿，不溶于水及稀酸。熔点：176-180oC17B-雌二醇（雌二醇）1邛-Estradiolum5028227238CisHo1O2白色或乳白色无臭结晶性粉末；无臭。在二氯六环、丙酮及其他有机溶剂溶解，在乙醇中略溶，不溶于水。雌三醇Estriol50-27-1288.38CisFLiOaOH“0Hhowp白色结晶粉末，难溶于水，微溶于乙醇（1：500）、乙酸、氯仿、二氧六环和植物油，易溶于毗噬和氢氧化碱溶液。熔点：280-282oC17a-乙块雌二醇（块雌醇）17A-ethinylestrad
12、iol4717-40-2296.40C2oH21O2一)工x6*hII)Q无色针状晶体，几乎不溶于水，能溶乙醉、乙酸、丙酮、氯仿、二嗯烷2.2现行环境监测分析方法标准的实施情况和存在问题2.2.1 现行污染物分析方法标准的局限性国内环境标准中针对海水中类固醇激素的测定目前仍是空白，国外美国EPA1694利用HPLC-MS/MS技术，采用同位素标识物为内标物定量测定环境样品中的药物及个人护理用品，适用于废水、地表水、地下水、固废不同环境基体，但也仅是分析抗生素。2.2.2 污染物分析仪器、设备、方法等的最新进展环境中类固醇激素的分析方法主要有：免疫分析法(ImmUnOaSSay)、液质联用法(L
13、CMS)、液相色谱一串联质谱法(LC-MS/MS)、气质联用法(GC-MS)和气相色谱一串联质谱法(GC-MS/MS)。免疫分析法对于具有相似的化学结构的激素时，传统的免疫法的选择性不高，导致准确率降低和交叉反应，除此之外还有灵敏度低、低通量等的缺陷而使其使用受限。气相色谱质谱联用仪具有高灵敏度、选择性好、能效高等优点解决了传统免疫法的问题，但是类固醇激素目标物挥发性差，使得样品在分析前需要复杂的衍生化处理，使实验步骤变得繁琐复杂也增加了实验操作时间。液质联用法(LCMS)、液相色谱一串联质谱法(LC-MS/MS)无需衍生化处理，不仅具有气相色谱质谱联用仪的优点，也简化了前处理技术。随着技术的
14、不断发展，超高液相色谱技术和三重四级杆质谱技术大大的提高了仪器的灵敏度、同时满足准确定性,直接进样,快速检测等要求。3国内外相关分析方法研究3.1主要国家、地区及国际组织相关分析方法研究经查阅有相关科研文献中涉及到水质中类固醇激素的测定方法。Sara等采用SPE-LC-ESI-MS/MS同时检测河水及污水中的雌激素，该方法前处理时间仅需要Ih,检测限在0.02L02ngL之间，回收率在74%之上。马有宁等建立了超高效液相色谱一串联质谱测定雌性斑马鱼性腺中13种类固醇激素的分析方法，平均加标回收率为74.8%127.0%周永顺等利用超高效液相色谱一串联质谱(UPLC-MS/MS)同时测定沉积物中
15、24种CSS的分析方法，24种CSS的平均回收率为64.9%125.1%,并测定3份珠江三角洲河流沉积物，检出11种目标物，含量范围为1.2529.38ugkg孙伶琳建立了固相萃取一高效液相色谱一质谱联用法对雌三醇、氟哌噬吨、块雌醇、雄烯二酮、雌二醇、雌酚酮、睾酮共7种类固醇激素的检测方法方法的检出限为0.66L95ngL,R0.998,回收率为78.5%94.6%3.2国内相关分析方法研究关于类固醇激素的标准检测方法，已有地方水质标准广东仅测试雌激素，山东测试的为环境激素，目前国内还没有测定海水中的这类药物方法，但在化妆品、动物源性食品中的标准检测方法较多，见表3-1。表3”化妆品、动物源食
16、品中类固醇激素的标准方法方法出处方法号目标化合物前处理分析方法检出限适用范围中国检验检疫总局GBT21981-28雄烯二酮、甲睾酮、雌酮、雌二醇、雌三醇、甲羟孕酮、孕酮、可的松、氢化可的松等超声提取TSPE柱净化高效液相色谱-质谱/质谱法0.420g永g猪肉、牛奶等动物源食品中国检验检疫总局GB/T22957-2008糖皮质激素溶剂提取一SPE柱净化液相色谱串联质谱法0.2l.0gkg河豚鱼、鳗鱼、烤鳗中国检验检疫总局GB/T34918-2017性激素溶剂提取-SPE柱净化超高液相色谱串联质谱法0.156mg/kg化妆品中国检验检疫总局GB/T40154-2021糖皮质激素超声提取液相色谱串联
17、质谱法0.03gg化妆品中国检验检疫总局SNT1980-27孕激素超声提取一SPE柱净化高效液相色谱-质谱/质谱法1.02.0gkg动物源性食品中国检验检疫总局SN/T2222-2008糖皮质激素培养提取一SPE柱净化高效液相色谱-质谱/质谱法0.75-10M50gL和100gL的类固醇激素标准工作溶液系列（此为参考浓度）。在该浓度范围内各组分的相关系数均大于0.995oSm (Mn. 3x3)TiC (Cortisone)T MRM of 2 Channels ES+2 4 006 8 00 IO oo 12 14 16 18.20 22 Sm (M, 3X3)4 09TlC (Hydroc
18、ortisone)2： MRM of 2 Channels ES+2.004 006 008 0010 12 0014 0016 0018 0020 0022 00Sm (Mn. 3x3)4 43TIC (Dexamethasone)3 MRM of 2 Channels ES*2 004 006 008 0010 0012 0014 0016 0018 0020 0022 00Sm (Mn. 3x3)73A TlC (Nondrolone)4： MRM of 2 Channels ES+,2 b4 bb, 6 b8 o , i,61 1266 ,i4l661 iaoo1 ,6, 2l022,
19、00,Sm (Mn. 3x3)4 76TlC (Androstenedione)5 MRM or 2 Channels ES+,2b,4006.b,b,i,6l12l0i4.l66,ieoo1i8,0,2.l022.l0Sm (Mn. 3x3)4.76TIC (Norethindrone)6 MRM of 2 Channels ES+2.004 6 008 0010 12 14.16.18.0020 22.00Sm (Mn. 3x3)100-l5 18Sm (Mn, 5x5)100la318Ac (Estnoi)1： MRM or 2 Channels ES-100Sm 南n. 5x5)IoO
20、l d2.0b3004.0b4 00 l5036.007 008.00TIC(17-beat-Estradiol)9.0b100011 2 MRM of 2 Channels ES-1.Sm (Mn, 5x5)2.003 00 1400 14 02 5. 600 TIC (Estrone)700800 1900ib,o , iio3： MRM of 2 Channels ES-1002 00 13 00 14 005 OJ 6 00 7 00 18 b ,900,il66 , 1V66 ,Sm (Mn, 5x5)1 00TIC (ITa-Ethinylestradiol)4: MRM of 2
21、 Channels ES-7 008 0090010 0011 000.200Sm(Mn.3x3)4006.005.27A810.TIC(MegetroI)12*0014*001600,18,62(X)228：MRMof2ChannelsES+200Sm(Mn.3x3)4006005.31llA_8001Tie(Epitestosterone)12.l0014l001616o18l00,2b.0022.66,9：MRMof2ChannelsES+200Sm(Mn.3x3)400600544A800100012TiC(Medroxyprogesterone)1400160018l672l0122
22、l661.O：MRMof2ChannelsES2004006008001000120014001600180020002200TIC(17-Methyltestosterone)7sMRMof2ChannelsES+Sm(Mn.3x3)Iool5TIC(Progesterone)llsMRMof2ChannelsES2.004.6.8.10.12.0014.0016.18.0020.2200TimeSm 阳n. 5x5)1001耳1.002 003.004145:MRMof3ChannelsES-TlC(17-alpha-Estradiol)40050700800900WOO1100Time图
23、6“类固静激索总离子流色谱图6.6.4 方法检出限按照环境监测分析方法标准制修订技术导则(HJ168-2020)的相关规定，连续分析7个接近于检出限浓度(5ngL)的实验室空白加标样品，计算其标准偏差So用公式：MDL=SXtno.娜,(t(6,0,99)=3.143)进行计算。其中:tso99)为置信度为99%、自由度为nT时的t值；n为重复分析的样品数。测定下限为4倍检出限。经全过程分析，数据结果见表6-2o表6-2方法检出限计算结果(取样体积100OmL,n=7)化合物测定值(ngL)平均值标准偏差检出限测定下限1234567(ngL)(ngL)(ngL)(ngL)诺龙2.32.92.5
24、3.43.231262.90.41135.2雄烯二阳2.73.13.04.53.231313.20.58187.2表睾酮2.02.02.92.42.726312.50.42145.6甲睾酮1.22.02.01.62.617201.90.44145.6块诺酮1.92.81.92.64.236262.80.852710.8孕酮2.12.62.82.43.531292.80.46156.0甲地孕阳2.52.32.62.63.540353.00.65218.4甲羟孕酮1.62.22.32.43.023232.30.41135.2可的松3.64.03.63.94.342414.00.28093.6氢化可
25、的松2.83.03.62.45.046343.50.953012.0地塞米松3.53.84.93.54.450484.30.66218.4雌酮4.65.14.34.35.047474.70.31104.017-雌二醉4.24.24.63.83.547444.20.43145.617B-雌二醉4.14.54.84.24.147464.40.29104.0雌三醇4.24.33.63.43.840403.90.32104.06.6.5 方法的精密度对三个浓度水平分别为低浓度(10ngL)、中浓度(20ngL)、高浓度(50ngL)类固醇激素加标水样进行了精密度测试(见表6-3到表6-5),每个浓度水平配制6份平行样品。从表中可以看出，低中高浓度测试的相对标准偏差分别为3.2%-14.4%、2.7%-14.7%、2.9%-14.5%,说明方法的精密度良好。表63低浓度样品测试的精密度数据化合物测定值(ngL)平均值(ngL
