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1、输血科ABO血型鉴定标准操作规程1、目的：规范实验室工作人员的操作程序，确保实验过程及结果的准确性与可靠性。2、范围：本规程适用于本实验室ABO血型鉴定试验操作。3、职责3.1工作人员对所进行的ABO血型鉴定试验技术操作应熟悉掌握。4、ABo血型鉴定4.1 ABe）正反定型试验原理根据红细胞上有无A抗原或（和）B抗原，将血型分为A型、B型、AB型和0型四种，可利用红细胞凝集试验通过正（细胞试验）反（血清试验）定型准确鉴定ABO血型。ABO血型系统正定型是指用定型试剂和被检红细胞反应所鉴定出的ABO血型，反定型是指用被检者血清和已知ABO血型的试剂红细胞进行的反应所鉴定出的ABO血型。在血清学技
2、术中，正定型可检出常见的ABO系统抗原有A抗原、B抗原。反定型可检出的常见抗原有抗A、抗B。由于ABO血型系统中却是以上的常见抗原必然能检出相应抗体，反之缺失以上常见抗体必然存在相应抗原，所以正反定型的结果可以相互参照，确保定型的正确性。另外，正反定型不符常是存在ABO亚型的证据，所以利用正反定型技术可以发现ABO亚型的存在。4.2 玻片法鉴定ABo血型（不推荐）4.2.1 正定型在标记的玻片上分别加1滴抗A、抗B、抗AB；各加1滴红细胞悬液（根据使用说明决定受检者红细胞浓度）；用干净的加样棒把红细胞悬液和试剂充分混合，并把混合物均匀涂开，使其覆盖玻片表面大部分，慢慢连续倾斜玻片5分钟，观察结
3、果：凝集为阳性结果；细胞均匀悬液5分钟后仍未见凝集为阴性结果；对结果有怀疑时，可用试管法重新试验。4.3 试管法测定ABo血型（强烈推荐）4.3.1 正定型在三只分别标记抗A、抗B和抗AB的干净试管中分别加入相应的试剂；在每个试管中各加1滴2-5%受检者的红细胞悬液；轻轻混匀，离心15秒（3400转/分），轻轻重悬细胞扣，检查凝集情况；判读结果，与反定型结果比较。4.3.2 反定型取小试管4只，分别标记为Ac、Be、OC及自身对照，并分别加入受检者血浆/清各2滴，然后分别加入A型、B型、O型试剂红细胞及受检者红细胞悬液各1滴。将上述各管混合，离心15秒（3400转/分），观察红细胞凝集情况，判
4、读结果，并与正定型结果比较。4.3.3 结果及解释正、反定型试验的溶血或凝集都表示阳性结果；重悬细胞扣后的均匀的红细胞悬液表示阴性结果；ABO细胞及血清试验的结果和解释见表3.4,在记录血型结果前要解决细胞和血清试验不一致的问题。ABo血型鉴定的结果判定衣3.4ABO血量整定中细胞州IiI清试验靖果定受检言红细胞。定曳状剂的反应受检乔IiI清9状剂红加虫的反应判定抗AA细胞8细立0细他ABO型002004*0020A042*00B4*4*000注，+:茶棠.0：不凝集O型红细胞在血清试验中作为一个对照细胞可检出缗钱状假凝集、抗H（例如孟买型标本）或其他ABO系统以外抗体，以及检查与血型抗原体无
5、关而在血清中存在时能使细胞发生凝集的某些物质。正定型没有达到4+凝集要怀疑亚型（三甲以下医院因技术水平、设施因素等不做苛刻要求）。4.4 微板法测定ABO血型（大批量检测）4.4.1 正定型（细胞定型）1）在微孔板的3个干净孔内分别加入1滴抗A、抗-B,（如需要可在第三孔内加1滴抗.AB进行平行试验）。2）在含有血型定型试剂的各孔内加入1滴红细胞悬液（红细胞浓度参照试剂盒说明书要求或采用经确认与检测系统匹配的红细胞浓度），轻叩板边，混匀孔内物质，可以采用自动化的标本处理系统完成抗血清和受检红细胞悬液的配制和加样。3）经确认与检测设备相适应的离心和重悬条件完成微孔板的离心和悬浮。离心结束后用手轻
6、叩微板或借助微板振荔器重悬细胞扣。如采用酶标仪进行结果的自动判读，微板振荡器重悬条件需经过预确认。4）肉眼观察红细胞是否凝集，判读结果并记录，并与反定型结果比较.也可以采用具有血型判读功能的酶标仪进行结果的自动判读。4.4.2 反定型（血清定型）1）在微板的两个干净孔内，每孔内加1滴受检者血清或血浆。2）在含有血清或血浆的各孔内分别加1滴Al细胞、B细胞（红细胞浓度参照试剂盒说明书要求或采用经确认与检测系统匹配的红细胞浓度）。如需要，可添加A2或O细胞进行附加试验；轻叩板边，混匀孔内物质。可以采用自动化的标本处理系统完成受检血清/血浆和试剂红细胞悬液的配制和加样。3）离心和悬浮，经确认与检测设
7、备相适应的离心和重悬条件完成微孔板的离心和悬浮。结束后用手轻叩板或借助板振荡器重悬细胞扣4.5 微柱凝胶法4.5.1 试验原理基于生物化学凝胶过滤技术和离心技术及免疫化学抗原抗体特异反应。当特异性抗体和有相应抗原的红细胞反应，红细胞发生直接凝集（IgM抗体）或致敏（IgG）,离心时凝集块不能通过凝胶间隙而留在凝胶上层，呈阳性反应。4.5.2 试剂：凝胶卡配套试剂（博讯ABO血型卡）。4.5.3 操作步骤1）准备ABO血型定型检测试剂卡，按照规定检查符合要求后，进行标记。2）第5、6孔分别加入0.5%-0.8%反定型用试剂红细胞悬液50微升。3）第1、2、3孔，第4孔各加0.5%-0.8%受检者
8、红细胞悬液50微升。4）第5、6孔各加受检者血浆25微升。5）离心5分钟4.5.4 结果判读：血型鉴定的判读同试管法。出现凝集和溶血结果为阳性，不凝集为阴性，血型卡质控管应为阴性。微柱凝胶法强度判读见下表。微柱凝胶法凝集强度判读表4+3+2+1+混合视野(Dcp)溶血(H)红细胞在凝胶柱内的反应情况结果判读全部位于胶表面大部分红细胞位于胶表面，少部分位于胶中上部大部分位于胶中部，少部分位于胶中上部位于胶中近底部绝大部分沉积在管尖底部，极少量位于胶中近底部胶表面和管尖底部的红细胞同时存在红细胞复合物部分或完全消失，柱内液体为透明红色全部沉积在管尖底部备注：更详细正确的微柱凝胶法凝集强度判读表格见
9、输血科红细胞意外抗体筛查和鉴定标准操作规程4.5.7结果判定与解释。4.5.5 注意：凝胶卡管内有气泡和干涸现象时不可使用。血型正定型细胞浓度按照说明要求配制。纤维蛋白可吸附部分红细胞，应将血样离心。反定管先于正定管加样，以便标准细胞与血清血浆反应,先加细胞后加血浆。质控（CtI）为阳性时，请先用生理盐水洗细胞,再做血型。5、ABO亚型鉴定鉴定程序ABe）抗原的血型或变异型很多，在A抗原种主要有Al和A2,其他A亚型不常见，而B亚型一般比A亚型更少，区分ABO亚型，可根据红细胞与抗A、抗A1、抗B、抗H及抗AB的凝集程度，分泌型人唾液中是否存在A、B、H物质加以判定。5.1 Al和A2亚型鉴定
10、试验原理抗A试剂中含有抗A和抗Al两种抗体，抗A可以凝集所有A型和AB型红细胞，而抗Al只能与部分A型和AB型红细胞反应，据此凡与抗Ai反应者被定为Al或AlB型，不与抗Al反应，而与抗A反应者被定为A2或A2B型。5.1.1 试验方法取干净试管三只，分别标明受检者、Al对照和A2对照；三只试管中各加入1滴抗Al定型标准血清；分别将受检者红细胞悬液以及对照用Al红细胞悬液、A2红细胞悬液各1滴加入相对应的试管中，离心观察结果。5.1.2 结果及解释如Al对照红细胞凝集，而A2对照红细胞不凝集，则受检者红细胞凝集者为Al,不凝集者为A25.1.3 若考虑受检者为ABO血型其他类型亚型/抗原抗体减
11、弱，可根据具体情况加做其他实验，如正定型加做人源抗A/B、抗-Al、抗-AB和抗-H,反定型增加血清量、延长反应时间、放置4反应、吸收放散实验等，观察凝集情况，初步判断是何种亚型。5.2 用吸收和放散法证实其他弱A或弱B亚型5.2.1 试验原理有弱A或弱B抗原的红细胞不被抗A或抗B所凝集，但可以吸收这种特异性抗体。用放散法洗脱吸收的抗体就能证实与已知特异性抗体反应的抗原活性物质的存在。5.2.2 试验方法1）用盐水至少洗涤ImL受检细胞3次，最后一次洗涤后除净上清液；在洗涤过的红细胞中加入ImL抗A试剂（如怀疑是弱A变异型）或ImL抗B试剂（如怀疑是弱B变异型）；充分混匀红细胞和抗血清，把混合
12、物放置41小时；离心混合物，移除上层抗血清；将红细胞转入一个干净试管；用大量4冷盐水（ImL或更多）至少洗涤红细胞8次，留最后1次洗涤的小部分洗涤液作游离抗体检测;使用合适的放散方法，如热放散或乙醛放散等方法，从细胞上放散出吸收的抗体；离心，将上层放散液转入1个干净试管；2）检测放散液及最后一次洗涤液：2滴放散液或最后洗涤液加1滴相应红细胞，立即离心，3715分钟及间接抗人球蛋白试验后检查凝集状况。（如果用的是抗A则用3个不同的Al细胞样本和3个不同的O型细胞）；如果用的是抗B则用3个不同的B样细胞样本和3个不同的。型细胞）5.2.3 解释D如果放散液与3个抗原阳性细胞在各阶段都反映，放散液与
13、3个O型红细胞在各阶段都不发生反应，最后洗涤液与6个细胞均不起反应。那么放散液中存在抗A或抗B,则细胞上存在A或B抗原。2）如果放散液不与A或B细胞发生反应，那么可能表明细胞上没有抗原表达，不能吸收相关抗体，或是放散液制备失误造成。如果放散液与一些所有A或B细胞，也与一些或所有O细胞起反应，它表明在吸收放散过程中，重新获得了一些其他的或附加的抗体。3）如果最后洗涤液与A或B细胞起反应，则认为对放散液做的实验的结果是无效的，也可能是放散前未结合的时机抗体没有充分去除，也可能是细胞没有充分洗涤，还可能是结合的抗体在洗涤过程中分离。5.3 B、H、Le和Le（b）唾液试验5.3.1 试验原理人群中约
14、有78%的人还有Se基因，它能控制分泌水溶性ABH抗原物质，进入体液（脑积液除外）。抗体能与相应抗原的红细胞发生特异性凝集，体液中的可溶性抗原物质与该抗体发生体液的中和反应,抑制抗体凝集红细胞。利用血凝抑制试验方法，把唾液中水溶性A、B、H、LeWiS血型物质和对应这些抗原的抗体中和，然后加入相应细胞。如果这些细胞凝集就表示唾液中不含有该抗原，若是分泌型，唾液中应能证实这些分泌的抗原。5.3.2 收集唾液1）收集唾液，离心900-1000g8-10分钟将上清液移入干净试管，煮沸8-10分钟以灭活唾液酶。2）离心900-1000g8-10分钟，取清亮或微呈乳白色的上清液，将不透明或半固状的物质丢
15、弃。注意：几小时内实验，样本须冷藏，几天内实验，样品须-20C保存，冰冻保存的样品活性可持续几年。5.3.3 试验方法：1）选择血型试剂的稀释度（标化）2）倍量稀释抗血清，在每一稀释度的1滴抗血清中加入1滴相应2-5%红细胞离心；选择凝集强度为2+,最高稀释度的抗血清。3）在四只试管中加入1滴最佳稀释度的血型试剂，A、B、H唾液试验分别表明：分泌型、非分泌型、盐水、测定者；Lewis唾液试验则表明LeWiS阳性、LeWiS阴性、盐水、测定者。4）在分泌型、非分泌型、测定者试管中，加入1滴相应的唾液；“盐水”管中加入1滴盐水。5）混匀置于室温10分钟，加入相应的红细胞1滴混匀置于室温30-60分
16、钟。6）离心目测结果。5.3.4 结果及解释细胞与试管中的抗体发生凝集反应，表明该唾液不含有相应抗原;细胞与已知抗体不发生凝集反应，表明唾液中含有相应的抗原；细胞不与唾液对照管的抗体凝集，唾液试验结无效，这通常表示试剂的稀释度太大，重新选择合适的稀释度做试验。6、ABO定型试验中的常见问题我们在日常的血型鉴定中经常会碰到血型鉴定正反不一致的情况。造成这种正反定型不一致的原因很多，其中有技术和管理上的问题，也有标本红细胞或血清本身的问题，主要有：（1）标本或试剂搞错，产生假阳性或假阴性结果。（2）器材不洁，产生假阳性或假阴性结果。（3）试剂污染或失效，产生假阳性或假阴性结果。（4）离心过度或不足
17、，产生假阳性或假阴性结果。（5）细胞浓度过高，将压积细胞误判为阳性结果。（6）阳性反应产生溶血现象未能识别，错判产生假阴性结果。（7）漏加试剂，产生假阴性结果。（8）结果记录或判断错误，产生假阳性或假阴性结果。（9）细胞与血清间比例不适当，产生假阳性或假阴性结果。（10）血清异常Wharton胶或血清蛋白引起缗钱状形成，影响反定型结果。（Il）红细胞致敏受免疫球蛋白致敏的红细胞，在含高蛋白介质的试剂中，可发生凝集。（12）异常基因型ABO亚型的检查中，A、B抗原可能为弱抗原，难以检出。（13）近期输血试验前曾输入过其他ABO血型不一致的血液，使得血液标本成为混合血型的红细胞悬液，定型时显示“混
18、合外观凝集”现象。(14)嵌合体血型(开米拉，chimerism)这种血型者体内有两类血型红细胞群体，定型时可以出现“混合外观凝集”现象。(15)疾病因素导致抗原减弱某些白血病患者和难治性贫血患者中，ABO血型系统的抗原性可受到抑制，检出困难。(16)红细胞多凝集现象红细胞因遗传或获得性表面异常，发生多凝集现象。(17)获得性B由于革兰氏阴性杆菌的作用，红细胞可获得“类B”的活性。(18)血型特异性物质过高一些卵巢囊肿病例，血性物质的浓度很高，可中和抗A和抗B定型试剂，要得到正确的正定型结果，必须洗涤红细胞多次。(19)近期内进行大量的血浆置换治疗由于使用大量的非同型的血浆作置换治疗，标本血清
19、中含有所输供体提供的抗A或抗B抗体,造成反定型错误。(20)异常的血浆蛋白受检者血浆中异常的白蛋白、球蛋白比例和高浓度的纤维蛋白原等导致缗钱状形成，造成假凝集现象。(21)不规则抗体的存在受检者血浆中，含有ABO血型抗体以外的不规则抗体，与试剂红细胞上其他血型抗原系统的抗原起反应。(22)低丙种球蛋白血症低丙种球蛋白血症(丙种球蛋白量减低)病例，可能会因免疫球蛋白水平下降而使血清定型时部凝集或弱凝集反应。(23)药物等因素药物如右旋糖醉等及静脉注射某些造影剂可引起红细胞凝集或类似凝集。(24)年龄因素免疫系统尚未健全的婴儿、由母亲被动获得抗体的婴儿，或抗体水平下降的老人，试验时可能出现异常的结果。(25)防腐剂因素患者体内可能含有对防腐剂中的成分或对混悬介质的抗体，导致ABO定型差错。
