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1、2024戊二酸调节T细胞代谢和抗肿瘤免疫反应靶向肿瘤浸润相关性T细胞是引发抗肿瘤免疫反应的有效途径。然而，如何有效地干预和调控T细胞在很大程度上仍然未知。2023年8月，日eanorMinogue等人在Naturemetabolism杂志上发表了一篇题为GlutarateregulatesTcellmetabolismandanti-tumourimmunity的论著，重点阐明了戊二酸是T细胞代谢和分化的关键调节因子，在改善T细胞免疫治疗中具有至关重要作用。现介绍如下：naturemecbolismGlutarateregulatesTcellmetabolismandanti-tumouri
2、mmunitya-9OMW9OMu,.raroF.CMntaa二vwwwnJMlr,.二二二二miiutwwLO11mj.hvMB*TU4BtghB,.Ov*d，“.AWSAlMMndroQMerM.4w*r!.，9jow*mm*Chkwupd*lM戊二酸是CD8T细胞功能的内源性调节剂首先，研究者探究了结构上与2HG（2羟戊二酸）相关的化合物是否可以增加CD8T细胞的Tcm（中央记忆T细胞）群体。为了进行该分析，研究者鉴定了2HG的19种结构类似物。研究者使用了大多数所用化合物的酯化形式，以增加效力和细胞内转运。在这些试验中，S-2HG的辛酯形式用作阳性对照。在所测定的19种测试化合物中，仅
3、戊二酸二乙酯（DEG）显著增加TCM样群体的丰度。DEG是代谢产物谷氨酸（戊二酸盐）的二酯化形式。研究者发现单独用戊二酸处理也能够在CD8+T细胞的活化和分化期间增加TCM群体。虽然外源性戊二酸可以被T细胞吸收，但酯化形式的戊二酸在调节CD8+T细胞分化方面更有效。为了证实外源性使用DEG导致细胞内戊二酸水平增加，研究者对13C5标记的DEG进行同位素示踪。示踪显示，DEG在摄取后非常迅速地转化为细胞内戊二酸。戊二酸是色氨酸和赖氨酸降解的产物，靠近犬尿氨酸途径的末端。当前只有非常有限的文献涉及免疫细胞中的戊二酸。因此，研究者试图确定天然和活化的CD8T细胞中存在的戊二酸的量。使用质谱法测定CD
4、8+T细胞中内源性戊二酸的细胞内水平，结果显示戊二酸水平在T细胞活化后显著增加。T细胞活化会极大地改变T细胞代谢，这种代谢变化的主要驱动因素是缺氧诱导因子1-（HIF-1）转录因子。研究者测定了HlF-Ia三予生型和HIF-Ie（敲除型小鼠CD8T细胞中的戊二酸水平，发现在野生型细胞中观察到的戊二酸增加在HlF-IC（敲除细胞中几乎完全不存在。这一发现表明HlF-I潟录因子对调节T细胞戊二酸水平至关重要。同样地,与在21%氧水平下培养T细胞相比，在1%氧水平下培养T细胞24小时使戊二酸水平增加约两倍。研究者还发现用DEG处理的CD8T细胞和用ShGCDH处理的CD8T细胞都显示出细胞毒性效应分
5、子颗粒酶B（GZMB）表达的增加。根据对DEG改变T细胞分化观察到的结果，研究者检查了处理细胞中的多个耗竭相关标记，在DEG处理10天后的人CD8T细胞培养物中，发现了TOX（-种已知协调耗竭的转录因子）以及耗竭标记TIM3和LAG30相反，通过过表达GCDH（使用GCDH过表达载体）降低戊二酸水平导致TOX、TIM3和LAG3表达增加。综上所述，这些数据表明戊二酸可以改变CD8T细胞分化。a S=g 1.80。oeu28dROoOl80 - 0.0O3960- 40- 20-O-1 一 IgAede m YCO62LhCD44N匚ECD 96 7 9 6 Oog式86英出宠Test comp
6、ound IDMouseCell growth6=8JBqoOJQqUlnUSQ0.80 -1.000 -9 02-0ox OaaOe OeoOo 0800 .SOQO A9 9950$ aso 80E 200 98so I99fOoO o $8S3 8 sod B8Test compound IDGCDH石 qnu9 AdouEd8.0-IC 12s2oS=8 9.0- Ic OWO3-O10.0 - ：0Oe &OOO J 谿 .o TOa 4.0 -I * 2.0-OWT Htf-Ia knockoutPercentage O2No SL06UQlP POJ LdsZGO)DG500M
7、ShGCDH GCDH 0vc9xpc0MdQ GCDH OVOfOiprQMOd 500 M DEG0 3 &UB pJzw Z601图1戊二酸是CD8+T细胞功能的内源性调节剂戊二酸是KGDDs（酮戊二酸依赖性双加氧酶）的抑制剂戊二酸在结构上与2HG、富马酸、琥珀酸和C(KG相似，因此是C(KGDDS的候选竞争性抑制剂。为了确定这种情况是否属实，研究者重点研究了OKGDS的三个亚家族：甲基胞口密D定双加氧酶(TETS),缺氧诱导因子脯氨基4-羟基酶(HlF-P4Hs)和组蛋白赖氨酸去甲基酶(KDM)。在无细胞酶活性测定中，戊二酸盐以1.5mM的半数最大抑制浓度(IC50)抑制重组TET2,
8、并且这种抑制作用与O(KG具有竞争性。然而，DEG在无细胞试验中不抑制TET2,这进一步证明了研究者观察到的结果是由于游离戊二酸所致。在验证戊二酸对HIF-P4H的抑制作用时，研究者使用了由Gal4响应元件驱动的荧光素酶报告基因。研究者发现DEG可以抑制该模型系统中的细胞HIF-P4H-I活性。当向培养物中加入浓度递增的C(KG时，戊二酸对HIF-P4H-1的抑制作用降低，表明与TET2抑制作用一样,戊二酸以aKG竞争性方式抑制HIF-P4H-1oHIF-P4H-1的这种抑制与DEG处理7天的CD8T细胞中几种HIF靶基因的表达增加相关。为了确定戊二酸是否也抑制KDM酶，用DEG培养CD8+T
9、细胞7天，并确定许多组蛋白3(H3)赖氨酸残基的甲基化状态。CD8+T细胞的DEG处理增加了H3K9的二甲基化和三甲基化以及H3K27的三甲基化。H3K9和H3K27甲基化的增加通过添加等摩尔量的QtKGd得以消除,而H3K9me2水平并没有随着C(KG的添加而降低。由于KDM4C和KDM6A分别负责H3K9me3和H3K27me3的去甲基化，对这些酶进行了无细胞酶活性测定，结果发现戊二酸抑制KDM4C的IC50为ImM,抑制KDM6A的IC50为0.6mMo正如预期的那样,在无细胞测定中，单独的DEG不能抑制KDM4C活性。这些试验数据表明，戊二酸至少是三种特定KGDD的抑制剂，即TET2、
10、HIF-P4H-1和KDM4C/6A酶。这种抑制与细胞基因表达和表观遗传谱的多种变化相关，包括特定的HIF靶标、组蛋白甲基化增加和DNA去甲基化减少。a uoqzu 一6eluaodUo 三 qzu 一6eu28d。堂DEG (uM)uo,q-qu- B62U6。Bdd uo-=qzu 一BsussdHIF-PH (ce(l*based assay)HIFPHH3 methylation9 H3K27me3CHuoud ,soaCeo-s*cEHNO- SSQX U 亘 oaZeolsox 020x Z6XCH EauJneHDEG - - H3K27me31 15H3 15eHuosssd
11、coJd、60一Uo5qxu 一 6BCa QJaduoqw 86sua2d图2戊二酸是KG依赖性反应的抑制剂PDH的戊二酰化破坏脂酰化戊二酰化是最近发现的一种翻译后修饰（PTM）,它使用戊二酸的CoA形式（戊二酰CoA）作为底物。该反应能够以酶促和非酶促反应的方式发生，而脱戊二酰化被认为是由SIRT5介导。最近，对小鼠肝脏和大脑的研究表明，戊二酰化可以修饰一系列蛋白质。鉴于前期预实验观察到CD8+T细胞中戊二酸水平的波动，研究者希望确定戊二酸化是否也发生在CD8+T细胞中。首先，研究者通过用泛赖氨酸戊二酰化（K-戊二酰化）抗体进行蛋白质印迹分析来确定这一点。研究者发现，蛋白质戊二酰化在CD8
12、T细胞中是清楚可检测的。在这些蛋白质印迹测定中，研究者观察到相对少量的蛋白质便具有戊二酰化的显著变化。该测定中一种值得注意的是约70kDa的蛋白质。该蛋白也是T细胞受缺氧和暴露于DEG影响最大的部分。研究者用K-戊二酰化抗体进行了免疫沉淀（IP）测定。三种非细胞骨架/组蛋白被阳性鉴定：（1）2-酮戊二酸脱氢酶（OGDH）（2）二氢硫辛酰赖氨酸残基乙酰转移酶（DLAT）（也称为PDHc的E2亚基（PDHE2）（3）PDHE1组分亚基（PDHEIB）。随后，通过反向IP确认戊二酰化靶标，其中使用靶抗体进行IP,然后用K-戊二酰化抗体探测所得到的蛋白质印迹。在研究者的测定中，仅PDHE2亚基可被检测
13、且明确地戊二酰化。IP和随后用K-戊二酰化抗体进行的蛋白质印迹分析显示，在该系统中OGDH未被可检测地戊二酰化。因此，通过质谱鉴定和反向IP确认，PDHE2亚基（67kDa）是唯一的戊二酰化靶标。PDHc催化丙酮酸转化为乙酰辅酶A,从而连接糖酵解和三竣酸（TCA）循环。PDHc由三种催化酶的多个拷贝组成：PDH（日）二氢硫辛酰胺乙酰转移酶（PDHE2）而二氢硫辛酰胺脱氢酶（DLD）（E3）。E2亚基是PDHc的功能核心，并通过其硫辛酰基结构域的循环还原和氧化提供催化活性，在PDHc中的各个酶的活性位点之间引导底物。多结构域E2亚基由C-末端催化结构域、外周亚基结合结构域和1-3个硫辛酰基结构域
14、的N-末端组成。硫辛酰结构域内含有一个与赖氨酸残基共价连接的硫辛酸，该硫辛酸对于PDHC催化活性是必需的。研究者用DEG处理人CD8T细胞，观察到PDHE2硫辛酸水平降低。从HeLa细胞免疫沉淀的PDHE2蛋白质组学分析结果来看，DEG处理降低了硫辛酰K259的水平，同时增加了戊二酰-硫辛酰K259o除了在K259上观察到的戊二酰化位点外，蛋白质组学还发现另外两个PDHE2赖氨酸残基连接有戊二酰基团，即K396和K482这些数据说明戊二酰化发生在CD8+T细胞中。这种戊二酰化状态在活化后发生改变，并将PDHE2鉴定为戊二酰化靶标,同时提供戊二酰化破坏正常PDHc脂酰化的证据，从而能够改变复合物
15、的催化活性。图3PDH的戊二酰化破坏脂酰化戊二酸调节代谢状态如上所述，PDHC将糖酵解与TCA循环联系起来。因此，研究者假设戊二酰化可能会降低PDHc的酶活性，从而增加糖酵解速率。为了测试这一点，研究者对CD8T细胞裂解物进行了PDHc的直接酶活性测定，发现急性（30分钟）和慢性（7天）暴露于DEG均导致PDHc活性降低。在具有部分沉默的GCDH的CD8+T细胞中也观察到降低的PDHc活性，并因此增加内源性戊二酸水平。正如预期的那样，PDHc活性的这种降低导致基础细胞外酸化速率（ECAR）的增加，因为丙酮酸被乳酸脱氢酶代谢形成乳酸。为了进一步探索所观察到的戊二酸诱导的PDHC活性降低的代谢后果
16、，研究者进行了糖酵解应激试验（GST）。通过用DEG处理CD8+T细胞30分钟同时在SeahorseXF分析仪中铺板来测定急性效应。通过使用DEG培养7天的CD8T细胞进行标准GST来确定慢性效应。急性和慢性暴露于DEG均导致糖酵解速率增加。研究者接下来试图确定戊二酸诱导的HIF活性对研究者观察到的代谢变化的相对贡献：PDHC活性降低和糖酵解增加。丙酮酸脱氢酶激酶（PDHK）对PDHc的磷酸化是已知的PDHc的活性调节剂，尽管DEG处理CD8T细胞增加了PDHKl的mRNA水平，但在DEG处理后PDHK1蛋白水平没有显著改变。更重要的是，研究者在DEG处理后没有观察到PDHc磷酸化水平的任何变
17、化。葡萄糖转运蛋白GLUT1也是一个HIF调控的基因，因此研究者也测定了用DEG处理的细胞中葡萄糖摄取的速率。同样地，研究者没有观察到变化,这与没有HlF诱导的功能效应一致。戊二酸是HIF-P4H-1的竞争性抑制剂，可能需要比在研究者的实验条件下发现的更长或更高的戊二酸暴露来引发功能性HIF应答。综上所述，这些数据表明，在DEG处理的细胞中糖酵解速率改变的关键因素是PDHE2的戊二酰化，并且正是PDHE2的这种PTM负责PDHc活性的改变以及ECAR和糖酵解速率的增加。尽管PDHc活性降低，但乙酰辅酶A水平在用DEG体外处理后并不降低，表明来自替代途径的潜在补偿。此外，以细胞基础耗氧率（OCR
18、）为特征的线粒体呼吸在DEG暴露后维持或增加。戊二酸以其辅酶A形式，戊二酰辅酶A,可在进一步代谢为乙酰辅酶A之前形成巴豆酰辅酶A;在标准的线粒体应激试验（MST）中，加入线粒体解偶联剂，对DEG急性处理的细胞的OCR没有影响,而在测定前用DEG处理7天的细胞具有降低的最大OCR。结果表明虽然戊二酸盐可以维持OCR,但在促进线粒体氧化方面不如葡萄糖有效。为了更好地理解戊二酸作为线粒体氧化的燃料，研究者测量了细胞耗氧量，同时以不同的组合抑制脂肪酸、葡萄糖和谷氨酰胺氧化。研究者发现，虽然DEG处理的细胞并不依赖于这些途径中的任何一种，但当其他燃料来源受限时，经处理的细胞确实具有增加的氧化脂肪酸和葡萄
19、糖的能力。此外，这些细胞具有增加的脂肪酸合成酶（FABN）、脂肪酸结合蛋白（FABP）和肉毒碱棕桐酰转移酶IA（CPTlA）基因表达水平，表明由戊二酸分解形成的乙酰辅酶A可用于通过脂肪酸合成产生脂肪，并且当其他营养素耗尽时可使用这些脂肪。总而言之，这些数据说明戊二酸水平可以调节CD8+T细胞代谢。Basal ECARPOHcactivityAcute0.0361C-5w ssMU13 XadOlA J-*WJ aoe ?*00.58 - Hi-r2CoA40D - T 号uw H8wooofTJiJITGlucose Glucose Glutamine - Glutamine - DEG9 3
20、- HooGlutarateGlucoseIGlutdmine图4戊二酸通过抑制PDH调节线粒体功能戊二酸治疗可减少肿瘤生长CD8+T细胞的代谢是其效应子功能的关键方面。鉴于研究者的观察，除了最近观察到PDHC抑制可以增力口CD8+T细胞的细胞毒性和增加免疫效力，以及正在进行的使用PDHc抑制剂治疗几种癌症的临床试验之外，尚无肿瘤免疫治疗中的应用。为了测试DEG在肿瘤免疫治疗模型中的作用。研究者在含DEG的培养基中培养7天后,在源自人类供体CD8+T细胞的人类CART细胞系统和使用转基因0T1CD8T细胞的小鼠系统中测定抗原特异性细胞毒性。用DEG培养7天后，小鼠OTlCD8T细胞更偏向于杀死
21、表达卵清蛋白(OVA)的B16F10-OVA癌细胞，而DEG处理的人CD19+CART细胞分泌更多干扰素Y(IFNY)并对CD19+Raji细胞的细胞毒性增加。DEG处理不影响人类CD19+的生长CART细胞或鼠0T1T细胞或在肿瘤细胞本身中引起任何毒性。为了确定CD8+T细胞中内源性戊二酸水平的增加是否也会增加CD8+T细胞的细胞毒功效,研究者创建了一个包含嵌入m很NA的靶向GCDH的人HER2CART系统(HER2CART.shGCDH)o带有非靶向对照(NTC)的HER2CART细胞(HER2CART.shNTC)用作对照。与对照HER2CART.shNTC细胞相比，表达HER2CART
22、.shGCDH的CD8+T细胞针对靶HER2+SK0V3卵巢癌细胞的细胞毒性显着增加。接下来，进行了体内肿瘤生长实验,其中用HER2CART.shGCDH细胞治疗患有HER2+SK0V3肿瘤的小鼠。与用HER2CART.shNTC细胞治疗的小鼠相比，用HER2CART_shGCDH细胞治疗的小鼠中11只小鼠中有6只的肿瘤生长率降低。接下来，研究者试图确定直接给予荷瘤小鼠DEG是否会导致肿瘤生长减慢。DEG无毒并且已被欧盟批准用作食品添加剂。为了确定它是否可以用于治疗，研究者进行了一项实验，其中患有B16F10-OVA黑色素瘤的小鼠每48-72小时腹腔注射DEGo这种治疗方案显着减缓了肿瘤生长，
23、并显着提高了DEG治疗小鼠的存活率。这些数据表明,戊二酸可以增强CD8T细胞的细胞毒性，并且用酯化形式的戊二酸对荷瘤小鼠进行体内治疗可以减少肿瘤生长并增加动物存活率，表明了这种免疫代谢物作为潜在癌症治疗的用途。 CO8* T ceU isolat* from OTI 9peen C08, T coll activation with siinfkl pepk DEG treatmentRetreatCoculturOT1 CD8, T cells with Blend OVA ceils fx 16 hRetreot RetreatAhmar Blue assay for UVe CeUSOT
24、ITceils o.mb AhokmaooeEuJdCDI9 CARTceIls CD8 T cell isobon from PBMCs CD8,Tcell actZWon with antiCD3CD28 beads DEGtreetrnCntRetreatRetreat RetreatCoculture C08*T CAR T cells with C019* Raji cdtoTransduction with CD19 CARTcelteFACS (live Raji u(s) ElISA (IFW secretion)C*5xou8ew82d400 -1 0 0007EFIA pr
25、omoter Trinsduction marker HER2scFvuBM Q miRNA embedded GCDH shRNA 为 Lentiviral vectorsDay O CD8 TceU activation Day 1 - Leotiviral transduction Day 7 T cell assays*o7o-oofusbclL2-0 Inject HR2 IL-2 CAR T cellsMonitor tumourgrowthHER2 CAR.shNTC HR2 CAR.shGCDHTne (CMys)QEE OOo- -IJnsi.S0unooSQ8 O-u .2
26、0TumourDMSO/DEGIP(every2-3days)monitortumourgrowth图5戊二酸盐减少肿瘤生长并增加CD8T细胞数量和肿瘤浸润思考与小结本研究发现戊二酸通过抑制a-酮戊二酸依赖性双加氧酶（KGDD）和丙酮酸脱氢酶E2亚基的戊二酰化直接调节T细胞代谢来发挥作用。戊二酸二乙酯（戊二酸的细胞渗透形式）的给药改变了CD8+T细胞分化，并增加了对靶细胞的细胞毒性。该化合物的体内外给药与肿瘤内细胞毒性CD8T细胞水平的增加相关。这些结果表明，戊二酸是T细胞代谢和分化的重要调节剂，在改善T细胞免疫治疗中具有潜在作用。止匕外，由于戊二酸分解和脂肪酸氧化的补偿，其戊二酰化并不具有减
27、少乙酰辅酶A池作用，这对细胞维持氧化磷酸化至关重要。基于CD8T细胞的代谢调控是当前的研究热点，有望成为肿瘤和慢性病毒感染疾病的潜在治疗靶点。一方面，细胞代谢是CD8T细胞分化和功能的强大驱动力。另一方面，越来越多的证据也表明CD8+T细胞同样可以影响宿主的代谢和行为。这些新研究的创新点还在于CD8T细胞具有显著的代谢可塑性，可用于激活、分化和组织驻留。无论是在稳态还是疾病状态下，CD8+T细胞均可适应局部微环境以满足特定的能量需求。在肿瘤和慢性病毒感染中发生的代谢紊乱便证明了CD8+T细胞功能衰竭和外在代谢之间的关系。然而，免疫疗法无法对肿瘤患者长期有效仍然亟待解决。相信随着单细胞分析技术的不断进步，基因组组学和细胞疗法的飞速发展，会有更多的肿瘤患者能从免疫疗法中获得益处，重获希望。参考文献：MinogueE,CunhaPP,WadsworthBJ,etal.GlutarateregulatesTcellmetabolismandanti-tumourimmunity.NatMetab.2023Oct;5(10):1747-1764.doi:10.1038s42255-023-00855-2.Epub2023Aug21.
