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1、最新新生儿先天性梅毒的实验室诊断与临床应用梅毒(SyPhiliS)是由梅毒螺旋体(treponemapaIIidum,TP)引起的一种性传播疾病，可通过孕妇胎盘进入胎儿血液循环引起流产、死胎或新生儿全身性感染,即先天性梅毒(COngenitalSyPhiIis),又称胎传梅毒。目前,世界上超过100万的婴儿出生即患胎传梅毒1,全球由梅毒致死的胎儿和新生儿保守估计超过50万2。在我国，据中国预防与控制梅毒规划(20102020年)的统计数据显示，1997年报告先天性梅毒109例，报告发病率为05310万活产数；2009年报告病例数为10757例，报告发病率为64.41/10万活产数，发病率年均增
2、长49.2%3其危害性大，已经成为世界各国严重的公共卫生问题。先天性梅毒的诊断缺乏金标准，目前国内外多参考2006年美国疾病控制中心(CenterSforDiseaseControlandPrevention,CDC)公布的梅毒治疗方案4中的这段标准：母亲为梅毒患者；有先天性梅毒的临床症状和体征；从病变部位、胎盘或脐带找到TP或体液抗TP-IgM抗体阳性；婴儿RPR滴度较母血增高至少4倍。先天性梅毒按临床表现主要分3类：胎死宫内型：潜伏期梅毒孕妇宫内感染致流产、死胎，胎儿呈浸软状态，全身各脏器有大量TP,此型罕见；早期胎传梅毒型：出生时或出生4周内出现肝脾肿大、皮疹、黄疸、贫血等症状，此类患儿
3、死亡率高；晚期胎传梅毒型：出生时或新生儿期无症状和体征，在生后数月至数年出现症状。随着产前常规梅毒血清学筛查的推广，在采取相应的治疗干预后，新生儿先天性梅毒正在更多地以此种无症状形式存在。为此，人们致力于开发早期、敏感、特异的先天性梅毒实验室诊断方法，各种新技术和新方法不断出现，一批极有前途的实验室方法已被运用到先天性梅毒的诊断中。一、TP病原体检测通过对患儿病损处的分泌物直接进行观察，如能观察到TP特征性的膨态和运动方式，可直接诊断先天性梅毒阳性，是最准确、特异的诊断方法，但灵敏度较低。1 .暗视野显微镜法：用暗视野显微镜可直接观察到病灶分泌物中的TP,具有快速、简便和可靠的诊断价值，是常用
4、诊断方法，但由于要求严格的技术和敏感度较低而限制其应用。2 .活体组织检查法：常用银染色法或荧光抗体染色，用病灶组织中的分泌物进行涂片染色，于普通显微镜或荧光显微镜下可观察到，呈黑褐色。银染色的阳性结果需要谨慎解释，因为类似TP的其他物质易混淆。3 .多功能显微诊断仪：一种综合相差对比、暗视野及偏振光的可变投影显微镜，待检标本不需染色及任何加工处理，直接进行观察，具有直接、方便、快速的优点，但整套仪器价格昂贵，难以普及。4 .兔睾丸感染试验：TP不能在体外培养，只能在活体内繁殖，这种方法利用家兔对TP的易感性，将TP注入兔睾丸内，采用暗视野显微镜观察或荧光显微镜观察有无感染迹象，敏感度和特异度
5、都高，被认为是诊断梅毒的金标准5。其不足之处是不同的动物个体对接种的敏感性不一样，而且费用高、检测时间长，目前仅用于保存菌种、传代及科学研究6。二、TP抗体检测1 .传统血清学试验：人体感染TP后，一方面对感染损伤的局部组织及TP表面释放的心磷脂类物质发生免疫应答，产生非特异性抗心磷脂类抗体(反应素)；另一方面宿主对TP的外膜脂蛋白、外膜鞘蛋白等抗原发生免疫应答，产生特异性抗体。目前，基于检测这两类抗体而设计的血清学方法是诊断先天性梅毒的主要手段。初筛试验：初筛试验为TP非特异性抗体血清学试验，检测血清中的抗心磷脂抗体，主要检测方法有性病研究实验室玻片试验(Venerealdiseaseres
6、earchIaboratorytest,VDRL)、不加热血清反应素试验(UnheatedSerUmreagintest,USR)、甲苯胺红不加热血清反应素试验(toluidineredunheatedserumtest,TRUST)和快速血浆反应素环状卡片试验(rapidpIasmareagincirclecardtest,RPR)等7。对于TP阳性的新生儿初筛试验可用于滴度分析、疗效观察以及进行母婴滴度比较。CDC规定新生儿出生时的抗心磷脂抗体的滴度大于或等于母亲滴度的4倍时可以诊断为先天性梅毒，但在先天性梅毒确诊患儿中非TP特异性血清学试验滴度大于或等于其母亲滴度的4倍者不到30%8。并
7、且很多疾病如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病、活动性肺结核等甚至正常人都能产生抗心磷脂抗体，导致TRUST出现假阳性结果；先天性梅毒患儿常因其他疾病使用青霉素或头把类抗生素，使TRUST滴度下降甚至转阴，出现假阴性结果。确认试验：TP进入机体后，机体首先出现的体液免疫应答是产生IgM抗体，然后是IgG抗体。确认试验为TP特异性抗体血清学试验，检测血清中的抗TP特异性抗体，以IgG为主。主要包括荧光密螺旋体抗体吸收试验(FIUOreSCenttreponemaIantibodyabsorptiontest,FTA-ABS)、梅毒螺旋体血细胞凝集试验(TrePOnemapaIIidu
8、mhaemaggIutinationassay,TPHA)、梅毒螺旋体明胶凝集试验(TrePOnemapaIIidumparticIeagglutinationtest,TPPA)等7。确认试验的不足在于，梅毒孕妇体内的TP-IgG可穿透胎盘滋养层进入胎儿血液循环，在15%未感染的婴儿体内存留12-15个月9,以上方法不能将母亲的转移性抗体与婴儿自身感染产生的抗体区别开来。近年来梅毒合并HIV感染的患者增多，其血清学试验常呈阴性反应10。TPPA等方法主要是检测血清中TP-IgG,通常需要感染TP后34周(新生儿412周)才能检出，不利于早期诊断。2 .TP-IgM检测:基于传统血清学检查在先
9、天性梅毒诊断中的局限性，TP-IgM检测的价值日益凸显。IgM相对分子质量900000,一般不能通过胎盘等生理屏障组织，当胎儿在宫内受到梅毒感染，12周后即可在新生儿血清中出现特异性IgM抗体，因此，理论上对于初筛试验和主要检测IgG抗体的确认试验均阴性的患儿，检测其TP-IgM水平成为诊断先天性梅毒的可靠且最可行的血清学诊断方法。(1)FTA-ABS19S-IgM:采用亲和层析分离柱和免疫吸附分离技术，利用抗人IgM或IgG与患儿血清中的IgM或IgG抗体发生特异性抗原抗体反应，使二者分离以去除IgGo该方法在先天性梅毒的诊断中其敏感度为72%77%,特异度为100%5,11。类风湿因子(R
10、heUmatOidFactor,RF)中的IgM成分可引起该试验的假阳性。此方法尚存在操作复杂、费时、需配置荧光显微镜、结果判读受主观影响等缺点。(2)TP-IgM-ELA(TreponemapaIIidumIgMEnzymeImmunoassay):随着TP全基因序列的解析，通过重组TP-DNA的克隆以及在大肠杆菌中的表达，制备出多种重组TP抗原。1998年YOUng等12合成了TPNI5、TpNI7和TpN47,并设计了自动化程度很高的ICESyphiIis(immune-captureELA)试剂盒，将多种重组TP抗原及抗人lgG和(或)IgM抗体包被于微孔板上，并用过氧化物酶标记的合成
11、抗原(TPNI5、TpN17TpN47)检测被捕捉的抗TP抗体，其敏感度和特异度均优于传统的VDRL和TPHA血清学诊断方法。ElA试验简便、判读客观、既可肉眼判读也可采用酶标仪读取结果，其自动化减少人为主观因素的干扰，对大样本的测定尤为适用。但是，ElA在先天性梅毒诊断中的应用价值尚有待进一步研究。(3)TPIgMWB(TreponemapaIIidumIgMWesternbIot)蛋白印记杂交:WB是根据抗原抗体的特异性结合来检测复杂样品中某种蛋白的免疫生化技术。试验中，血清中TP抗体与固相分离的天然或重组抗原结合后，通过与酶标记的IgG/IgM二抗结合以及酶标二抗与底物的显色反应而显示抗
12、原特异性条带，特异性条带的数目和深浅作为判断先天性梅毒的检测结果。由于它具有高分辨力和固相免疫测定的高特异度和敏感度，在先天性梅毒的诊断中得到很好的应用。在梅毒感染过程中，WB法(天然抗原)可检测到TP的特异性蛋白抗原抗体92000、47000、45000、17000、15500、37000等；其中47000、45000、17000、15500蛋白为TP外膜的脂蛋白，在TP感染过程中产生特异性抗体，为TP所特有，存在于梅毒的整个病程中，包括晚期梅毒及潜伏梅毒，有较强的免疫原性，尤其对于伴有HIV感染的梅毒患者在抗TP抗体的含量低于一般梅毒患者的情况下亦能检测到抗47000抗体。因此，这几种抗原
13、可作为梅毒感染的特异性诊断指标Amin等认为，如果出现15000、17000、47000的条带中的任何2条可诊断为梅毒阳性13。Herremans等认为，如果出现15000、17000、47000的条带中的任何2条可诊断为先天性梅毒11oRaWStrOn等认为47000、17000、15500带中出现任意1条即诊断为先天性梅毒，47000及其他2条带中任何1条出现阳性即可诊断母亲梅毒感染14。该技术应用于先天性梅毒诊断中其敏感度为82%100%,特异度为100%11,14o目前，采用基因工程重组技术人工合成TP蛋白抗原，用于商业化试剂盒生产，开发出各种组合抗原试剂盒，具有低成本、高纯度、高灵敏
14、度等优点，进一步提高了检测的敏感度和特异度。目前常用的试剂盒采用TP47、TP45、TPI7、TP15四个特异性抗原联合，显示出敏感特异的血清学诊断价值。罗权等15采用此方法对21例梅毒孕妇所产21例新生儿进行检测，结果显示，21例新生儿有12例确定为先天性梅毒，而采用常规综合诊断方法仅检出10例，提示WB方法具有较高的特异度和敏感度。国内外当前应用WB检测先天性梅毒有两个明显的优点：能更好排除FTA-ABS-19S-gM方法易受到RF的非特异性结合而导致IgM抗体假阳性；其他的IgM检测法需先分离IgM和IgG抗体，防止IgG与IgM抗体竞争特异性抗原结合位点，导致IgM抗体假阴性，WB法则
15、不受IgG抗体存在的影响。操作更加简便，结果较易判断。三、TP-DNA检测Hay等16最早建立了用PCR检测脑脊液中TP的方法，Burstain等17首先将这一技术应用于先天性梅毒诊断中，发现其敏感度及特异度均优于血清学方法。Young等18的研究证实，PCR可检出0.0IPg的纯化抗原，只要各种临床组织或体液中存在1条TP即可检出。Grimprel等19和Sanchez等20证明PCR检测新生儿血清和脑脊液的结果，与兔睾丸感染试验有高度相关性，而且对先天性梅毒的诊断可以有74%的敏感度和96%的特异度。尽管如此，标本污染、血清中可能存在PCR抑制因子、PCR引物存在局限性等因素常会影响TP的
16、PCR检测敏感度及特异度。实时荧光定量PCR(reaItimeFIuorescentQuantitativePCR,FQ-PCR)技术是在定性PCR技术的基础上发展起来的核酸定量技术，1996年由美国APPliedbioSyStemS公司推出。它利用基因扩增的敏感性，分子杂交的特异性和光化学的精确性，把PCR、分子杂交和光化学融为一体，使PCR扩增和产物分析的全过程均在单管封闭条件下进行，并通过微机控制，从而防止扩增产物的污染，实现对扩增产物进行实时动态检测和自动分析结果,具有定量范围宽、定量准确等优点，在先天性梅毒的早期诊断中得到应用。可用于检测先天性梅毒患儿体内TP的临床样本多种多样，如血
17、清、全血、脑脊液、羊水、胎盘组织、各种皮损组织和气管内分泌物等21,22。国内彭石潜等23将FQ-PCR技术应用于胎盘组织诊断早期先天性梅毒，结果显示，在诊断先天性梅毒新生儿时，FO-PCR至少有不低于综合常规诊断方法的价值，而优于临床症状、母/婴RPR滴度之比和FTA-ABS-19S-IgM三种常规诊断方法中的任何一种，对于提高先天性梅毒的检出率，减少漏诊的发生有积极的意义。FQ-PCR技术用于检测先天性梅毒具有简便快捷、特异度和敏感度高、定量准确等优点，此外，还具有如下优势：TP感染早期，由于感染者体内尚未形成抗TP抗体或仅有少量抗体，采用检测血清抗体的试验方法往往呈阴性反应，而这时PCR
18、技术能够检出临床标本TP-DNA,提示低载量感染；TP患者合并HIV感染时，血清学试验常呈阴性，此时用PCR方法检测脑脊液中是否存在TP是证实其感染的惟一方法24。目前，国内外有关FQ-PCR技术在先天性梅毒诊断中的应用相关报道还较少，存在研究样本量少，研究周期短等不足，此方法是否有望成为先天性梅毒诊断的一种常规确诊方法还有待更长的研究周期、更大的样本量来证实。综上所述，对于出生时通过常规诊断无法确诊的新生儿，采用TP-IgM-WB方法和FQ-PCR技术相结合,对于提高先天性梅毒的检出率，减少漏诊、指导临床治疗具有积极的意义。总之，先天性梅毒的实验室诊断方法众多，其临床应用评价众多，实验室应充分掌握各类方法的性能特征，结合实验室自身条件，选用合适的检测方法，为先天性梅毒的早期诊断提供可靠依据。
