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1、病 理 检 验 技 术,（1）取材（2）固定（3）脱水（4）包埋（5）切片（6）染色（7）封固 在这七个主要过程中，又包括着若干步骤,制作切片的主要过程,取 材,应选择病变或可疑病变的组织。必要时选取病变与正常组织交界处。切取标本的原则是求准而不是求量多，所以切取组织宜小不宜大，以不超过24x24mm2为佳，厚度以35mm为度，过大过厚会影响对标本的固定，另方面也影响切片的制作。,冰冻切片 石蜡切片 火棉胶切片 取 材固 定 冰 冻 冲 水 脱 水 透 明 乙醚酒精 浸 蜡 胶液渗透 石蜡包埋 火棉胶包埋 冰冻切片 切 片 切 片 染 色 染 色 染 色 封 固 封 固 封 固,固 定,固定是
2、指将各种组织浸入防腐剂内，使细胞内的物质为不溶性。固定的作用即是用一种方法将组织尽可能保持在它原来的形态，且能适于某些研究程序。,固定的目的是为了防止组织细胞自溶与腐败，防止了细胞内的酶对蛋白质的分解作用，使细胞内的各和成分如蛋白质、脂肪、碳水化合物或酶类转变为不溶性物质，以保持原有的结构与生活时相仿。另外，组织固定后，均呈一定的硬化状态，增加组织韧性，而且不易变形，有利于以后的组织处理。,固定剂,常用单一固定试剂有甲醛，洒精，冰醋酸，苦味酸，重铬酸钾，饿酸，氧化汞，丙酮等。除福尔马林，酒精和丙酮常用作单一固定剂外，其它多作混合液中的一种成分。,脱水就是利用脱水剂将组织内的水分置换出来，以利于
3、有机溶剂的渗入，这一过程称为脱水。,脱水,一般情况下，组织经过70，80，90，95，以至无水酒精的脱水程序，即可达到脱水的要求。但是为了能使大量的组织块同时进行脱水，则要求保持液体的浓度以保证脱水的作用，最好是以两次95酒精，两次100酒精重复进行脱水，以保证组织的水分脱净。,在以酒精作为脱水剂时，应该先从浓度较低的酒精开始，然后递增其浓度，这样可以避免组织过度收缩。第一瓶酒精浓度随固定剂，脱水组织的大小和种类而异，经水溶性固定剂固定的细柔组织需要慢慢脱水，从50酒精开始。如眼球，组胚组织等大多数组织标本则是从70酒精开始，再经80，95以至无水酒精。,一般1cmX1cmX0.2cm大小的组
4、织,脱水全过程仅需要数小时即可达到完全脱水。在各级浓度酒精内处理的最短时间分别减少到24小时也能获得满意的结果。如果组织脱水不尽,随后的透明,浸蜡都会受到影响,致使切片很难以完成。,可用作固定液,也是一种比较好的脱水剂。脱水能力强、速度快,可配制不同浓度进行脱水。但一般情况下,多用在无水酒精的补充脱水。丙酮脱水时间比酒精强,但容易使组织过度硬化,所以应适当掌握脱水时间。,丙酮(Acetone),1取材：骨组织固定于10%福尔马林24小时后再锯取厚度约0.5厘米骨片。2固定：再以10%福尔马林固定2天。3将组织置于脱钙剂中，每日更换新鲜液、直至组织软化为止。4流水冲洗24小时（除酸）。5进行常规
5、脱水，透明，浸蜡，切片。,脱钙步骤,配方：硝酸（用0.1尿素稳定）510ml 蒸馏水 加至 100ml此液用作常规脱钙剂，作用迅速，对组织不膨胀，对细胞的保存和染色比前者更好，能适用多种染色技术，但每日需要更换新鲜溶液，最好早晚各一次，一般13天完成。横切人肋骨（5mm）在1224小时内脱钙。,硝酸水溶液,透明,二甲苯：是最为常用的一种透明剂，它能与酒精，丙酮相混合，又是石蜡的溶剂。在透明过程中，组织继续发生硬化，由于二甲苯对组织的收缩性强，作用迅速，因此，组织在二甲苯中时间不宜过长，否则组织容易变脆变硬，一般是达到组织的透明为度，小块组织在半至一小时内透明。,浸蜡,组织经媒剂的透明作用之后，
6、移入熔化的石蜡内浸渍，石蜡逐渐浸入组织间隙，取代透明剂，这一程序就叫浸蜡。根据所用石蜡的熔点，浸蜡需要能够保持于5460.C温箱内进行。,为了尽可能排除透明剂，浸蜡可以分两级或三级进行。以熔点较低的软石蜡作为第一步，然后再换为熔点较高的石蜡作为第二步，第三步。浸蜡时间14小时，或更长，并使之过夜则较易切割,包埋,包埋，就是将已经经过固定，脱水，透明，浸蜡的组织块从最后的蜡浴取出置入充满熔融石蜡的包埋框内，包埋成块，使组织和包埋剂相熔一体并迅速冷却，这个程序称为包埋。包埋剂凝固后，进一步加强了组织的硬度和韧度而便于进行切片。,1.组织取材2毫米厚度，固定于福尔马林数小时后再换以新鲜福尔马林固定数
7、小时。2.组织流水冲洗612小时。3.70酒精24小时。4.85酒精24小时。5.95酒精（）24小时。6.95酒精（）24小时。7.100酒精（）24小时。8.100酒精（）2小时。9.二甲苯（）0.51小时。10.二甲苯（）0.5小时。11.浸蜡（）2小时。12.浸蜡（）2小时。13.组织包埋。,石蜡包埋程序,快速切片诊断是在数十分中或半小时左右制成切片并作出诊断的一种手段，主要用于手术中决定手术的切除范围和手术方式。快速切片的方法包括冰冻切片和快速石蜡切片。,快速石蜡包埋法,制作快速石蜡切片时，切取组织应该薄小，从固定、脱水到浸蜡的全过程都要加温，一般是先将各种试剂在超声波快速石蜡脱水仪
8、中预热，恒温下操作，整个过程大约在1015分钟即可完成。,操作过程（1）先取病变组织于AAF中固定35分钟。（2）95酒精1分钟。（3）无水酒精1分钟（4）正丁醇1/3丙酮2/3混合液1分钟（5）二甲苯1分钟（6）浸蜡12分钟（7）包埋,将组织置于预先备置的蜡块中（固体石蜡包埋法）;预备一硬蜡块，用热镊子于蜡块中间熔蜡一小部分，在以热镊子从蜡杯内取出已与石蜡饱和之组织块投入融蜡中，冷固后，立即进行石蜡切片。石蜡切片附贴后，在火上稍加烘烤使组织切片上石蜡全部熔化，水分也被烘干，然后投入二甲苯，100酒精，95酒精各30秒脱蜡，入水冲洗，常规苏木素，伊红染色。,切片技术,切片的步骤：1、将蜡块固定
9、于切片机头上的夹座内，调整到稍离开切片能够切到的位置上，注意蜡块组织切面与切片刀口要垂直平行。2、再调整蜡块组织切面恰好与刀口接触，旋紧刀架，固定好机头。3、根据需要调整切片厚度。4、摇动切片机手轮先进行修整切片，直到切出完整的最大组织切面后，再进行切制。5、实践中可用右手转动切片机手轮，左手用毛笔托起蜡片，协调地进行切片操作。6、切下的切片带，一端用镊子轻轻拉起，应尽可能将切片带拉直展开，用毛笔将切片带从刀口向上挑起，拉下切片带，然后轻拖铺于恒温水面上。,将单张或数张切片，用镊子夹住蜡片的一边并提起，铺于恒温水中，（光亮的一面朝下）立即用毛笔轻轻拉展以切片无皱褶为最好。如有皱褶时用镊子细心地
10、逐个轻轻拨开，注意不可拨破组织。然后分开每张切片，选取其中最完整的，没有皱褶的切片。,贴 片,染 色,染色就是利用染料在组织切片上给与颜色，使其与组织或细胞内的某种成分发生作用，经过透明后通过光谱吸收和折射，使其各种微细结构能显现不同颜色，这样在显微镜下就可显示出组织细胞的各种成分。,在退行性染色中，附在组织细胞上多余的染色剂需用某些特定的溶液把目的物以外的部分脱去，从而使目的物与周围组织形成鲜明的对比，同时使目的物本身的色泽也深浅适当。这种选择性地除去多余染色剂的过程称为“分化”，所使用的溶液即是“分化剂”。,分 化,分化 十分重要。分化步骤的准确也是染色成败的关键，若分化失当则必然引起染色
11、不匀或过淡，过深等现象，因此分化后一定要镜检，观察胞核是否清晰，胞浆呈淡白色。否则需再次分化，不然一旦复染后，组织会呈紫蓝色即“蓝盖红”现象。还原液 不宜过浓，若碱性太强易使组织脱落故以淡为宜。,苏木素染色时间要根据染料的新旧、温度、切片的类型而定，一般为515分钟。经水略洗后，用盐酸酒精分化，分化程度必须用显微镜控制。分化水洗后，可用温水或自来水蓝化，并充分水洗（流水冲洗5分钟以上），以防盐酸残留导致切片褪色。我们不提倡使用碱性溶液（释氨水、肥皂水等）促蓝，尽管蓝化效果很好，但从实践的结果来看，用碱性溶液促蓝的切片不能长期保存，容易褪色。最后入伊红复染（520秒）。,苏木素-伊红染色,在组织
12、病理学中，是一种日常使用最为广泛的常规染色方法。一张优质的染色切片，可以清晰地观察到各种不同的组织结构以此作为病理诊断的确切依据。再根据此染色切片所见，分别进行不同的特殊染色。,掌握好盐酸酒精的分化：这是一个重要环节。分化时间的长短视组织的性质，切片的厚薄，苏木素染色的深浅来决定，一般是12秒，若切片不分化或分化不足，组织着色过深使核浆的景界不清楚；若分化过度，胞核过淡不清晰。用Mayers苏木素染色，通常都不分化。盐酸酒精分化后，切片留有酸液，易使切片褪色。另一方面苏木素经流水冲洗来促兰。流水冲洗一般需1530分钟。如要说短时间，可用碱性的促蓝液代替流水冲洗。,盐酸-酒精分化液的配制 浓盐酸
13、 1 ml 70%酒精 99ml促蓝液的配制（1）Scott促蓝液重碳酸钠 0.35g 硫酸镁 2g蒸馏水 100ml 麝香草酚少量（2）氢氧化氨水溶液浓氨水 0.11ml 蒸馏水 99ml（4）碳酸锂水溶液碳酸锂 1g 蒸馏水 100ml,Hansen氏苏木素液甲液：苏木素1g无水酒精10ml乙液：硫酸铝钾（钾明矾）20g蒸馏水200ml丙液：高锰酸钾1g蒸馏水16ml 先将甲液加热溶解，然后将乙液加热溶解，将甲、乙两液混合。再将丙液溶解后缓缓滴入，待全部混合后，再次煮沸一分钟，冷却后过滤，即可使用。,伊红染液配方：伊红Y（水溶）0.5lg 蒸馏水 99ml 若取用伊红Y（醇溶性）应溶于99
14、ml75或95的乙醇中。若在伊红液中加人0.5毫升冰醋酸，可加速其染色过程，并使胞浆的色泽更为艳丽。,苏木素、伊红染色，简称HE染色，是组织学技术的常规染色方法。恒定优质HE切片应该是红蓝相映，层次浓淡均为分明。,染色的基本步骤,脱蜡（1）二甲苯I 15分钟（2）二甲苯II（应完全透明）10分钟 逐级降浓度酒精水化（3）无水酒精I（变为不透明）12分钟（4）无水酒精II 12分钟（5）95%酒精 12分钟（6）80%酒精 12分钟（7）自来水洗 片刻,染色（8）蒸馏水 片刻（9）苏木素液染核 1015分钟（10）自来水洗 片刻（11）1%盐酸酒精分化 0.51分钟（12）流水冲洗 片刻至数小时
15、（13）碳酸锂饱和水溶液反蓝 1分钟（14）流水冲洗 15分钟至数小时（15）复染 05伊红水溶液（对比染色）25分钟,逐级升浓度酒精脱水（若为醇溶伊红可直接人90酒精）（16）自来水洗（分化伊红）片刻（17）95酒精I 12分钟（18）95%酒精 II I2分钟（I9）无水酒精 I 12分钟（20）无水酒精II l2分钟,透明（21）二甲苯I 510分钟（22）二甲苯II 510分钟 可作透明度试验：在黑色背景下以光线照于切片如果见有乳白色斑片系脱水不足，需再行脱水。,封固（23）盖玻片下封固 结果：胞核呈蓝色，胞浆呈红色，红细胞呈桔红色，其它成分呈深浅不同红色。,特殊染色技术,特殊染色法是
16、为了达到某些特殊的要求，或是为了观察特殊的组织结构，例如：观察间质的结构变化，需要作胶原纤维染色，弹力纤维染色或网状纤维染色。又如，要观察组织内某些物质的状况，例如糖，脂肪和粘液、纤维素等时，均需特殊显示的染色方法。特殊染色的方法繁多，显示不同的物质需要不同的方法，显示相同的物质也有不同的方法。,免疫组织化学技术,免疫组织化学技术是应用免疫学基本原理抗原抗体反应，对组织或细胞内抗原或抗体物质定性和定位的组织化学技术。免疫组织化学技术按照标记物的种类可分为免疫荧光法、免疫酶法，免疫铁蛋白法。免疫金法及放射免疫自影法等。用于病理诊断的主要有免疫荧光法和免疫酶法。,在科学研究中，每一项新技术的创立都
17、会带来一系列新的研究成果问世，从而推动着各学科的发展。纵观形态研究领域，50年代电子显微镜引入形态学观察领域，带来了从细胞水平到亚细胞水平的深入研究；60-70年代，免疫组织化学与免疫细胞化学技术的广泛应用，又将观察的水平由亚细胞结构推向了蛋白质分子水平，使细胞内众多的活性物质得以进行细胞或亚细胞水平的定位，对医学生物学的发展无疑产生了深刻的影响。,70年代，分子生物学技术在形态学中的广泛应用，随着原位杂交技术的出现，使组织细胞内特定的DNA或RNA序列能够被定位，将蛋白质水平又提高到基因水平即核酸分子的观察和定位，从而使人类对许多生命现象在基因水平上的认识得以深化；80年代，分子生物学领域中一项具有强大生命力的技术PCR多聚酶链反应技术问世了，很快地就被引入形态学观察的领域，使细胞内低拷贝或单拷贝的特定DNA或RNA得以进行定位及观察。,
