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1、叶绿体分离与荧光染色观察一 实验目的1通过植物细胞叶绿体的分离与纯化,了解细胞器分离与纯化的原理和方法.2熟悉荧光显微镜的使用方法,观察叶绿体的自发荧光和次生荧光.二 实验原理1叶绿体分离的原理 匀浆破碎细胞,利用差速离心方法分离等渗介质中的悬浮颗粒,收集类叶绿体大小的颗粒,得到叶绿体. 差速离心：颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度,也同离心力以与悬浮介质的粘度有关.在一给定的离心场中,同一时间内,密度和颗粒大小不同的颗粒其沉降速率不同. 依次增加离心力和离心时间,就能使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部,分批收集即可获得各种亚细胞组分. 叶绿体的分离
2、应在等渗溶液0.35mol/L的氯化钠或0.4mol/L的蔗糖溶液中进行,以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤.分离过程最好在0-5的条件下进行,如果在室温下,要迅速分离和观察.2差速离心特点：介质密度均一,速度由高到低,逐级离心； 用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器 ；沉降顺序：核-线粒体-溶酶体与过氧化物酶体-内质网与高尔基体-核蛋白体,可将细胞器初步分离,常需进一步通过密度梯度离心再行分离纯化.3荧光的概念 光致发光：某些物质在照射下,吸收光能进入激发态,当从激发态回到基态时,可以以电磁辐射的形式释放出吸收的光能,这种现象称为光致发光.紫外辐射、可见光与红外辐射均可引起光致发光,如磷光与荧
3、光. 荧光：在光致发光中,如果一定波长的短波光如紫外光照射某种物质,这种物质吸收光能后进入激发态,并且立即退激发在极短的时间内能发射出比照射光波更长的光如可见光,这种光就称为荧光.一旦停止入射光,发光现象也随之立即消失.荧光分为自发荧光或诱发荧光次生荧光、续发荧光、间接荧光.某些物质受激发光照射后可直接发出荧光,如叶绿素、血红素的火红色荧光或木质素的黄色荧光的等,称为自发荧光直接荧光某些物质本身不发荧光,但它经荧光染料染色后,再通过紫外线照射同样也能发出荧光,这样荧光称为诱发荧光,如叶绿体被咩啶橙染色后可发桔红色荧光.4荧光显微镜的操作与注意事项1接通电源,打开启动装置开关 ；2按starte
4、r按钮3-5秒以启动激发光源.注意starter键不能超过5秒.启动2-3分钟后方可稳定,启动15分钟内不得关闭电源,一旦关闭汞灯,3分钟内不得重启,用完后关闭main switch；3选择相对应的激发虑片、阻断虑片和双色镜. 放置样品,先在普通光镜下选择好要观察的视野；4关闭普通光源后,撤开UV挡板,即可观察到样品的萤光情况,需要照相时,要与时拍照,否则可能拍不到萤光照片；5观察结束后,关闭main switch,切断电源.三 实验材料1材料新鲜菠菜.2试剂10.35mol/L的NaCl等渗溶液； 20.01%吖啶橙acridine orange称取0.1g吖啶橙加蒸馏水100ml做母液,储
5、存于棕色瓶,置4冰箱保存.临用前取1mL母液加1/15mol/L磷酸缓冲液pH4.89mL.3 器材普通或高速离心机九阳豆浆机、荧光显微镜、研钵、滴管、漏斗、离心管,天平,量筒,纱布.四实验步骤1 选取新鲜嫩绿的菠菜叶,去叶梗与其粗脉,洗净擦干,称取30g放于150ml0.35M.的NaCl溶液中；2 将叶和液体同时装入组织捣碎机中豆浆机中,匀浆3-5min,转速5000r/min；3 将匀浆用纱布6层过滤于500ml烧杯中；4 将滤液4ml在1000r/min下离心2min；5 取上清液在3000r/min下离心5min沉淀为叶绿体和细胞核混合物；6 将沉淀用2-3ml0.35M.的NaCl
6、液悬浮；7 取一滴悬液滴片,加盖玻片后显微镜下观察；8 另外取一滴悬液滴片,再加一滴0.01%的吖啶橙染料混匀,盖上盖玻片,在荧光显微镜下观察.五实验结果1实验结果如下图所示：图中圆形或椭圆形绿色颗粒状物质即为普通观察染色条件下的叶绿体图1普通光镜下叶绿体形态1040图2荧光显微镜下叶绿体的自发荧光图31荧光显微镜下叶绿体的次生荧光图32荧光显微镜下叶绿体的次生荧光叶绿体在荧光显微镜下观察到的图样,图2为叶绿体的自发荧光,为火红色；图31、2为叶绿体的次生荧光,为橘红色.2 实验结果分析表 1叶绿体普通观察与荧光染色结果对比观察方式普通光学显微镜荧光显微镜染色后荧光观察观察结果普通光镜下,可看
7、到叶绿体为绿色橄榄形,在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒,即基粒.另外还有一些其他组织碎片叶绿体自发荧光为火红色,呈斑状分布,其他部分为黑色间接荧光为橘红色,占很少一部分,其他大部分为绿色结果分析普通光学显微镜下观察到叶绿体的正常结构.离心不纯导致混有其他组织碎片叶绿体经激发光波照射后,自发荧光呈现火红色,因叶绿体在其悬液中呈现点状均匀分布,且悬液其他组分无自发荧光反应,故观察到斑状分布的火红色荧光效果叶绿体次生荧光的来由,橘红色为叶绿体的荧光效果,叶绿体的悬液中混有的细胞核碎片中的核酸经丫啶橙染色荧光反应呈现绿色六思考与讨论1注意事项1要得到完整的、有活性的叶绿体,须在低温下迅速
8、提取,涂片后立即观察,注意离心时的时间与强度.2利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观察室,会收到许多因素的影响,如温度、光、淬灭剂等.因此在进行荧光观察时应抓紧时间,必要时应立即拍照.3在制作荧光显微标本时最好使用物荧光载玻片、无荧光盖玻片香柏油.2思考题1在荧光显微镜下观察叶绿体的自发荧光时,更换滤片系统,叶绿体的颜色是否有变化？有变化.因为叶绿体的颜色取决于发出荧光能量的高低,更换不同的滤片,激发光会不同,叶绿体得到和辐射的能量就会不同,颜色也就会不一样2游离的叶绿体和完整细胞内的叶绿体,在荧光显微镜下,颜色和荧光强度有无区别,为什么？有区别.因为完整细胞内的叶绿体还要进行光合作用,这会消
9、耗掉一部分所吸收的光,所以最后释放的荧光能量就会比游离核糖体所释放的小,颜色和荧光强度就会有差别.3根据观察到的实验现象,简述自发荧光和次生荧光的区别？自发荧光指不需染色,只需在激发光照射下即可发荧光的现象,而次生荧光需要染色.因为发光机制不同,所用的滤光片也会不同,最后发出的荧光颜色也会不同.4叶绿体分离的原理是什么？操作过程应注意什么？采用的方法是差速离心法,利用不同颗粒大小、形状不同导致沉降速率不同,把叶绿体大小的颗粒沉降出来.叶绿体的分离应在等渗溶液中进行,以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤；分离过程最好在04的条件下进行；如果在室温下,要迅速分离和观察.3实验小结通过本次实验,我们学习了植物细胞叶绿体的分离与纯化的原理和方法,并且学习了荧光显微镜的使用方法,观察了叶绿体的自发荧光和次生荧光.此外,通过实验课上理论知识的学习,对叶绿体荧光染色以与荧光等理论知识有了一定的了解,并观察了叶绿体在光学显微镜下以与荧光显微镜下自发荧光和次生荧光的结果,收获较大.4 / 4
