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1、DOI: 10. 12449/JCH240114肝纤维化及肝硬化植物雌激素鹰嘴豆芽素A(BCA)对肝纤维化去势小鼠模型的改善作用及机制谭超容a,李小飘a,冉俊艳a,熊英b,廖尚高a,张金娟b,何迅a贵州医科大学a.药学院，b.兽出医学院，c.慢性病诊疗转化工程研究中心，贵阳550025三f三情：Wt,2812878586(ORQD:0000-02-1867-069X);弓Wi,826609585(ORQD:0000-00002-9078-531X)摘要：目的探究植物雌激素鹰嘴豆芽素A(BCA)对CCL诱导的雌性双侧卵巢切除(去势)小鼠肝纤维化的影响及其机制。方法取50只去势雌性昆明小鼠，腹腔注
2、射Cd建立肝纤维化模型，将建模小鼠按体质量随机分成模型组、阳性对照组、BCA低、中、高剂量组各10只，同时选取10只同批雌性小鼠切除双侧卵巢旁少量脂肪组织作为假手术组。假手术组和模型组灌胃等体积的05%枝甲娶F维索瞬液，阳飒照组g二醇2mg/kg灌胃，BCA低中、高剂S组分另胺25、50、IoOmgkgBCA灌胃，1次/d,连续7周。给药结束后麻醉处死小鼠取材，测定肝|徽和子宫指数,HE及MaSSon染色观察肝组织病理改变,生化法检测AST、ALT活性，ELlSA法检测0干组织中IL6TNFC水平，WesternBIot法旋肝组织中I型胶原蛋白(CollagenI)、转化生长因子平1(TGF-
3、1)、8平滑肌肌动蛋白QSMA)、雌激素受体(ER).p-NF-Bp65NF-Bp65蛋白的日寸表达量。计量资料两组间比较采用成组f检验，多组间比较采用单因素方差分析；进一步两两比较采用LSD-检验o非正态分布的计量资料多组间比较及进一步两两比较均采用Kruskal-WallisH检验。结果与假手术组相比，模型组肝指数升高，子宫指数降低，血清AST和ALT活性、肝组织中IL-6、TNFv水平及COiIagenI、TGF生CXSMA、pNF-Bp65NF*Bp65蛋白表达均升高(P值均0.05).模型组肝组织明显纤维化病变,出现肝细胞水肿、脂肪样变、坏死并伴有炎细胞浸润，胶原纤维增生沉积、交错分
4、布。与模型组比较，BCA各剂量组肝指数隔氐,血清ALT和AST活性、肝组织IL-6、TNFc水平及COllagenI、TGF-区、-SMA.P-NF-KBP65NF-Bp65的蛋白表达均降低(户值均0.05),子宫指数无明显变化(P0.05),肝组织ER蛋白表达升高(P0.05),肝组织的纤维化病变有不同程度改善结论BCA可有效改善CCL诱导的雌性去势小鼠肝纤维化，其作用机制可能是通过上调ER抑制NF-KB信号通路，减轻炎症反应而实现的.关键词：肝纤维化；植物雌激素类；卵巢切除术；小鼠基金项目：贵州省高层次创新型人才百层次人才项目(黔科合平台人才20206011)Roleandmechanis
5、mofactionofphytoestrogenbiochaninAinimprovingliverfibrosisinOvariectomizedmiceTANChaOrOrd,LIXiaopiacf,RANJunyarf,XIONGYin,LIAOShanggacf,ZHANGJinjuarljc,HEXurf.(a.SchoolofPharmacy,b.SchoolofBasicMedicine,c.TransfomiationEngineeringResearchCenterofChronicDiseaseDiagnosisandTreatment,GuizhouMedicalUniv
6、ersity,Guiyang550025,China)Correspondingauthor:HEXun,2812878586qq.m(ORCID:0000-0002-1867-069X),ZHANGJinjuan,826609585(ORCID:0000-00002-9078-531X)Abstract:OtyectiveToinvestigatetheeffectofphytoestrogenbiochaninA(BCA)onliverfibrosisinducedbyCCI4infemalemicewithbilateralphorectomy(Ovariectomized)andits
7、mechanism.MethodsAtotalof50OvariectomizedKunmingmicewereselectedandgivenintraperitonealinjectionofCCI4toestablishamodelofliverfibrosis,andthenacrdingtobodyweight,theywererandomlydividedintomodelgroup,positivecontrolgroup,andlow-,middle-,andhigh-doseBCAgroups,with10miceineachgroup.Inaddition,10female
8、miceinthesameIftterweregivenresectionofasmallamountofadiposetissuenearbothovariestoestablishtheshamoperationgroup.Temiceinthepositivecontrolgroupweregivenestradiol2mg/kgbygavage,andthoseintelow-,middle-,andhighdoseBCAgroupsweregivenBCAbygavageatadoseof25,50,and100mg/kg,respectively,onceadayfor7ConSe
9、eUtiVeweeks;themiceintheShamoPerationgroupandthemodelgroupweregivenanequalvolumeof05%sodiumcarboxymethylcellulosesolutionbygavage.Temicewereanesthetizedandsacrificedafteradministrationtocollectsamples.Liverindexanduterusindexweremeasured;HEstainingandMassonstainingWereusedtoobserveliverhistopatholog
10、icalchanges;thebiochemicalanalysiswasusedtomeasuretheactivityofaspartateaminotransferase(AST)andalanineaminotransferase(ALT);ELISAwasusedtomeasurethelevelsofinterleukin-6(IL-6)andtumorneosisfactor-(TNF-)inlivertissue,andWesternblotwasusedtomeasuretherelativeproteinepressilevelsofcollagenI,transformi
11、nggrcwtfactor-beta1(TGF-1),alpha-smthmuscleactin(-SMA),estrogenreceptorbeta(ER),andp-NF-Bp65NF-Bp65inlivertissue.7eWestwasusedforcomparisonfcontinuousdatabetweentwogroups;aone-wayanalysisofvariouswasusedforcomparisonbetweenmultiplegroups,andtheleastsignificantdifferenceAtestwasusedforKirthercomparis
12、onbetweentwogroupsTheKnJSkalWallisHtestwasusedforcomparisofnon-nomallydistributedCOntinUOUSdatabetweenmultiplegroupsandfurthercomparisonbetweentwogroupsResultsComparedwithteShamopefatedgroup,themodelgrouphadasignificantineaseinliverindexandasignificantreductioninuterusindex,aswellassignificantincrea
13、sesintheactivitiesofserumASTandALT,televelsofl-6andTNF-inlivertissue,andtheproteinexpressionlevelsofcollagenI,TGF,-SMA,andp-NF-Bp65NF-Bp65inlivertissue(allP0.05),andthemodelgroupshowedsignificantfibrosislesionsintheliver,suchashepatocyteedema,steatosis,andnecrosiswithinflammatorycellinfitrationandhy
14、perplasia,deposition,andstaggereddistributionofcollagenfibers.ComparedVththemodelgroup,thelew-,middle-,andhigKdoseBCAgroupshadsignificantreductionsinliverindex,theactivitiesofsermASTandALT,thelevelsofIL-6andTNF-,andtheproteinexpressionlevelsofcollagenI,TGF-1,-SMA,andp-NF-Bp65NF-Bp65inlivertissue(all
15、?0.05),aswellasasignificantincreaseintheproteinexpressionlevelofERinlivertissue(90.05)andvaryingdegreesofimprovementinliverfibrosislesions.CdusionBCAcaneffectivelyimproveCCL,-inducedliverfibrosisinQvariectomizedfemalemice,possiblybyUpregulatingERtoinhibittheNF-Bsignalingpathwayandthenalleviatinginfl
16、ammatoryresponse.Keywords:HepaticFibrosis;Phytoestrogens;Ovariectomy;MiceResearchfunding:GuizhouProvincialHigh-LevelInnovativeTalentswHundredLevelTalentsaProject(GuizhouKehePlatformTalents20206011)肝纤维化是各种慢性肝病发展为肝硬化及肝癌的必经阶段，在早期阶段及时干预治疗则是可逆的（U,但若不及时干预，将进展为不可逆的肝硬化，甚至转变成肝癌124L因此对肝纤维化的有效干预对于避免其恶性进展具有重要意义
17、。流行病学研究发现，女性比男性具有更低的肝纤维化和肝硬化的风险15L但进入围绝经期雌激素分泌减少后，肝纤维化的发病率逐渐增加，这表明雌激素对肝脏具有保护作用16L内源性的雌激素参与抗肝纤维化的保护作用已有动物实验SR证据。然而，由于雌激素效应较强，长期过度使用雌激素治疗肝纤维化可能导致广泛的不良反应10,相比之下,植物雌激素具有与雌激素相似的结构1口1,被认为具有潜在的弱雌激素效应，临床应用相对安全1214。鹰嘴豆芽素A（biochaninA,BCA）主要来源于豆科植物鹰嘴豆的种子胚芽部分、红车轴草全草，属于异黄酮类植物雌激素，有雌激素样作用1118jBCA还可延缓高脂饮食诱导的非酒精性肝损伤
18、1191本课题组推测BCA可能通过其弱雌激素作用发挥抗肝纤维作用，为此，本课题以CCL诱导的雌性双侧卵巢切除（去势）肝纤维化小鼠为模型，观察植物雌激素BCA对肝纤维化的作用及其机制，为开发安全有效的抗肝纤维化植物雌激素药物提供依据。1材料与方法1.1主要仪器YP-SY96型多功能酶标仪（山东优云谱光电科技有限公司）；101型恒温箱（上海市跃进医疗器械有限公司）；AB104-S型电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司，感量：0.1mg）;MIULAB型离，机（杭州米欧仪器有限公司）；NikOnEclipseEclipseEloO型正置光学显微镜（日本尼康仪器有限公司）；DYY-6C电泳液系统（北京六一
19、生物有限公司）,NIKONDS-U3成像系统（日本尼康仪器有限公司）.1.2 翻BCA（批号N0901A,fe97%）购自大连美仑生物技术有限公司；雌二醇（批号J20171038,规格：Img）购自DelpharmLilIes.a.s；BeA蛋白浓度测定试剂盒（批号20220723）购自北京索莱宝科技有限公司；AST、ALT（批泰另IJ为20220628、20220620）均购自南京建成生物工程研究所；TNF-,IL-6（批号分别为FU02TDL61345.FU03N42H2910）均购自武汉伊W生物科技股份有限公司；兔抗鼠甘油醛-3-磷酸脱氧酶（GAPDH）单克隆抗体（批号#62110922
20、）购自美国Affinity公司；a-平滑肌肌动蛋白（a-SMA）多克隆抗体（批号14395-1-AP）购自武汉三鹰生物技术有限公司；I型胶原蛋白（CollagenI）单克隆抗体、雌激素受体（ER）多克隆抗体（批号分别为bs-0578R、bs20471R）均购自北京博奥森生物技术有限公司；兔抗鼠转化生长因子-（TGF-1）单克隆抗体（批号abl79695）购自美国Abcam公司；兔抗鼠细核因子-KB（NF-Bp65）、磷酸化细胞核因子B（p-NF-Bp65）单克颗体（批弱别为D14E12、93H1）均购自美国CellSignalingTeChnoIc）gy公司；PVDF膜（批号R1DB89779
21、）购自德国MerCk公司。1.3 实验动物60只昆明小鼠，雌，体质量1822g,购于长沙市天勤生物技术有限公司，实验动物生产许可证号:SCXK（湘）2019-0014,实验动物使用许可证号：SYXK（黔）2018X）001,M庶酗亲掖25OCSa,毓性饲养1周后用于实验。1.4 实验方法1.4.1 造模、分组与给药造模方谢瞩文献6,20进行。取50只雌性小鼠切除双侧卵巢以获得去势小鼠，同时取10只同批雌性小鼠切除双侧卵巢旁少量脂肪组织作为假手术组。术后3天，给予去势小鼠腹腔注射20%CCL1橄榄油溶液，每周2次，持续9周，建立肝纤维化模型。假手术组小鼠以腹腔注射橄榄油代替CCl4于CCLl诱导
22、的第3周，将50只建模小鼠按体质量随机分成5组，即模型组、阳性过照组（雌二醇2mg/kg）、BCA彳瞄IJ量组（25mgkg）,BcA中剂量组（50mg/kg）、BCA高剂量组（IoOmgkg）每组10只。分期，阳忸腌BeA低中、高剂量组分别灌胃溶于05%羚甲基纤维素钠溶液的对应药物，模型组与假手术组灌胃等体积05%竣甲基纤维素钠溶液，每天1次，黔7周。1.4.2取材末次给药后24h,麻醉各组小鼠，取血清，测定血清学指标；剖取小鼠肝脏及子宫，部分肝组织保存于-80冰箱中，另一部分肝组织固定于10%中性福尔马林中。1.4.3观察肝脏、子宫外观及计算肝指数、子宫指数肉眼观察肝脏及子宫大小、质地、颜
23、色等外观表现，称重，按下列公式计算器官（肝、子宫）指数。器官指数（%）=器官质量/末次体质量XlO0%。1.4.4HE、MaSSOn染色观察肝组织学改变固定的肝组织经不同浓度乙醇逐级脱水，浸蜡与包埋，切片，HE和MaSSon染色,镜下观察肝组织学变化。1.4.5检测血清AST、ALT活性取血清，采用微板法测定血清中AST、ALT活性。1.4.6 检测肝组织中IL-6、TNFy水平取-80。C冰箱中保存的肝组织制成匀浆液，采用ELlSA法测定肝组织中IL-6、TNFy水平，操作步骤按说明书进行。1.4.7 WerStenBlOt检测肝组织中COllagenI、TGF-1.SMAERP、ANF-K
24、BP65、NF-KBP65蛋白表达检测W中随机选取3只小鼠进行3次WesternBlot重复实验0提取肝组织总蛋白，BCA试剂盒检测蛋白浓度。蛋白变性，SDS凝胶电泳2h,湿转至PVDF膜，封闭2h,TBST缰中液触次，胡明叭OeI（1:2000）、SMA（1:2000）、ER（1:500）、TCFS（I:1000）、lBp65（1:IoO0）、pF-Bp65（l:1000）.&?汨（1:5000）-,于4。隋5夜，随后用TBST缓冲液洗PVDF膜3次，加二抗孵育2h,TBST缓冲液洗膜3次，EcL发光显影，用ImageJ软件对各条带的灰度值进行分析.1.5统计学方法采用SPSS24.0软件进
25、行数据分析，正态分布的计量资料以Ms表示，两组间比较采用成组f检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-检验非正态分布的计量资料以M（P2sP75）表示，多组间比较及进一步两两比较均采用Kruskal-WallisH检验。P0.05为差异具有统计学意义。2结果2.1 BCA对肝纤维化小鼠肝、子宫指数的影响与假手术组比较，模型组小鼠的子宫指数显著降低（尸0.05）,肝指数显著升高（P005）。与模型组相比，BCA各剂量组的肝指数均明显降低（尸值均0.05）;阳性对照组肝指数无明显变化（P0.05）,子B三ft月（PBCA低剂量组64.51%0.43%2,0.11%(Q06%0
26、33%)BCA中剂量组6454%O44%2)0.08%(0.05%0.32%)BCA高剂量组统计值尸值6464%020%2)Q10%(0.09%0.11%)F=19.942H=24.0590,0l32449.14】)阳性对照组1020.565.32?)14.966.232)BCA低剂量组1021.173.872)17.224.032)BCA中剂量组1020.726.48216.705.882)BCA高剂量组1019.664.682)14.972.9621尸值13.70319.488产值0.00010.0001注：与假手术组比较，1）AoOS;与螃眼敢，2）P0,05.2.4 BCA对肝纤维化小
27、鼠肝组织中IL-6、TNF-Cl水平的影响与假手术组相比，模型组小鼠肝组织中IL-6、TNFy均显著升高（尸值均0.05）;与模型组相比，阳性对照组及BCA各剂量组小鼠肝组织中IL-6、TNF-C（均显著解氐（P猷l0.05）俵3）。2.5 BCA对肝纤维化小鼠肝组织中CONagenI、TGF-1.-SMAxERP、P-NF-KBP65NF-Bp65蛋白表达的影响与假手术组相比较，模型组小鼠肝组织CollagenI、TGF-PI、C（SMA相对表达量均显著升高（P值均0.05）,与模型组比，阳性对照组及BCA低、中、高剂量组小鼠的肝组织COlIagenI、TGF-l-SMA相对表达量均显著降低
28、（尸值均。05）整送庭 *OOL*(00L* UoSSG图1 BCA对CCL诱导肝纤维化小鼠子宫肝脏形态学及肝脏病理的膨响Figure 1 Effects of BCA on the morphological and pathological changes of uterus and liver in CCI4-induced liverfibrosis mice与假手术组相比，模型组小鼠肝组织ER相对表达表3BCA对CCL诱导肝纤维化小鼠IL6、TNFy水平的影响Table3EffectsofBCAonserumcontentsofIL-6andTNF-inCCI4-inducedliv
29、erfibrosismice组别动物数（只）L6(PgZmg)TNF-a(Pgzmg)假手术组10107.432L2337.011216模型组10368.3976.411194.4926.51阳性对照组10123.4043.222)43.0511702)BCA低剂量组10208.2637.812)70.779.782jBCA中剂量组101721855.652)53.4314.382jBCA高剂量组10113.1517.512140.6317.442)F值3162312.645唯0.010,01注：与假？术绸块,l）P0,05;与镂组k械，2）P0.05）；与模型组相比，阳性对照组及BCA中、高
30、剂量组小鼠肝组织ER相对表达量均显著升高（P值均0.05）与假手术组相匕俄，模型组小鼠的p-NF-Bp65NF-Bp65相对表达量显著升高（P0.05）;与模型组相比，阳性对照组及BCA中、高剂量组小鼠中的p-NF-Bp65NF-Bp65相对表达量均显著降低（P值均SMACoIUgen ITGF-, ERBGAPOHp-Nf Bp65 NF xBp6S冬季木图9 呼S 8CA BCA 8CA 依剂!8中M里图2BCA对CCL诱导肝纤维化小鼠蛋白表达的影响Figure2EffectsofBCAonproteinexpressionsinCCI4-inducedliverfibrosismice组
31、显著升高，表明模型组小鼠存在显著的肝损伤。肝星状细胞（HSC）的激活在肝纤维化进展中起着关键作用124J。HSC合成过量细胞外基质（ECM）,在肝内沉积，促进肝纤维化的形成。CollagenI是ECM的主要成分之一，模型组小鼠肝组织中CollagenI表达上调，表明模型组小鼠肝组织内存在过多ECMo-SMA是肝星状细胞活化的标志蛋白，其过量表达提示HSC过度激活分泌ECM,加速肝纤维化的发生、发展L25J,还间接反映HSC在机体内活化增殖的进度与纤维化进展的严重程度1冽。TGF-PI是引起HSC活化最有效的细胞因子之-,介导HSC活化和生成ECM,是肝纤维化过程中的关键介质，参与肝纤维化的关键
32、环节，在肝纤维化的发生、发展中起关键作用（2728）。westernBlot结果表明，模型组小鼠肝组织a-SMA、TGF-1表达较假手术组明显增加，表明模型组小鼠肝组织中肝星状细胞显著活化，生成ECM能力明显增强。组别动物数炽）a-SMATGF-1Collagen IERp-NF-Bp65NF-Bp65假手术组30. 150.020.280.060. 310. 140. 630. 120.450.13模型组30.3910.05110.720.071)0.600.02lj0.590.130.900. 211)阳性对照组30.260. 102j0.450.062)0.420.032)0.940.2
33、72)0.410. 182)BCA低剂量组30.260.082)0.560.0920.470.022)0. 830. 150. 640.12BCA中剂量组30. 190.062)0.490.082)0.430.022)0.950. 152)0.450.092jBCA高剂量组30.1810.03210.470.062j0.420.032)0.980. 1520.530.082)F值5. 85012. 0576.8953. 2075.018产值0.0060.00010.0030.0460.01表4 BCA对CCL诱导肝纤维化小鼠肝组织中蛋白表达的影响TabIe 4 EffectS Of BCA O
34、n Protein expreSSionS in CQ-induced IiVer fibrosis mice注：与断雌啜,l）P0-05;与g劈St感,2）P0,05.与模型组相比，经高、中、低剂量的BCA干预后，BCA各组小鼠血清AST、ALT活力明显降低，肝组织中CdlagenI、a-SMAxTGF-1表达下调，肝组织病变程度也明显减轻，表明BCA处理可减少小鼠肝组织中ECM的生成，降低HSC的活化，减轻肝组织纤维化病变程度，提示BCA可有效改善CCL诱导的雌性去势小鼠的肝纤维化0与此同时，本实验还观察到模型小鼠因体内雌激素缺乏而出现子宫萎缩、子宫指数减小的表现；给予雌激素处理后，改善肝
35、纤维化的同时也使子宫增大。而BCA仅改善了肝纤维化，对子宫未产生明显影响，提示BCA的雌激素样作用弱，对子宫等其他雌激素相关器官影响不大。可以推测，若将其替代雌激素用于肝纤维治疗，可一定程度上降低患子宫癌等疾病的风险。肝纤维化发展的全过程中伴有炎症的发生129L控制肝脏炎症可在一定程度上逆转肝纤维化L3。】。NF-B是一类重要的核转录因子EL是NF-KB信号通路中的关键分子oNF-KB信号通路作为经典的炎症信号通路在炎症反应中发挥着重要作用TNF-.IL-6等炎症因子可作为NF-KB信号通路的配体激活NF-B通路，被激活的NF-B转位入核，调控靶基因转录TNF-a、IL-6等基因的启动子区具有
36、NF-KB的结合点132L被NF-KB激活后又进一步促进炎症因子表达，形成炎症反应恶性循环。NF-KB家族由ReIA(p65)、RelBxc-Rekp50(NF-BI)和p52(NF-B2)5个成员组成，可形成不同形式的同源二聚体或异二聚体。其中p65蛋白的相关研究最多，是经典的NF-B信号通路传导过程中的关键分子,磷酸化后的p65为其活性形式本研究发现，BCA中剂量、高剂量组肝纤维小鼠肝组织中p65蛋白的磷酸化修饰水平降低，提示BCA可抑制NF-B信号通路，打破炎症反应恶性循环，解氐TNF-a.IL-6等炎症因子水平，减轻肝脏炎症反应。BCA作为植物雌激素，往往可通过雌激素受体发挥作用.本研
37、究发现，BCA中剂量、高剂量干预的肝纤维化小鼠肝组织中ER表达明显增高，以BCA与ER进行分子对接也显示结合能较好，提示BCA可通过ER发挥作用。通过文献研究发现，上调ER可抑制NF-KB信号通路.例如三阴性乳腺癌细胞过表达ER时，NF-B表达降低，两者表达呈明显的相关性此外，过表达ER可通过降低IKBa及p65的磷酸化水平抑制NF-KB信号通路，进而抑制乳腺癌细胞的迁移及增殖p4L由此，可以合理推测，BCA可通过上调ER的表达而抑制NF-KB信号通路，从而减轻肝纤维化小鼠肝组织炎症反应，进而改善肝纤维化。综上所述,BCA可有效改善CeL诱导的雌性去势小鼠的肝纤维化病变，且具有对子宫等雌激素靶
38、器官影响较小的优势，其作用机制可能是通过上调ERP抑制NF-KB信号通路，减轻炎症反应而实现的。伦理学声明：本课题实验方案于2021年7月9日获得贵州医科大学实验动物伦理委员会审批，批号：2100313,符合实验室动物管理与使用准则。利益冲突声明：本文不存在任何利益冲突。作者贡献声明：谭超容参与课题的设计，负责课题实施，辘分析，撰写论文；李J微、冉俊艳、熊英、廖尚高参与课题实施，数据收集，修改论文；张金娟、何迅负责课题设计，指导实验实施及文章撰写并定稿。参考文献：I1JLIMB.LIJY.FENGDP.Researchadvancesinthereversalofliverfi-brosisP
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