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1、脂肪性肝病DOI：10.12449ZJCH240211超重人群中健康者与非酒精性脂肪性肝病患者的临床特征及血清脂质组学分析陈小燕，袁乙富，杜晟楠，曹勤，蒋元炸上海中医药大学附属普陀医院消化内科，上海200062留言储：蒋元炜,yuanyel014(ORQD:0000-0002-4979-4206)摘要：目的探究超重人群中，非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)患者与健康人的临床指标与脂质代谢差异.方法本研究将体质副酸(BMl)23kg/n?定义为超重人群，选取2020年8月2021年4月上海中医药大学附属普陀医院收治的62例超重NAFLD患者纳入超重NAFLD组，另选取同期超重健康体检者50例作为对
2、照记录所有受试者的临床信息以及血液生化指标数据。应用超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)进行血清脂质组学分析；使用主成分分析法和正交偏最小二乘法判别分析对脂质组学数据进行多元统计分析。计数资料两组间比较采用2检验.计量资料两组间比较采用成组t检验或Wilcoxon秩和检验结果超重NAFLD组BMI显著高于超重对照组(Z=-Z365,P=O.018)血清学指标中,超重NAFLD组红细胞、血红蛋白、红细胞t咨、尿酸、总蛋白、球蛋白、ALP.GGTxALT、AST、月酶韩、彳氐密阂缠白、捌旦固酿甘油三酯、载脂蛋白B、血糖水平均显著高于超重对照组(尸值均1,P3的甘油三酯含量较超重对照组
3、降低(P0.OO1),而不饱和键数3的甘油三酯含量较超重对照组增多(P23kghzwasdefinedasoverweightAtotalof62overweightpatientswithNAFLDwhowereadmittedtoPutuoHospitalAffiliatedtoShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicinefromAugust2020toApril2021wereenrolledasOVefWeightNAFLDgroup,and50overweightindividualswhoUnderWerItphysicalexami
4、nationduringthesameperiodoftimewereenrolledasCOntrDlgroup.Clinicalinformationandbloodbiochemicalparameterswererecordedforallsuects.Ultra-performanceliquidchromatography-tandemmassspectrometrywasusedtoanalyzeserumIipidomicprofile,andprincipalcomponentanalysisandorthogonalpartialleastsquares-disiminan
5、tanalysiswereusedtoperformthemultivariatestatisticalanalysisofIipidomicdata.Thechi-squaretestwasusedforcomparisonofcategoricaldatabetweentwogroups,andtheindependent-samplesftestorteWilcoxonrank-sumtestwasusedforcomparisonofcontinuousdatabetweentwogroups.ResultsTheoverweightNAFLDgrouphadasignificantl
6、yhigherBMIthantheoverweightcontrolgroup(Z=-2365,P=0018).Asfbrserologicalmarkers,comparedwiththeoverweightcontrolgroupztheoverweightNAFLDgrouphadsignificantlyhigherlevelsofredbloodcells,hemoglobin,hematocrit,uricadd,totalprotein,globulin,alkalinephosphatase,gamma-glutamyltranspeptidase,alanineaminotr
7、ansferase,aspartateaminotransferase,cholinesterase,low-densitylipoprotein,totalcholesterol,triglyceride,apolipoproteinB,andbloodglucose(all?l,P3unsaturatedbonds(尸0.001)andasignificantineaseinthecontentOftriglyceridewith3unsaturatedbonds(P23kgm2定义为超重人群。选取2020年8月一2021年4月本院住院部及体检中心经超声诊断为NAFLD且BMI23kgm2
8、的患者作为超重NAFLD组；另选择同期健康体检者中BMI23kg人群作为超重对照组。NAFLD患者均符合非酒精性脂肪性肝病防治指南（2018年更新版）的诊断标准。纳入标准：年龄之18岁；临床信息完整。排除标准：（1）有过量饮酒史或饮酒问卷数据缺失者；先天性肝脏疾病、自身免疫性肝病、药物性肝损伤和酒精性肝病；（2）合并肝外纤维化疾病，包括系统性红斑狼疮、风湿类疾病、肾衰竭、慢性阻塞曲市疾病、糖尿病、高血压病、冠心病等；（3）合并心脑血管、泌尿系统、肾脏、造血系统等原发性疾病；（4）合并甲状腺疾病，包括甲状腺功能亢进、甲状腺功能减退、亚临床甲状腺功能减退、桥本甲状腺炎；（5）恶性肿瘤、其他严重合并
9、症或精神病；（6）孕妇及哺乳期者。1.2临床资料收集所有受试者均完成基本资料/病史资料收集、人体参数测量、血液生化指标检查、肝脏超声检查.计算受试者BMI;采集受试者晨间空腹静脉血样本，进行血常规、肝肾功能、空腹血糖、血1旨等实验室生化指标检测，分析仪器为Hitachi7600d-210全自动生化分析仪。1.3仪器与试剂UItiMate3000超高效液相色谱仪（美国ThermoFiSher公司）,OrbitrapElite静电场轨道阱质谱仪（美国ThermoFiSher公司）；冷冻高速离心机（173OR,摩GENE公司）。甲醇（色谱纯，美国Merck公司）;乙睛（色谱纯，美国Sigma公司）;
10、其余试剂均为分析纯。1.4 血清脂质组学样本的前处理采集受试者晨间空腹静脉血样本，采血后立即放入4C条件下静置2h,于IoooXg（离心串至7cm）、4。阖牛根心15min,WzW液分装后保存于-80冰箱冻存待测。脂质组学分析前，取冷冻血清60Lf加入1000L甲基叔丁基酸、300L甲瞬口290L超纯水，期混匀Imin,于1OoOXg、4条件下离心10min,取上清溶液置于新离心管中冷冻干燥;干燥后的样本中加入100L异丙醇-甲醇（体积比1:1）,待样本复溶后在100g,4。（:条件下离心10min,取上清80L采用超敲腋相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）进行分析。1.5 UPLC-M
11、S/MS分析应用超高效液相色谱-静电场轨道阱质谱仪.液相分离使用ACQUITYUPLCHSST3（100mm21mm,L8m）液相色谱柱（IOZVaters公司）流动相A为体积比60:40的乙脩-水溶液（含有10mmol/L乙酸铁和0.1%甲酸）;流动相B为体积比50:50的乙睛-异丙醇溶液（含有10mmol/L乙酸筱和。1%甲酸）;流速0.3mlmin;进样量2L;柱温45oCe梯度洗脱程序如T:0min,30%JSB;02.0min,30%43%!fB;202Imin,43%55%闹相B;2.1IZOmin,55%65%福相B;12018.0min,65%85%嗣而B;18.0-20.0m
12、in,85%100%流动相B;20.0-25.0min,100%i3ISB；25.025.1min,100%30%B;25.130.0min,30%流动相B。质谱条件：离子源采用电喷雾离子源（ESI）,质量分析器为静电场轨道阱。分别在ESl正/负离子模式下采集数据，扫描范围为质荷比501000正离子模式下，电喷雾三3.0kV,琢管蘸为350,S-LensRFLevel设置为30%,鞘气压力为45psi,辅助气流速为5L/min,尾气流速为0.3L/min负离子模式下，电喷雾电压为3.2kV,毛细管温度为350,S-LensRFLevel设置为60%,鞘气压力为45psi,辅助气流速5Lmin,
13、尾气流速为0.3Lmin1.6 统计学方法采用SPSS25.0统计学软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以：S表示，两组间比较采用成组f检验；不符合正态分布的计量资料以M（P25-P7s）表示，两组间匕盛采用Wilcoxon秩和检验。计数资料两组间比较采用2检验。尸0.05为差异有统计学意义。用于脂质组学分析的LC-MS原始数据，通过Xcalibur软件进行采集并进行预处理，包括峰提取、峰对齐、保留时间校正、峰面积校正，随后采用LipidSearch软件鉴定脂质代谢产物.将鉴定的脂质组学数据导入Simca-P14.0软件进行多元统计分析，包括主成分分析（principalcomponent
14、analysis,PCA）和正交偏最小二乘寿J别分析（orthogonalpartialleastsquaresdiscriminationanalysis,OPLS-DA）0通过PCA可以直观地表现出两组之间的差异大小并检查是否存在异常点。脂质成分的组间比较采用GraPhPadPrism9.0软件。2结果2.1超重NAFLD组与超重对照组临床资料及生化指标比较共纳入超重NAFLD患者62例（超重NAFLD组）,超重健康体检者50例（超重对照组）。两组一般资料及血液生化指标比较结果显示，年龄、身高、体质量、BMLRBC,Hb、HcL藤ALP.TPxGbGGT.ChEALT、AST、LDLTQT
15、G、APOB、（尸值均23kgm2),但NAFLD组的BMI仍高于超重对照组，且差异有统计学意义(P0.05)。此外，NAFLD组患者的ALT、AST水平较超重对照组显著升高，提示NAFLD患者有不同程度的肝损伤。原因是当脂肪在肝内堆积过多时，会损害肝细胞功能，导致肝细胞内的ALT、AST溢出细胞外，使外周血液中ALT、AST水平升高。此外，超重NAFLD组的RBC、HbxHCt显著升高，而较高的RBC、Hb.Het被认为与胰岛素抵抗及代谢综合征相关，有研究显示RBC、Hb.Hct水平与NAFLD呈正相关。此外，与超重对照组相比，NAFLD患者的尿酸水平显著升高研究【I?J表明，NAFLD患者
16、的尿酸水平通常较高，尤其是在肥胖、高血压、糖尿病等代谢综合征患者中更为明显。这可能是由于NAFLD导致肝功能异常，使得尿酸代谢能力下降，从而造成尿酸水平升高。还有研究I指出，田的的NAFLD患者中，合并高尿酸血症者发生严重肝脂肪变性的概率较高，而在非肥胖人群中却没有相似现象高尿酸也可导致胰岛素抵抗，激活肾素-血管紧张素系统，加剧线粒体氧化应激，从而导致NAFLD的发生Glu升高与胰岛素抵抗直接相关，TUTG、LDL增高与肝脂肪沉积有关，也增加了肝脏的胰岛素抵抗【14L本研究中，超重NAFLD组Glu.TQTGLDL显著高于超重对照组，同样提示了胰岛素抵抗可能是超重NAFLD患者与超重健康人群之
17、间的重要差异。脂质组学结果显示，与超重对照组相比，大多数鉴定出的脂质在超重NAFLD患者中下调，但是FA在NAFLD组显著增高.有研究表明，NAFLD与胰岛素抵抗有关，在胰岛素抵抗的情况下，脂肪组织对胰岛素的抗脂解作用产生抵抗力，FA的释放增加。胰岛素抵抗伴随着胰岛素水平升高，在脂肪分解增加和/或脂肪摄入增加的情况下，均会促进肝脏TG合成亦有研究1,6,7发现,FA水平与BMI呈正相关，这可能是因为BMI反映了体内脂肪组织的含量，而脂肪组织是FA的主要来源0同时，FA水平的升高可能加重肝脂肪沉积、氧化应激和纤维化，从而促进NAFLD的进展【也。TG是一种脂类物质，在基本的细胞生命活动中发挥重要
18、作用。高水平的血清TG与代谢紊乱和心血管疾病有关。有研究指出，NAFLD在TG酰基链组成上的差异遵循一种模式,即NAFLD中短链和饱和脂肪酰基含量较高，而含多不饱和脂肪酸的TG含量较低。另有部分脂质组学研究【孙2表明，脂肪变性受试者血浆中的TG和DG增加。这可能与FA从脂肪变性的肝脏中自噬释放增多，或上调的新生脂肪合成增多有关，进而导致极低密度脂蛋白分泌增多。尽管本研究中观察到超重NAFLD的TG种类有增加的趋势，但与超重对照组相比并没有显著差异，这可能是因为测试了大量的TG种类，导致数据冗余而没有进一步分组划分研究所致0故本研究进一步将TG按照不饱和键数3和53划分，结果显示两组之间有显著差
19、异，即NAFLD患者的TG中饱和脂肪酰基含量较高,而含多不饱和脂肪酸的TG较低这可能是由于高胰岛素水平驱动从头脂肪生成，导致产生饱和脂肪酸。细胞将饱和脂肪酸储存为TG的能力达到极限，造成了这种血液中TG组成的变化。此外，单不饱和脂肪酸的产生由留酰辅酶A(CoA)去断口酶的活性9区动，该舱赖于SREBP-I蛋白。以往有研究(21表明，由于高胰岛素血症，NAFLD中的笛醇CoA去饱和酶和SREBP-I激活增加。综上所述，本研究纳入的超重NAFLD组患者虽多项临床生化指标处于正常区间，但是与超重健康人群相比，NAFLD患者中许多与代谢综合征、胰岛素抵抗及肝功能损伤相关的生化指标仍显著升高，提示NAF
20、LD患者除脂肪肝这一病理性表现之外，还有潜在的其他代谢综合征的风险.脂质组学结果显示超重NAFLD患者与超重对照组相比较，血液内FA明显升高；TG中的含饱和脂肪链的种类显著升高，而含多不饱和脂肪酸的种类则较低0本研究提示，与健康的超重人群相比，NAFLD患者存在胰岛素抵抗的情况。以上结果不仅有助于进一步认识超重人群中NAFLD的发病机制，也为超重人群特异性的预防、监测以及治疗NAFLD提供了见解。伦理学声明：本研究方案于2020年7月16日经由上海中医药大学附属普陀医院伦理委员会审批，批号：PTEC-A-2020-29-l利益冲突声明：本文不存在任何利益冲突。作者贡献声明：陈小燕负责撰写论文；
21、袁乙富、杜晟楠负责数据收集及处理；曹勤、蒋元炜负责拟定写作思路并最后定稿。参考文献：11LIL.LIUDW,YANHY.etal.Obesityisanindependentriskacorfornon*alcoholicfattyliverdisease:Evidencefromamcta-analysisof21cohortsudiesJ.ObesRevt2016.17(6):510-519.DOI:10.Illl/obr.12407.2)FANJG.KIMSU.WONGVW.New(rendsonobesi(yandNAFLDinAsia(J).JHepaioL2017t67(4):86
22、2-873.DOI:10.1OI6j.jhep.2O17.06.003.3Iacobinic.puglieseg.blasettifantauzzic.eta.MctabolieCaIIyhealthyversusmctabolicallyunhealthyobcsit),J.Mctabo-Iism.2019.92:51-60.DoI:10.1016j.tabol.20l8.11.009.4OLIVEIRADT.CHAVESHLHOAB,YOSHINAGAMY,al.Liverlip-idomesignatureandmetabolicpathwaysinnonalcoholicfatlyliverdiseaseinducedbyuhigh-sugardictJ).JNutrBiochcm.2021,87:108519.DOI:10.10l6j.jnutbio.2020.108519.5Masoodim.gastlde
