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1、I、毛细管电泳及其应用TheApplicationofCapillaryElectrophoresis（CE）一、毛细管电泳的概述：毛细管电泳乂称高效毛细管电泳，它是在熔融的石英毛细管（内径为25100m）中进行电泳，其管内填充缓冲液或凝胶，是近年来进展最快的分析方法之一。毛细管电泳是电泳技术和现代微柱分离相结合的产物，它具有效率更高、速度更快、样品和试剂消耗量特少的特性。毛细管电泳仪的基本结构：高压电源二-一J1.bJ1.7A1.1、高压电极槽与进样机构2、填灌清洗机构3、毛细管4、检测器5、伯丝电极6、低压电极槽7、恒温机构8、记录/数据处理毛细管的结构：毛细管电泳通常使用内径为25100
2、um的弹性（聚酰亚胺）涂层熔融石英管。毛细管的特点是：容积小；侧面/截面积大而散热快、可承受高电场：可使用自由溶液、凝胶等为支持介质；在溶液介质下能产生平面形状的电渗流。二、毛细管电泳的基本原理：毛细管电泳是以高压电场（30kV）为驱动力，以毛细管为分离通道。其管内填充了缓冲液或凝胶，根据样品中各组分之间满度和分配的差异而实现分离的一类液相分离技术。在电泳过程中，毛细管两端插入电极液，此电极液通常与管中的缓冲液一致。正负电极连接至高电压装置,进样时样品盘移动，使毛细管的进样端及此端的电极准确插入样品管中，给予一定电场或压力后，样品被吸入毛细管内，然后再将毛细管移至电极液中开始电泳。在毛细管电泳
3、中，为了维持电荷平衡，溶液中的正离子吸附至石英表面形成双电子层，当在毛细管两端施加电压后，这层正离子趋向负极移动，并带动毛细管中的溶液以液流形式移向负极（电渗）。由于毛细管的表面积与体积比大，加上电泳时使用了高压，电渗在毛细管电泳中具有两大特点：液体沿着毛细管壁均匀流动，其前沿是平的；携带不同电荷的分子朝一个方向移动，中性分子也能随着电渗一起移动而实现分离三、毛细管电泳的检测技术：迄今为止，毛细管电泳常用的检测方法有：紫外可见光吸收、荧光、电化学、质谱、激光诱导荧光检测等。四、毛细管电泳的分离模式：（一）毛细管区带电泳（capillaryzoneelectrophoresis,CZE）：毛细管
4、和电极槽内充有相同组分和相同浓度的电解质溶液（缓冲液）。它是最基本、应用最普遍的一种分离模式，尤其对于亲水多肽的分离具有一定的优越性。（二）微团电动毛细管色谱micellarelectrokineticcapillarychromatography，MECC）：通常有一些离子型表面活性剂（如SDS）加到缓冲液中，这类分子一端为亲水基团，其余部分为疏水内核,亲水基团在表面，中性粒子因其本身硫水性不同而得以分离。（三）毛细管等电聚焦（capillaryisoelectricfocusing,CIEF）：选用内壁中性共价涂层消除电渗的毛细管，利用两性电解质形成PH梯度。CIEF具有较高的分辨力。（四
5、）毛细管筋分电泳（capillarysievingelectrophoresis,CSE）：在毛细管内填充了多聚物作为分离介质，如甲基纤维素对分子的泳动起着阻碍作用。其作用机制类似平板电泳凝胶的筛网作用，大分子较小分子所受的阻碍大，泳动速度减慢。（三）非水毛细管电泳（nonaqueouscapillaryelectrophoresis,NACE）：利用纯有机溶剂（甲酰胺及其衍生物、乙嘴、醋酸、甲醇、二甲亚械等）或混合试剂替代水介质来完成样品的电泳分析。NACE主要用于分析不易溶于水而易溶于有机溶剂的物质，分离在水溶剂中淌度十分相似的物质，研究在水中难以发生的反应等。（六）毛细管阵列电泳（cap
6、illaryarrayelectrophoresis,CAE）：CAE是在常规CE原理和技术的基础上，结合微型制造技术设计出来的一种检测技术由微通道或反应池等构成通道型微阵列芯片，通过加载生物样品，进行一种或连续多种反应，达到快速高效分析的目的，是一种新型的生物芯片。（七）免疫亲和毛细管电泳:immunoaffini（ycapillaryelectrophoresis,ACE）：ACE是把蛋白质（抗原或抗体）事先固定在毛细管柱内，利用抗原抗体的特异性识别反应，CE的高效、快速分离能力，1.IF的高灵敏度来分离检测样品混合物中能与固定化蛋白质特异结合的组分。五、影响毛细管电泳分析精密度的因素：积
7、分软件的影响冲洗程序的影响温度控制的影响进样的影响六、应用：（一）CE快速PCR-SSCP分析：DNA单链构象多态性（singlestrandconformationpolymorphism,SSCP）是一种有效的检测DNA变异的技术，原理是不同的单链DNA分子在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率与其构象密切相关，而每一DNA分子的构象又是由其特异的碱基序列决定的，一个碱基的改变都有可能影响其构象，从而引起其电泳行为的改变。传统的SSCP分析采用平板聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）,显示电泳结果必须辅以放射自显影或硝酸银染色等技术，费时费力，不能满足临床检测基因点突变的需要。毛细管电泳技术具有快
8、速、高效、样品消耗少等特点。希望利用人工诱变的含有单个核甘酸改变的PCR产物，建立和优化CE作SSCP分析的方法与条件，为临床基因诊断提供一种快速有效的筛查方法。A未变性的标准分子量DNAPCR样品的毛细管电泳图谱:（二；凝集素碎片的糖结合活性：利用毛细管电泳技术研究植物凝集素的活性肽段和拟糖蛋白的结合能力。BPA：羊端甲凝集素，对半乳糖专一1.CA：小扁豆凝集素，对葡萄糖/甘露糖专一BPA-10：BPA的活性碎片（10肽）1.CA-9：1.CA的活性碎片（9肽）拟糖蛋白：半乳糖牛血清白蛋白（GaI-BSA）甘露糖牛血清白蛋白（Man-BSA）岩藻糖牛血清白蛋白（1.-Fuc-BSA）结合反应
9、：肽溶液和拟糖蛋白溶液等体积混合后，室温放置过夜。A：BPA-IOB：BPA-IO和GaI-BSA的混合物C：BPA-IO和Man-BSA的混合物ABCDA：1.CA-9B：1.CA-9和Gal-BSA的混合物C：1.CA-9和Man-BSA的混合物D：1.CA-9和1.-Fuc-BSA的混合物II、核酸分子杂交第一节分子杂交的概念及基本原理主要内容：一、分子杂交的概念二、分子杂交基本原理（一）DNA变性：1、DNA变性的方法，2、增色效应，3、溶解曲线，4、融解温度，5、影响Tm值的因素。（一）复性：退火一、分子杂交的概念：分子杂交（molecularIiybridiHion）指具有一定同源
10、序列的两条核酸单链（DNA或RNA）,在一定条件卜.按碱基互补配对原则经过退火处理，形成异质双链的过程。利用这一原理，就可以使用已知序列的单链核酸片段作为探针，去查找各种不同来源的基因组DNA分子中的同源基因或同源序列。二、分子杂交基本原理：（一）DNA变性：DNA变性是指双螺旋之间氢健断裂，双螺旋解开，形成单链无规则线团，因而发生性质改变（如粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外吸收增加等）。1、DNA变性的方法：D加热；2）改变DNA溶液的pH；3）有机溶剂（如乙醇、尿素、甲酰胺及丙酰胺等）等理化因素。2、增色效应：DNA在260nm处有最大吸收值，这一特征是由于含有碱基的缘故。在DNA双
11、螺旋结构模型中碱基藏于内侧，变性时由于双螺旋解开，于是碱基外露，26Onm紫外吸收值因而增加，这一现象称为增色效应（hyperchromiceffect）。利用DNA变性后波长260nm处紫外吸收的变化可追踪变性过程。3、溶解曲线：如果升高温度使DNA变性，以温度对紫外吸收作图，可得到一条曲线，称为溶解曲线。4、融解温度：通常人们把50%DNA分子发生变性的温度称为变性温度（即熔解曲线中点对应的温度），由于这一现象和结晶的融解相类似，故又称融点或融解温度（meltingtemperalure,Tm）,因此Tm是指消光值上升到最大消光值一半时的温度。5、影响TIn值的因素：Tm不是一个固定的数值
12、，它与很多因素有关：1）部因素：pH、离子强度。随着溶剂内离子强度上升，Tm值也随着增大。2)部因素：DNA的碱基比例、DNA的均一性；在相同条件下，DNA内G-C配对含量高，其Tm值也高。6、DNA中的GC含量与Tm值关系：Tm=69o3+0o41X%(G+C)对于小于20bp的寡核甘酸，Tm=4(G+C)+2(A+T)实验表明DNA分子中(G+C)克分子含量百分比的大小与Tm值的高低呈直线关系。(一)复性：变性DNA只要消除变性条件，二条互补链还可以重新结合，恢复原来的双螺旋结构，这一过程称为复性(Fenaturation)。退火：通常DNA热变性后，将温度缓慢冷却，并维持在比Tm低253
13、(C左右时，变性后的单链DNA即可恢更双螺旋结构，因此，这一过程又叫做退火。复性后的DNA,理化性质都能得到恢复。倘若DNA热变后快速冷却，则不能复性。影响复性速度的因素：1、DNA浓度：愈高，复性速度也愈快。2、DNA片段的大小：DNA片段愈大，扩散速度愈低，使DNA片段线状单链互相发现互补的机会减少。因此，在竟性实验中，有时将DNA切成小片段，再进行复性。3、温度：过高不利于复性。4、溶液的离子强度：通常盐浓度较高时，复性速度较快。5、DNA顺序的复杂性；简单的分子复性很快，如POIydm和poydA由于彼此互补识别很快，故能迅速复性。但顺序较复杂的DNA分子复性则较慢。因此通过变性速率的
14、研究，可以了解DNA顺序的复杂性。第二节核酸探针主要内容：一、探针的概念二、探针的种类极其选择：1、DNA探针，2、CDNA探针,3、RNA探针，4、其核酸探针三、各种标记物极其选择四、核酸探针的标记方法五、杂交信号检测一、探针的概念:放射性同位素、生物素或荧光染料进行标记的已知序列的核酸片段，即为探针(probe)o探针可用于分子杂交,杂交后通过放射自显影、荧光检测或显色技术，使杂交区带显现出来。二、探针的种类极其选择：基因探针根据标记物不同可粗分为放射性探针和非放射性探针两大类；根据探针的来源及核酸性质不同又可分为DNA探针，RNA探针，CDNA探针，及寡核甘酸探针等几类。1、DNA探针：
15、DNA探针是最常用的核酸探针，指长度在几百碱基对以上的双链DNA或单链DNA探针。现已获得DNA探针数量很多，有细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞DNA探针。这类探针多为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。DNA探针的获得有赖于分子克隆技术的发展和应用。以细菌为例，目前分子杂交技术用于细菌的分类和菌种鉴定比之G+C百分比值要准确的多，是细菌分类学的一个发展方向。加之分子杂交技术的高敏感性，分子杂交在临床微生物诊断上具有广阔的前景。DNA探针(包括CDNA探针)的优点：这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，取之不尽，制备方法简便。不易降解(相对RNA而言)，一般能有效抑制DNA酶
16、活性。DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，如缺口平移，随机引物法等，能用于同位素和非同位素标记。2、cDNA探针：cDNA（complementaryDNA）探针是指互补于mRNA的DNA分子，是由逆转录酶催化而产生的。该酶以RNA为模板,根据碱基配对原则，按照RNA的核甘酸顺序合成DNA（其中U与A配对）。cDNA探针是目前应用最为广泛的一种探针。3、RNA探针：RNA探针是一类很有前途的核酸探针，由于RNA是单链分子，所以它与靶序列的杂交反应效率极高。早期采用的RNA探针是细胞mRNA探针和病毒RNA探针，这些RNA是在细胞基因转录或病毒复制过程中得到标记的，标记效率往往不高，
17、且受到多种因素的制约。这类RNA探针主要用于研究目的，而不是用于检测。克隆探针：前述三种探针均是可克隆的，一般情况下，只要有克隆的探针，就不用其核甘酸探针。在DNA序列未知而必须首先进行克隆以便绘制醉谱和测序时，也常应用克隆。克隆探针的优点：1、特异性强，从统计学角度而言，较长的序列复杂度高，随机碰撞互补序列的机会较短序列少。2、可获得较强的杂交信号，因为克隆探针较寡核甘酸探针掺入的可检测标记基团更多。4、寡核酸探针：根据已知的核酸序列，采用DNA合成仪合成一定长度的赤核甘酸片段，亦可作为探针使用。若不知核酸序列，可根据蛋白质的氨基酸顺序推倒出核酸顺序，但要考虑到密码子的兼并性。多用于克隆筛选
18、和点突变分析。人工合成的声核酸探针有下述优点：短的探针比长探针杂交速度快，特异性。可以在短时间内大量制备。在合成中进行标记制成探针。可合成单链探针，避免了用双链DNA探针在杂交中自我复性，提高杂交效率。其核甘酸探针可以检测小DNA片段，在严格的杂交条件下，可用于检测在序列中单碱基对的错配。筛选声核甘酸针的原则：长185Obp,较长探针杂交时间较长合成量低；较短探针特异性会差些。碱基成分：G+C含量为40%60%,超出此范围则会增加非特异杂交。探针分子内不应存在互补区，否则会出现抑制探针杂交的“发夹状结构。避免单一碱基的重复出现（不能多于4个），如CCCCC,一旦选定某一序更符合上述标准，最好将
19、序列与核酸库中核酸序列比较，探针序列应与含靶序列的核酸杂交，而与非靶区域的同源性不能超过70%或有连续8个或更多的碱基的同源，否则，该探针不能用。三、标记物：目前基因检测方法中以同位素标记（32P、35S等）DNA探针灵敏度最高，但由于放射性污染、半衰期短、需要特别的安全防护条件等，限制了同位素标记探针的广泛应用。因此，非同位素标记探针的研制引起重视，（一放射性核素：核酸探针传统的标记物是用放射性同位素，常用的有：32PdNTP、3HdNTP、35SdNTP。1、放射性同位素标记核酸的优点：（1）灵敏性高：一般可达到Oo55pg或更低浓度核酸的检测水平，可以检测极少量或拷贝数少的基因组（可延长
20、曝光时间或增敏屏增敏）。（2）特异性高：用放射自显影法，样品中存在的无关核酸或非核酸成分不会干扰检测结果，准确率高，假阳性率低。（3）方法简便。2、放射性同位素标记技术的缺点：（1）半衰期短，必须经常标记探针：如32P、半衰期只有14。3天，放射强度逐日变化。35S的半衰期可达88天，但衰变能量只有32P的1/10,灵敏度较低，只能用于多拷贝基因的检测。3H的半衰期虽长达12o26年，但衰变能低，灵敏度太低。（2）费用高：32P标记的dATP（400CimmoD,需要进口试剂，价格高。（3）检测时间长：用放射自显影需要较长的曝光时间（115天）。（4）其他：放射性同位素对人体有害，实验室和环境
21、易被污染，放射性废物处理困难。因此，推广使用受到限制。（二）非放射性标记物：优点：1、无放射性污染；2、稳定性好；3、探针可长时间保存。缺点：灵敏度及特异性不高。1、非放射性标记物的种类：（1）半抗原：生物素、地高辛，利用半抗原的抗体进行免疫学检测。（2）配体：生物素还是一种抗生物素蛋白avidin和锥亲和素StrePlaVidin的配体。（3）荧光素：异硫氟酸荧光素和罗丹明，可被紫外线激发出荧光而被检测到。（4）光密度或电子密度标记物：金、银。a、生物素标记：生物素标记的核甘酸是最广泛使用的一种，如生物素“1-dUTP,可用缺口平移或末端加尾标记法。实验发现生物素可共价连接在喀咤环的5位上，
22、合成TTP或UTP的类似物。b、地高辛标记探针：地高辛（DigOXigenin简写Dig-）又称异羟基洋地黄毒或配基，这种类固醇半抗原仅限于洋地黄类植物，其抗体与其它任何固醉类似物如人体中的性激素等无交叉反应。先将地高辛通过一手臂连接至dUTP上，生成地高辛配基（Dig-dUTP）,再用随机引物法将地高辛配基掺入DNA制成探针。然后用抗地高辛抗体与碱性磷酸酶的复合物和NBT-BaP底物显色检测，灵敏度达0。IpgDNAo此种探针有高度的灵敏性和特异性，安全稳定，操作简便，可避免内源性干扰，是一种很有推广价值的非放射性标记探针。四、核酸探针的标记方法：主要内容：（一）放射性标记1、缺口平移法2、
23、随机引物延伸3、5,末端标记法4、31末端填充标记法（一）非放射性标记1、酶促反应标记法2、化学修饰标记法（一）放射性标记：1、缺口平移法：I）在适当的浓度的DNaSel作用下在一双链DNA上制造一些缺口，2）利用大肠杆菌DNA聚合酶I的5，一3,外切酶活性依次切除缺口下游的核酸序列，3）利用DNA聚合酶I的5，3,聚合活性逐个加入新的核甘酸（其中一种用放射性标记）此法也适用于探针的非放射性标记。2、随机引物延伸：这是以单链DNA或RNA模板合成高比活性32P标记探针所选用的方法。原理是使长68pb的其核甘酸片段与变性的DNA或RNA模板退火，在DNA聚合酶I或反转录醉的作用下，以每一个退火到
24、模板上的更核甘酸片段为引物引发DNA链的合成，在反应时将32PdNTP掺入合成链，即得到标记。变性处理后，新合成链（探针片段）与模板解离，即得到无数各种大小的探针DNA。因为所用寡核苜酸片段很短，在低温条件下可与模板DNA随机发生退火反应，因此被称为随机引物（randomprimer）。这种随机引物可用小牛胸腺DNA或鱼精DNA制备。3、5,末端标记法：在大肠杆菌T4噬菌体多聚核甘酸激酶（T4PNK）的催化卜.，将32P-ATP上的磷酸连接到其核甘酸的5,末端上。要求标记的寡核甘酸5,端必须带羟基。此法适用于标记合成的寡核甘酸探针。4、3”末端填充标记法：利用Klenow片段可以填补由限制酶消
25、解DNA所产生的3凹陷末端。因此，用这种方法可以标记双链DNA的凹陷3末端。用Klenow片段标记末端一般只用一种-32PdNTP,加入反应的-32PdNTP取决于DNA末端延伸的5球端序列，例如，用ECORl切割DNA所产生的末端用a32PdATP标记。（二）、非放射性标记：放射性标记核酸探针在使用中的限制，促使非放射性标记核酸探针的研制迅速发展，在许多方面已代替放射性标记，推动分子杂交技术的广泛应用。目前已形成两大类非放射标记核酸技术，即函促反应标记法和化学修饰标记法。1、酶促反应标记法：将标记物预先标记在核甘酸分子上，然后利用酶促反应将核甘酸分子掺入到探针分子中去。1）标记物-dUTP的
26、生成：如BiO-Il-dUTP、Dig-IbdUTPo2）通过缺口平移法、末端加尾标记和随机引物延伸法将标记物-dUTP作为大肠杆菌多聚酶I（DNA酶I）的底物掺入到DNA分子中。2、化学修饰标记法：利用标记物分子上的活性基团与探针分子上的基团发生的化学反应将标记物直接结合到探针分子上。如可通过连接臂将一个光敏基团连接于生物素成为光敏生物素，在可见光的作用下，与核酸形成稳定的交联,从而得到光敏生物素探针。五、杂交信号检测：（一）放射自显影：利用放射线在X线片上成影作用来检测杂交信号，称为放射自显影。（二;非放射性核素探针的检测：1、偶联反应：（1）半抗原通过抗原抗体反应与显色体系偶联。（2）配
27、体亲和法与显色体系偶联：生物素-抗生物素蛋白-酶（Avidin-Biotin-Enzyme-ComplexABO2、显色反应：通过连接在抗体或生物素蛋白的显色物质如酶、荧光素等进行杂交信号的检测。（1）酶学检测：是最常用的检测方法，通过酶促反应使底物形成有色产物。最常用的醉是辣根过氧化物酶和碱性璘酸酶,也有使用酸性磷酸酶和B-半乳糖甘酶。1）辣根过氧化物酶（HRP）检测体系：HRP+H2O2HRP-H2O2;AH2+HRPH2O2-A+HRP+H2O2：如A为DAB（二氨基联苯胺为致癌物）生成棕红色沉淀：如为TMB（四甲基联苯胺）生成蓝色。2）碱性磷酸酶（AKP）检利体系：以BCIP/NBT为
28、底物，结果为蓝紫色沉淀。AKPBCIP+NBT-*蓝色IBCIP：5嗅4氯3与I味磷酸，NBT：四氮哩蓝AKP灵敏度和分辨率较HRP高约10倍左右，但HRP的优点为价廉、稳定。（2）荧光检测：常用的有异硫的酸荧光素（FrrC）和罗丹明，可被紫外线激发出荧光而被检测到。主要应用于原位杂交。（3）化学发光法：是指在化学反应过程中伴随的发光反应。目前常用的是辣根过氧化物酶（HRP）催化鲁米诺（IUmiiK）D伴随的发光反应。适合于Southern.Northern及斑点杂交。（4）电子密度标记：利用重金属的高电子密度、在电子显微镜卜进行枪测，适合于细胞原位杂交。第三节核酸分子杂交的类型核酸分子杂交可
29、按作用环境大致分为液相杂交和固相杂交两种类型。液相杂交：液相杂交指所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。液相杂交是一种研究最早且操作复合的杂交类型，在过去的30年里虽有时被应用，但总不如固相杂交那样普遍。其主要原因是杂交后过量的未杂交探针在溶液中除去较为困难和误差较高。固相杂交：固相杂交是将参加反应的一条核酸锌先固定在固体支持物上，另一条核酸链游离在溶液中。由于固相杂交后，未杂交的游离片段可容易地漂洗除去，膜上留卜的杂交物容易检测和能防止靶DNA自我复性等优点，故该法最为常用。根据支持物的不同固相杂交又可为：谑膜杂交、菌落原位杂交和组织原位杂交。SOUthem印迹杂交印迹杂交Northem印迹
30、杂交C固相杂交V1斑点杂交、狭缝杂交DNA斑点杂交菌落原位杂交I组织原位杂交RNA斑点杂交1.液相杂交重点介绍：一、印迹杂交（一）印迹杂交技术的基本过程：（二）印迹转移的方法（三）印迹杂交的类别及应用1、SoUIhem印迹杂交、2、Northern印迹杂交，二、斑点杂交、狭缝杂交，三、菌落原位杂交、四、组织原位杂交等。一、印迹杂交：（一）印迹杂交技术的基本过程：印迹杂交技术的原理首先由EdwenSouthern在1975年提出。其基本操作过程是：1、核酸的制备；2、电泳：将DNA片段在琼脂糖凝胶中电泳分离；3、变性：置NaOH液中浸泡，从而将凝胶中的DNA变性为单链；4、印迹：利用吸水纸巾的毛
31、细管作用，将单链DNA从凝胶中转移到硝酸纤维素膜上，再将膜置80C烘干并使单链DNA分子固定在膜上；5、预杂交：减少非特异性杂交反应。6、杂交：7、洗膜：8、检测：（二）印迹转移的方法：将凝胶中的核酸片段印迹到滤膜的方法有：1、虹吸印迹法2、电转移印迹法3、真空印迹法1、虹吸印迹法：利用毛细管的虹吸作用由转移缓冲液带动核酸分子转移至滤膜上。电泳后的凝胶T变性T中和一放置一室温转移152Oh漂洗一80七烘烤2h固定核酸2、电转移印迹法：利用电泳作用将凝胶中的DNA转移至滤膜上，是一种快速、简单、高效的转移法，只需几小时，特别适用虹吸转移法不理想的大片段的转移。电转移法使用的滤膜有一定的限制，只能
32、用尼龙膜或化学活化膜，不能用硝酸纤维素膜。因为硝酸纤维素膜结合DNA依赖于高浓度盐溶液，高盐溶液的导电性极强，产生强大的电流，使转移体系的温度急剧升高，破坏DNA。3、真空印迹法：利用真空泵将转移缓冲液从上层容器中通过凝胶抽到卜层真空室中，同时带动核酸分子转移到凝胶卜.面的滤膜上，整个过程只需1小时左右。（三）印迹杂交的类别及应用：1、DNA印迹杂交技术：Southernblotting2、RNA印迹杂交技术：正好与DNA相对应，故被趣称为NorthernblOuing3、蛋白质印迹杂交技术则被称为WeSternbk）IIing。其中最常用的是用抗体来检测，也称为免疫印迹技术（immunobl
33、otting）o1、DNA印迹杂交技术：DNA印迹技术由Southern于1975年创建，称为Southern印迹技术（Southernblotting）0基因组DNAT限制性内切断一DNA变性电泳T印记转移T预杂交一（探针）一杂交洗膜放射自显影或化学显色。2.RNA印迹杂交：这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。RNA的提取TRNA变性电泳印记转移T预杂交-（探针）T杂交T洗膜一放射自显影或化学显色。I）RNA分子较小，不需进行限制性内切醉切割；2）在进样前用甲基氧化汞、乙二醛或甲醛使RNA变性，而不用NaOH,因为它会水解RNA的2羟基基团：3）在转印后不能用低盐缓冲液
34、洗膜，否则RNA会被洗脱；4）在胶中不能加EB,因它为影响RNA与硝酸纤维素膜的结合；5）操作均应避免RNase的污染。二.斑点杂交（Doibloi）:将核酸样品变性后直接点样于滤膜上，烤干或紫外线照射以固定标本，然后与探针进行杂交的方法称斑点杂交或狭缝杂交。斑点印迹为斑点状，狭缝印迹为线状。斑点杂交耗时短，可做半定量分析，一张膜上可同时检测多个样品。多用于病原体基因，如微生物的基因，但也可用于检查人类基因组中的DNA序列。三.菌落原位杂交：菌落原位杂交（COlOnyinSiIUhybridiZaIiOn）是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA。将DNA烘
35、干固定于膜上与32P标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。图2-6检测重组体克隆的第落杂交技术四.组织原位杂交：（一）原理：组织原位杂交（TiSSUeinSiIUhybridiaIiOn）简称原位杂交.指组织或细胞的原位杂交，它与菌落的原位杂交不同。菌落原位杂交需裂解细菌释出DNA,然后进行杂交。而原位杂交是经适当处理后，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交。因此原位杂交可以确定探针的互补序列在胞内的空间位置，这一点具有重要的生物学和病理学意义。（一）应用：1、对致密染色体DNA的原位杂交可用于显示特定的序列的位置；2、对分裂期间核DNA的杂交可研
36、究特定序列在染色质内的功能排布；3、与细胞RNA的杂交可精确分析任何一种RNA在细胞中和组织中的分布；4、原位杂交还是显示细胞亚群分布和动向及病原微生物存在方式和部位的一种重要技术。（三）探针选择：用于原位杂交的探针可以是单链或双链DNA,也可以是RNA探针。通常探针的长度以100400bp为宜，过长则杂交效率减低。最近研究结果表明，寡核甘酸探针（1630bp）能自由出入细菌和组织细胞壁，杂交效率明显高于长探针。因此，寡核甘酸探针和不对称PCR标记的小DNA探针或体外转录标记的RNA探针是组织原位杂交的优选探针。（四）探针的标记：探针的标记物可以是放射性同位素，也可以是非放射性生物素和半抗原等
37、。放射性同位素中，3H和35S最为常用。3H标记的探针半衰期长，成像分辨率高，便于定位，缺点是能量低。35S标记探针活性较高，影像分辨率也较好。32P能量过高，致使产生的影像模糊，不利于确定杂交位点。（五）组织与细胞的固定：原位杂交中，标本的固定条件是影响杂交效率的重要因素，标本组织蛋白质的消化程度对探针进入细胞极为市要。去除蛋白的方法是，用0。2mol1.HQ处理载玻片，用蛋白酶K消化，然后用不同浓度的乙醇脱水，原位杂交还是一种新技术，发展很快，在敏感性、特异性和稳定性上还需要进一步完善和提高。第四节核酸分子杂交实验因素的优化（一）探针的选择:根据不同的杂交实验要求，应选择不同的核酸探针。在
38、大多数情况3可以选择克隆的DNA或CDNA双链探针。但是在有些情况卜,必须选用其它类型的探针如其核甘酸探针和RNA探针。1、检测靶序列上的单个碱基改变时应选用寡核甘酸探针；2、在检测单链靶序列时应选用与其互补的DNA单链探针（通过克隆人M13噬菌体DNA获得）或RNA探针，寡核甘酸探针也可；3、检测复杂的靶核甘酸序列和病原体应选用特异性较强的长的双链DNA探针；4、组织原位杂交应选用寡核甘酸探针和短的PCR标记探针（80150bp）,因为它易透过细胞膜进入胞内或核内。（一）探针的标记方法：在选择探针类型的同时，还需要选择标记方法。探针的标记方法很多，选择什么标记方法主要视个人的习惯和可利用条件
39、而定。但在选择标记方法时，还应考虑实验的要求，如灵敏度和显示方法等。一般认为放射性探针比非放射性探针的灵敏度高。放射性探针的实际灵敏度不依赖于所采用的标记方法，如随机引物延伸法往往得到比缺口平移法更高的比活性。在检测单拷贝基因序列时，应选用标记效率高、显示灵敏的探针标记方法。在对灵敏要求不高时，可采用保存时间长的生物素探针技术和比较稳定的碱性磷酸酶显示系统。（三）探针的浓度：随探针浓度增加，杂交率也增加。在较窄的范围内，随探针浓度增加，敏感性增加。要获得较满意的敏感性,膜杂交中32P标记探针与非放射性标记探针的用量分别为510ngml和251000ngml,而原位杂交中，无论应用何种标记探针，
40、其用量均为0。55。0gm1.探针的任何内在物理特性均不影响其使用浓度，但受不同类型标记物的固相支持物的非特异结合特性的影响。（四）杂交率：传统杂交率分析主要用于DNA复性研究，在这种情况下，探针和靶链在溶液中的浓度相同。现代杂交实验无论在液相杂交还是固相杂交均在探针过剩的条件下进行，此外，固相杂交中靶序列不在液相，故其浓度不能精确计算。（五）杂殳最适温度：杂交技术最重要的因素之一是选择最适的杂交反应温度。若反应温度低于Tm的1015C,碱基顺序高度同源的互补链可形成稳定的双链，错配对减少。若反应温度再低（Tm-30*C）,虽然互补链之间也可形成稳定的双链，但互补碱基配对减少，错配对增多、氢键
41、结合的更弱。如两个同源性在50%左右或更低些的DNA,调整杂交温度可使它们之间的杂交率变化10倍，因此在实验前必须首先确定杂交温度。（六）杂交的严格性：影响杂交体稳定性的因素决定着杂交条件的严格性。一般认为在低于杂交体Tm值251C时杂交最佳，所以首先要根据公式计算杂交体Tm值。通过调节盐浓度、甲酰胺浓度和杂交温度来控制所需的严格性。（七）杂交反应时间：在条件都得到满足的情况下，杂交的成败就取决于保温时间。时间短了，杂交反应不完成：时间长了也无益，会引起非特异结合增多。一般杂交反应要进行20h左右。（八）杂交促进剂：体可用来促进250个碱基以上的探针的杂交率。对单链探针可增加3倍，而对双链探针
42、、随机剪切或随机引物标记的探针可增加高达100倍。而短探针不需用促进剂，因其复杂度低和分子量小，短探针本身的杂交率就高。思考题：1、简述核酸分子杂交的基本原理2、何谓探针？简述探针的分类及各类探针的特点。3、放射性标记与非放射性标记各有何优缺点？4、分子杂交有那些类型？各有何特点？IlI、基因治疗（Genetherapy）（I）,基因治疗基因治疗的概念：基因治疗(geneIheraPy)就是用正常或野生型(WiIdtype)基因矫正或置换致病基因的一种治疗方法。在这种治疗方法中，目的基因被导入到靶细胞(IargeICenS)内，他们或与宿主细胞(hoscell)染色体整合成为宿主遗传物质的一部
43、分，或不与染色体整合而位于染色体外，但都能在细胞中得到表达，起到治疗疾病的作用。目前基因治疗的概念了较大的扩展，凡是采用分子生物学的方法和原理，在核酸水平上开展的疾病治疗方法都可称为基因治疗。随着对疾病本质的深入了解和新的分子生物学方法的不断涌现，基因治疗方法有了较大的发展。发展：EdwardTatumJoshua1.ederberg在60年代曾提出可利用病毒作为基因转移的载体。1989年5月，NIHRosenberg实验室首次开展人体基因转移实验1990年9月，Blease等首次成功地实现了对SCID病人进行基因治疗(腺甘酸脱氨酶缺乏症adenosinedeaminasedeficiency
44、)。近10年来，已有4000?多病人接受这种治疗。一、基因治疗的方式：1、基因置换(genereplacement2、基因修正(genecorreciion)3、基因修饰(geneaugmeniaiion)4、基因失活(geneinaciivaiion5、免疫调节(immuneadjusimeni)基因置换(genereplacement)：基因替换用正常的基因原位替换病变细胞内的致病基因，使细胞内的DNA完全恢复正常状态。这种治疗方法最为理想，但目前由于技术原因尚难达到。基因修复(genecorrection)：基因修正，是指将致病基因的突变碱基序列纠正，而正常部分予以保留。这种基因治疗方式
45、最后也能使致病基因得到完全恢复，操作上要求高，实践中有一定难度。基因修饰(geneaugmeniaiion)：基因补充，又称基因增补，将目的基因导入病变细胞或其它细胞，目的基因的表达产物能修饰缺陷细胞的功能或使原有的某些功能得以加强。在这种治疗方法中，缺陷基因仍然存在于细胞内，目前基因治疗多采用这种方式。如将组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)的基因导入血管内皮细胞并得以表达后，防止经皮冠状动脉成形术诱发的血栓形成。基因失活(geneinactivaiion)：利用反义技术、核酶技术或基因敲除技术(knock-oul)封闭有害基因，能特异地封闭基因表达特性，抑制一些有害基因的表达，已达到治疗疾病的
46、目的。如利用反义RNA、核酶或肽核酸等抑制一些癌基因的表达，抑制肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞的分化。用此技术还可封闭肿痛细胞的耐药基因的表达，增加化疗效果。1)反义核酸技术：用与目的基因或目的基因的mRNA互补的核酸，在复制、转录、翻译水平上抑制目的基因的表达。2)核酶技术：利用核酶的催化活性将mRNA特异地剪切，从而不能承担翻译的模板作用。免疫调节(immuneadjustment)：将抗体、抗原或细胞因子的基因导入病人体内，改变病人免疫状态，达到预防和治疗疾病的目的。如将白细胞介素2导入肿瘤病人体内，提高病人I1.2的水平，激活体内免疫系统的抗肿瘤活性，达到防治肿瘤复发的目的。自杀基因的应
47、用：某些基因的表达产物(酶)能将无毒、或低毒的核甘酸类化合物代谢成特殊中间产物，并进一步生成细胞毒性物而导致细胞死亡。如向肿病细胞中导入单纯疱疹病毒胸背激酶(HSV-TK)基因，然后给予病人无毒性环氧丙甘(gancidovir,GCV)药物，由于只有含HSV-TK基因的细胞才能将GCV转化成有毒的药物。因而肿瘤细胞被杀死，而对正常细胞无影响。HSK-TKHSK-TKCytoTK与dTTP竞争掺入合成DNAGCVGCVMPGCVDPGCVTP-X-DNA基因治疗的分类：1、生殖细胞基因治疗：将正常基因导入患者的生殖细胞，传代，有伦理学问题。2、体细胞基因治疗：将正常基因导入患者的特定组织细胞中，纠正基因缺陷。有两种方式：修复基因的缺陷部位或导入正常基因二、基因治疗的程序：1、目的基因
