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1、HPV基因检测技术研究进展综述摘要宫颈癌是全球第四大威胁女性身体健康的癌症疾病。近几年，宫颈癌高发和低龄化的变化导致了大家的关注。如今，宫颈癌预防的关键是宫颈癌的早诊早治。筛查的意图是辨别与诊治宫颈癌的前驱病变，准确高效地辨别此类异常宫颈病变。如今宫颈癌筛查手段类别繁多，人乳头瘤病毒性别检测技术是如今相对可靠安全的筛查选择。如今，几种先进的人乳头瘤病毒检测技术不仅检测率高，而且安全性好，可是彼此都有相应的限制条件。本篇文章将详细介绍人乳头瘤病毒基因检测技术的进步，以更好的支持其临床治疗。关键词：宫颈癌筛查；HPV基因检测；细胞学检测目录1前言12HPV及其致病机制12.IHPV概述12.2HP
2、V流行病学12. 3HPV致病机制23HPV基因检测技术及其研究进展32.1 细胞学检测方法33. 2基于DNA检测方法43.3基于RNA检测方法54总结5参考文献61前言宫颈癌是全球第四大威胁女性身体健康的癌症疾病，宫颈癌的发病率只低于乳腺癌，严重危害着世界上女性的生命与健康。近几年，宫颈癌渐渐趋向年轻化不断引发人们的注意。而如今在中国，宫颈癌的病发率每年都呈上涨趋势。宫颈癌的出现来自宫颈上皮内瘤变，为早日看出无明显症状女性的高级别病灶，必须进行关于宫颈癌的筛检，以预防其成长成浸润性疾病。而HPV基因检测技术的研究工作是展开宫颈癌筛查的实践方法，必须医学研究者多加注意，那么本篇文章就会对HP
3、V基因检测技术及其研究进展进行综合叙述，希望能为医务工作者的研究提供便利。2 HPV及其致病机制2.1 HPV概述HPV属于乳头瘤病毒科乳头瘤病毒属，它是一种球形、没有包膜的小环状双链DNA病毒。到如今为止，医学研究者已剥离和鉴别了200多种类型的人乳头瘤病毒，能够把其按照病原性的差异分成高风险与低风险类型。高风险HPV和一部分头颈肿瘤、外阴癌、阴茎癌、阴道癌等有关，还与宫颈癌的出现有紧密联系。主要的传播方式是性传播，在发生性行为后，男性生殖器感染HPV的概率比女性要高，但因HPV持续存在的几率较小而罹患癌症风险极低，但是由于女性宫颈和阴道的生理结构，病毒更易滋生，因此相较于男性更易感染HPV
4、,女性在HPV感染后的临床症状表现为宫颈部位发生病变，例如白带变多、不规律出血、宫颈糜烂和腹痛等。按照全世界妇科癌症发病率计算，宫颈癌位列第四名，另外值得关注的是，其中大于60%的病人源自南非和拉丁美洲等落后国家。2.2 HPV流行病学人乳头瘤病毒是一种相对多见的DNA病毒，在人群里普遍传播。因为其自限性，很多人乳头瘤病毒感染不能产生症状。所以，其流行病学很难完全了解。迄今为止，流行病学探索表明，大家普遍容易感染多种类型的人乳头瘤病毒，性活跃的年轻群体最有可能感染人乳头瘤病毒。如今，关键传染源源于人乳头瘤病毒患者及其携带者，重点传播渠道是性接触。近些年，人乳头瘤病毒感染人数大幅提升，并表现出显
5、著增长的趋势，特别是在青年群体中H1.中国20世纪70年代到今天的全国死因研究表明，与1990年至1992年与1973年至1975年相比，2004年至2005年中国女性癌症患者死于宫颈癌的比例有暂时降低。可2012年中国恶性肿瘤发病率和死亡率分析报告显示，因为宫颈癌形成的死亡率每年都会增长8.1%。另一方面，2018年在全世界新增宫颈癌大概有56.9万例，涵盖了约31.1万的死亡病例，84%的死亡病例出现在经济滞后国家。预估在2030年这一比重将上升到98%15】。遵循中国癌症中心颁布的资讯，近些年宫颈癌每年的发病增长率到达了8.7%o此外，按照最新的研究报告，在我国东部地区，特别是中西部地区
6、，宫颈癌死亡率持续提升，死亡率依旧很高，可相比过去已经有了显著的减少。2.3 HPV致病机制HPV基因根据各种DNA序列调控作用的区别，可以将HPV基因分成上游调控区、早、晚期区。上游调控区涵盖一个顺式调控单元以及人乳头瘤病毒的复制起始，担负调控病毒基因的拷贝以及转录开始；早期调控区可以编码早期蛋白质EI-E2、E4-E7,经过影响DNA拷贝，RNA转录以及蛋白质翻译的经过，涉及人乳头瘤病毒的全体生命周期；晚期调控区担负编码晚期蛋白1.l与1.2,就是病毒的外壳蛋白，病毒的外壳蛋白是病毒包装、细胞表面吸附、细胞质入侵的主要蛋白。对人乳头瘤病毒来说，蛋白El-E2、E4-E7是增殖和繁殖的非常重
7、要的作用蛋白。经过认清这些蛋白质的详细作用，去清楚人乳头瘤病毒基因的致病原因。E2蛋白在人乳头瘤病毒基因转录的各个阶段实施对应的调控功能。当病毒寄生并开始与被寄生者基因组结合的时候，E2蛋白可以特异性识别且融合E2BS,进而引起特异性蛋白SPl与TATA结合蛋白TBP的易位，以此压制病毒转移的经过。相应的研究报道显示，当将E2基因导入宫颈癌细胞SiHa中后，癌细胞数量因此明显下降，说明癌细胞的发展受到抑制；另一方面有探索发现，在和被寄生者基因组组合的癌细胞里，E2基因在甲基化状态，表明当E2基因甲基化而无法起到功能的时候，癌细胞才可以稳定裂变，表示了E2蛋白对人乳头瘤病毒转移的阻碍功能网。E5
8、蛋白在持续人乳头瘤病毒感染经过中发挥持续和介导免疫缺陷的功能。在病毒与宿主细胞基因组整合后，细胞内受体酪氨酸激酶（Met）的表达被E5蛋白上调，从而维持病毒复制和转录过程延续其生命周期。当外源DNA入侵女性自身免疫系统时，宫颈上皮细胞会发生应激反应，在基底层发生分裂并迅速凋亡、脱落，从而尽量减小病毒对人体带来的危害。E5蛋白的关键功能是增加环氧化酶-2的表达，在促凋亡有关的Bax基因的降解中发挥用处，并激活表皮生长因子受体EGFR,减缓基底细胞的分离与分裂，保证病毒可以继续穿透有色的宫颈上皮细胞。在介导免疫反应方面，高危险人乳头瘤病毒感染早期的宿主自身免疫能够形成很多CD8+T细胞。CD8+T
9、细胞是拥有特殊辨识肿瘤细胞功能的T细胞。辨识肿瘤细胞外观最重要的组织相容性复合MHC分子引起肿瘤细胞死亡，而E5蛋白拥有疏水区，可以和MHC分子的重链有交互功能，使E5蛋白的疏水区变成MHC的抗原代表，导致被寄生者免疫反应减弱。E5蛋白介导被寄生者免疫反应并降低宿主抗病毒能力。E6和E7蛋白是重要的致癌原因。E6和E7蛋白在感染细胞的部位会影响其致病水平。在它出现在受感染细胞的细胞质中时，不能引发其恶性转变，可在出现在被寄生者细胞核中时它们能诱导人乳头瘤病毒阳性癌细胞的恶性表型。由探索发现，在E6蛋白的竣基端有一个PDZ结合基序。E6蛋白能运用PBM和PDZ蛋白的交互，推动病毒进入细胞中，进而
10、诱发感染，可以深入的把人乳头瘤病毒、E6蛋白融合到降解p53基因，还可以用肿瘤抑制基因PRb当做结合靶点，阻碍肿瘤细胞死亡。3 HPV基因检测技术及其研究进展人乳头瘤病毒基因的实验室检测办法有非常多，重点分为三种:细胞学检测办法、DNA检测办法和RNA检测办法。3.1 细胞学检测方法细胞学检测办法是拭子和液基细胞学等检验手段。它还能够经过检测脱落子宫细胞中的单克隆人乳头瘤病毒1.I蛋白抗体来确定病人是不是感染了人乳头瘤病毒病毒。它适合在临床方面进行普查，这种检验手段的特征是：特异性高，实行方便简单，可灵敏程度比较差，总体检验效率不高，成本低，无法完成人乳头瘤病毒分型”叫但是，目前随着人工智能的
11、不断发展，Al辅助细胞学检测已经获得了较大进展,通过研究发现,在一样的情况下，人工智能辅助测量的灵敏度（相对敏感性1.01,95%CI:0.97-1.05）宛如细胞学学家，并且AI辅助阅读的特异性甚至高于细胞学专家（相对特异性1.26,95%CI:1.20-1.32）o在将来,人工智能支持的检测可以在极大层面上杜绝细胞学检测的缺点。3.2 基于DNA检测方法人乳头瘤病毒DNA检测的基础原理是基于相补互配的原理，运用探针与病毒基因序列的特异性结合，对于人乳头瘤病毒基因组上存在的特异性序列的引物或探针设计。选择PCR增殖的方式取得预计的段落，然后开展定性或定量检测。和以往的检验手段对比，DNA检验
12、拥有很高的灵活性和特殊性，并可以达成人乳头瘤病毒分型，可也有个问题，就算是在寄生宫颈细胞中检测到人乳头瘤病毒DNA片段，也仅仅是表示有病毒存在，不表示有宫颈病变。截止今日，人乳头瘤病毒DNA检验的手段有很多，各种手段都是有利有弊的U1.（1）芯片杂交技术是先用酶标记人乳头瘤病毒靶的基因序列，然后将酶标记与固相载体上的样品分子杂交显色，从而在样品上完成各种人乳头瘤病毒亚型的解析。但不足是实施繁杂，容易交叉感染；好处是通量高、速度快的特点。另一方面,AdvanSure与双重巢式PCR是基于PCR展开优化的,基本操作是差不多的，不一样的是引物规划的时候展开多个引物规划，可以达成多种人乳头瘤病毒亚型的
13、检验，这种手段的好处是精确度高，不足的是可能出现感染。（2）数字PCR技术，就是“第三代PCRZ是一种利用数字PCR仪，在缺乏标准曲线的状况下，对分子靶标展开绝对定量检测的科技。它用于特殊的急诊病人。其特征是定量精准，检验的高敏度，可不足的是成本较高，实行比较麻烦等。（3）当下瑞金医院检验科选择了PCR毛细电泳片段分析法进行人乳头瘤病毒检测和基因分型试剂盒，原理是利用多重PCR和毛细电泳技术，针对宫颈细胞的E6、E7、EI基因进行引物设计，将不同HPV型别分类的基因进行PCR扩增及毛细电泳分离，由于不同基因扩增片段的长度不同，毛细电泳后条带的位置也因此不同，这样就能够在一次检测中对多种HPV型
14、别进行同步分型。瑞金人乳头瘤病毒核酸检测和基因分型试剂盒主要用在女性宫颈脱落细胞标本中25种人乳头瘤病毒基因型的体外定性检测。这25种HPV基因型别包括：6、11、16、18、26、31、33、35、39、42、43、44、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、81、82、83等，它可用于临床辅助诊疗，可无法用在宫颈癌筛查的预期用途。好处是操作简单标准，可同时鉴定多个人乳头瘤病毒基因型，定性检测结果重现性好，可普遍应用于临床。不足是采样、运输、储存、加工都有一定的需要。若是未达到前提条件，就会妨碍测试成果。试剂盒的检测结果只提供临床借鉴。还应广泛考虑病人的临床症状或体征和
15、实验室检查的各种状况，并给予最后判断。整体而言,根据DNA的检验手段难以同时具有灵敏度、特异性以及效率成本，在真实临床使用中，必须按照不一样的情况给予对应的抉择，以实现更高效、精准的检测I。3.3 基于RNA检测方法人乳头瘤病毒DNA检测的基本原理类似于人乳头瘤病毒DNA检测，可经过人乳头瘤病毒的致病原因，我们可以看出病毒DNA是经过结合到被寄生者基因组中，经过转移和翻译后起到用处的，因此可以看出，与人乳头瘤病毒mRNA检测比较，人乳头瘤病毒DNA检测在临床上最先更精准地检测出人乳头瘤病毒感染者12O医护研究者对细胞学正常且人乳头瘤病毒mRNA检验出阳性的妇女展开组织学筛检,成果看出了17.3
16、%了5%Cl：16.2-18.4)ClN3+和16.4%(95%CI:15.3-17.5)CIN2+的患者，此外，人乳头瘤病毒mRNA检测与细胞学分别进行，结果显示人乳头瘤病毒mRNA检测的敏感性更高，而细胞学的特异性更高。另外，GRANADOS等人筛选了35岁之内的人乳头瘤病毒mRNA检测阳性的女性群体,发现CIN2+病变的发生率最高，当HPV16/18/45阳性的时候，总体活检表明CIN2+病变的所有病人都是人乳头瘤病毒mRNA阳性。对低度鳞状上皮内和不典型鳞状上皮细胞病变来说,通过HPVmRNA检测的结果比HPVDNA检测的特异性更高,结果相对更加可靠口叫人乳头瘤病毒DNA检测往往更容易
17、实现高敏度，可由总体而言，特异性较差。按照探索成果看出，人乳头瘤病毒E6E7mRNA检测在统计分析中比人乳头瘤病毒DNA检测具有更好的阳性预测值和更厉害的特异性，而且无论是人乳头瘤病毒mRNA检测或是人乳头瘤病毒DNA检测，阳性百分比均跟随病变而改变。此外，经过人乳头瘤病毒mRNA检测的活检成果表示其NHSl1.的特殊性与阳性预测价值显然大于DNA检验。所以，大家能够发现，人乳头瘤病毒mRNA检测与人乳头瘤病毒DNA检测比较具有特殊的好处，具有更好的临床应用价值，HPVmRNA检测可用作临床风险分层I。4总结现阶段，大家已形成较好的日常习惯和早预防、早接种、早发现、早整治的可预防宫颈癌的有效手
18、段。本文阐述了HPV及其致病机制，并归纳总结了近年来研究者在人乳头瘤病毒的检测、预防与治疗上的科研进度，发现虽然研究者在人乳头瘤病毒致病机制的探索方面取得了许多成就，在人乳头瘤病毒的检测和预防方面也有很多有效的方法。然而，因为很多因素，这种疾病依旧给世界各地的很多妇女增添问题。我们需要做的是立足眼前，尽量多的处理问题，让这种疾病尽快从大家的视野中消失。参考文献1黄晓梅.宫颈癌的早期症状及影响因素研究J中国继续医学教育,2018,10(7):79-80.陈万青,郑荣寿,张思维,等.2012年中国恶性肿瘤发病和死亡分析J.中国肿瘤,2016,25(1):1-8.3包鹤龄,刘镉宁,王黎君,等.中国2
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