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1、【技术与干货】PCR异常曲线分析原创胡朝祥让诊断更有价值2024-04-1111:30北京常见异常曲线及可能的原因在做荧光定量PCR的时候，经常有老师需要协助分析实验结果，主要是因为出现了异常情况，为此我们特别总结了一些常见的异常曲线及可能的原因，希望可以帮到大家。判断扩增曲线是否良好的指标衡量标准正常扩增曲线呈S型，分为基线期、指数起始期、指数扩增期和平台期。基线平整且要求拐点清楚，整体平行性好，基线平而无上扬现象。当分析实验结果时发现了异常曲线确认软件设置是否正确对照试剂盒说明书，检查时间、温度、循环数、荧光采集等是否设置正确。02确定耗材是否使用正确耗材对于荧光定量PCR来说比较重要，很
2、多异常的扩增曲线是由于耗材使用不当引起的。常见的耗材相关问题包括：未选择跟仪器加热模块规格匹配的耗材、使用了质量比较差的耗材等。03确定所用试剂是否正常首先要确定试剂是否有效，包括查看试剂是否在有效期内，是否反复冻融多次，运输条件是否正常。04确定实验过程中的操作细节从冰箱冷冻中取出的试剂是否有混匀，如果试剂融化后没有混匀，这时候取出的试剂不是均一的，会影响后面的扩增；还有上机的反应体系里尽量不要有大的气泡，有气泡的话，中间容易形成折射，干扰荧光的采集。二.01内参基因扩增曲线未起或起跳异常原因分析：(1)标本采集不当，没有采到人体细胞。(2)标本保存不当，污染降解。(3)提取失败：提取板加样
3、方向错误、蛋白酶K加错列、样本加错位置或漏加、内标漏加或者加的是否准确、提取仪器故障等。(4)扩增失败：漏分反应液、点错核酸列、选错扩增程序，加模板时吸到有磁珠造成干扰、酒精等消毒剂携带入孔、试剂配制没充分混匀，分装不均匀，有效成分低等。解决方案：(1)检查试剂，更换新试剂，双试剂检测。试剂配制充分混匀，分装准确。(2)重新提取样本。(3)重新采样检测。02整体内标曲线相对离散不集中，各孔高低异常不平原因分析：(1)标本固有的采样误差(一般比较集中)。(2)操作误差：标本加样前没有充分振荡混匀，反应液配制时没有充分混匀。(3)提取仪器故障，提取效率有明显差异。解决方案：(1)重新配制试剂，充分
4、涡旋混匀再加。(2)排查提取仪故障，进行修理。03内标整体扩增曲线明显分层，有高有低原因分析：(1)新配制反应液与旧的剩余反应液联合使用，酶的活性不同。(2)不同批次的PCR八联管联合使用，荧光信号透过强度有区别。(3)不同品牌的提取试剂联合使用，提取效率有区别。(4)同一批点样的核酸放置时间有不同，时间较长的有部分降解。解决方案：(1)不同批次的试剂不要混用，残余反应液丢弃或者做好标记，不要混用。(2)耗材尽量同批次，发现异常排查耗材情况，是否因耗材跟换导致。(3)不同品牌的试剂不混用。04PCR扩增抑制原因分析：存在扩增抑制。解决方案：将样本稀释后进行扩增(抑制物的影响可通过稀释样本消除)
5、。05荧光定量PCR实睑结果中无Ct值出现原因分析：(1)PCR参数设置错误：在设计循环参数时没有设置荧光信号采集。(2)模板降解：避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。(3)引物或者探针降解：可通过PAGE电泳检测其完整性。(4)电脑设置了自动休眠。解决方案：按照原因分析进行一一核查，对症处理。06斜直线型扩增曲线原因分析：(1)分液不准确，检查检测后的反应管可发现管内的PCR反应液量明显少于正常管。(2)反应管气密性差，反应过程中溶液蒸发引起探针浓度增加，导致曲线呈斜直线状。解决方案：(1)分液均匀，上机前检查八连管液面是否在同一水平线上(2)八连管盖盖严，上机前检查是否有缝隙。07扩
6、增曲线末尾起跳PCR实验结果中有曲线出现末尾起跳但是没有完整扩增的现象。原因分析：(1)阴参曲线末尾起跳，通常表示存在污染。(2)复检样本，排除非特异性扩增的可能性。(3)正常样本也可存在曲线末尾起跳，表示样本浓度低或者加样量不准确。(4)实验室或者样本中存在定植菌，如曲霉菌。解决方案：(1)排除是否存在污染。(2)排除污染原因后复检样本，如果复检后曲线为阴性直线则说明之前的未尾起跳为非特异性扩增，如果复检后曲线仍与之前一致则说明末尾起跳表示该样本中待检病毒核酸的浓度偏低。(3)常见定植菌如曲霉菌，此情况可以直接判阴性。08山域型曲线原因分析：严重的蒸发会呈现先上升后下降的曲线，轻微的蒸发会是一种缓慢的上升，这两类异常的曲线可以看一下检测后的反应管液面是否有下降的现象来证明。解决方案:上机检测前检查八连管管盖，保证无缝隙后上机扩增。
