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1、腺病毒载体操作手册一、试验流程制备腺病毒穿梭质粒，分别高纯度无内毒素抽提腺病毒穿梭质粒和骨架质粒，共转染293A细胞，转染后6h更换为完全培育基，培育十几天，在中间四五天左右更换一次新奇培育基，然后收集细胞和ImI培液置于15ml离心管后，液氮/37度冻融三次(冻-融要彻底)，200OrPm离心5分钟，取上清即为病毒液初代原液。连续三代反复扩增收集病毒后，行病毒的大量扩增，然后通过CSCl密度梯度离心透析联用法纯化病毒。二、试验材料(-)腺病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为两质粒系统，组成为穿梭质粒(包括pHBAd-CMV-IRES-GFP,pHBAd-CMV-IRES-RFP,pHBA
2、d-U6-GFP,pHBAd-U6-RFP)和骨架质粒pBHGIox(delta)E1,3Creo其中穿梭质粒pHBAd-CMV-IRES-GFP和pHBAd-U6-GFP能表达绿色荧光蛋白(GFP)OpHBAd-CMV-IRES-RFPPHBAd-U6RFP能表达红色荧光蛋白(RFP)。1、载体信息1)腺病毒克隆载体图谱如下：SacU/xbal(45NotI)(731)Amp，/oRK742),(NddRSNM)I/(NdeD一(NCOI)IINhcKl384),4pHBAd-U6AcaIISacIIIXbal(456)Notl)rALirA呷/=；/(NdCl7A，5)(NO(I)(-YI
3、INheI(1384)pHBd-U64lFPY噜RjcIRjK/CMVhitZZr町/XEcoRlAmpr/、BgID，*wSPHBAd-MCMV.RFPJBr5337bpNhefV:奢pUCAgelI,、pSV4OPoIyAc,a,各载体用途如下表:腺病毒载体名称干扰pHBAd-U6-GFP,pHBAd-6-RFP过表达PHBAd-CMV-IRES-GFP,PHBAd-CMV-IRES-RFP标记示踪PHBAd-CMV-IRES-GFP,PHBAd-CMV-IRES-RFP,pHBAd-6-GFP,pHBAd-U6-RFP2)骨架质粒信息如下：SV40ANICreHCMVIE1.ampIox
4、P4p,xpBHGIox(delta)Elz3Cre34707bp2、细胞株293A,腺病毒的包装细胞，为贴壁依靠型成上皮样细胞,经培育生长增殖形成单层细胞,生长培育基为DMEM(含10%FBS)o3、菌株大肠杆菌菌株DH5o用于扩增腺病毒载体和腺病毒骨架载体质粒。三、包装细胞293A细胞的培育(-)293A细胞的冻存293A细胞来源于一个用作空斑测定的亚克隆，具有易使用和易转染的特性。该细胞株对于高细胞密度很敏感，当细胞超过70%汇合时，一些细胞可能会丢失它们的表型。若细胞密度持续在70%以下，QBI293A细胞则能连续培育34个月维持原有细胞特性。若以购买得到的293A作为第一代，则30代
5、内能得到最佳结果。随着传代的次数增加，293A细胞会消失生长状态下降、突变等。为了防止此类现象的消失，我们需要在开头就对细胞进行大量冻存，以保证明验的稳定性和持续性。在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。1、去掉上清液，加入PBS洗去残留的培育基；2、加入0.25%的胰酶，消化12min后，镜下观看细胞变圆，细胞间间隙加大时，去除胰酶，加入新奇培育基吹打混匀，移入离心管中。3、细胞计数，将细胞全部晃下，加入3mL37预热的10%DMEM,用WmL移液管进行吹打，较大力吹打6-8次即可，不留死角，之后，将全部细胞吸出，置于15mL离心管中，取50ul混匀后的细胞于1BmLeppendor
6、f管中，力口入450ul10%DMEM,即为10倍稀释，混匀，取Wul细胞于计数板中计数。计数板上共4大格，每大格16小格。计数时，4大格均计数，总数除以4（得每大格细胞数），再乘以10（10倍稀释），即为实际n万mL细胞浓度。4、细胞离心，IoOOrPm,5min0去掉上清。5、依据细胞计数结果加入细胞冻存液（70%完全培育基20%FBS+10%DMSO),重悬细胞，密度为3x106个mL6、分装进细胞冻存管，放入冻存盒中，放入-80超低温冰箱。7、其次天将细胞放于液氮罐中长期保存，并作纪录。保存过程中，要不时复苏细胞检测细胞存活率，观看细胞状态等。（二）293A细胞的传代当细胞生长到汇合率
7、达到80%90%时需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。1、消化细胞，方法同细胞冻存。2、细胞离心结束后，加入完全培育基重悬。3、依据具体状况，将细胞分到IoCm培育皿中，每个培育皿补足到IOml培育基。4、将培育皿平稳放回37、5%CO2和95%相对湿度的培育箱中培育。（）293A细胞的复苏当细胞传代次数过多，细胞状态变差时，或者细胞消失污染事故时，需要丢弃并对最初冻存的细胞进行复苏。1、设置温度为3742C的水浴。2、查看细胞库纪录，依据纪录从液氮罐中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），快速丢入水浴锅中并快速晃动，尽量在1-2min内使细胞溶液完全溶解。3
8、、将细胞溶液转移到15ml离心管中，并在其中加上Iml新奇的完全培育基，混匀后离心，IOOorPm,5mio4、去掉上清，加入5ml新奇的完全培育基，混匀沉淀后，转入6cm培育皿。5、将培育皿平稳放入37、5%CO2和95%相对湿度的培育箱中培育。6、其次天观看细胞存活率。给细胞换一下培育基。以后每天观看细胞生长状况。四、腺病毒包装、扩增和纯化（-）腺病毒包装事先预备好用于包装病毒的293A细胞和病毒质粒，转染每个直径为6cm的培育皿complex成分如下：穿梭质粒2gp-BHG（delta）E1,3ere4gOptiMEM需在37度水浴中预热，LiPOfiterTM转染试剂需恢复至室温方可使
9、用，使用前需摇匀。转染后6h换新奇培液。注：LiPOfiterTM转染试剂为汉恒生物产品，使用说明参考LiPOfiterTM说明书。转染前细胞必需处于良好的生长状态。病毒试验带有肯定的危急性，为了您的平安和健康，请穿试验服并戴一次性手套，在生物平安柜里进行试验操作。（-）病毒收集病毒收集前要观看病毒空斑是否形成，为限制病毒的集中及空斑更好的形成，通常在培育液中加入琼脂糖，感染后7天左右可以在显微镜下看到小的空斑，一般在10至21天内形成，空斑形成后连着琼脂糖一起将空斑挑起，放入新奇培育基中过夜。（三）病毒扩增其次天，将培育基中病毒加入新奇293A细胞培育液中进行病毒少量扩增。至细胞再次消失空斑
10、，收集细胞及上清，反复冻融三次收集病毒，以此病毒为P1代病毒，以P1代腺病毒感染293A细胞，连续进行三代感染，至P4代进行腺病毒的大量扩增，待空斑形成后收集病毒并对病毒进行体外纯化和浓缩。（四）病毒纯化病毒纯化采纳CSCl密度梯度离心-透析联用法纯化病毒，CSCI梯度的制备方法如下：加入2.0ml密度为1.40gml的CSCl溶液（溶剂同上），然后缓慢加入3.0ml密度为1.30gml的CSeI溶液，再加入5ml的病毒悬浮液。20000rpm,室温离心2小时。收集密度在1.30gml和1.40gml之间的病毒条带至透析袋中（透析袋使用前用IomM的EDTANaz煮沸Iomin）。在透析缓冲液
11、（50g蔗糖,10mlIMTris-HCI,PH8.0,2ml1MMgCL定容至IL）中，4搅拌透析过夜，中间换一次透析液。收集病毒，测定病毒滴度。（五）病毒重悬和保存500UIPBS重悬病毒沉淀，一周内使用则置于4度冰箱保存，如需长时间存放需置于80度甚至液氮保存。五、感染目的细胞由于不同细胞的MOI不同，所以在将病毒感染正式感染目的细胞前，需要做一个预试验以确定目的细胞中加入的病毒数。(-)细胞预备将状态良好的目的细胞接种到24孔板,使细胞浓度为1105ml细胞，接种细胞数量因细胞的生长速度而略有不同，一般是保证其次天进行病毒感染的时候细胞汇合率介于50%至70%直接。(二)病毒感染Lpo
12、lybrene的选择：POlybrene:是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高腺病毒对细胞的感染效率，通常加入polybrene能提高感染效率210倍。POlybrene有肯定的细胞毒性，有的细胞对polybrene的毒理反应明显，因此细胞感染时是否适合PoIybrene需要摸索；不同细胞对POlybrene的敏感度不同，可以用110gml的范围筛选合适的浓度，以24h内细胞无明显毒性反应为佳，可参考文献并进行预试验摸索，polybrene最常用的工作浓度为58gml注：1）汉恒生物的自产的Polybrene产品，用户可用以进行帮助感染。供应的Polybrene母液保存在-20C（可
13、保存1年以上），避开反复冻融3次以上，否则活性受影响。4C可保存2周。2）Polybrene预试验请先以对比病毒进行摸索，大部分腺病毒感染的细胞可不加Polybrene即获得很高转染效率。具体状况以预试验结果为准！2.感染细胞最佳MOI的测定MOI（MultiplicityOflnfection,感染复数）是指每个细胞感染的病毒数。通常MOI越高，腺病毒感染后宿主细胞内保留的腺病毒基因组数量以及目的蛋白的表达量越高。腺病毒对于不同种类不同来源的细胞，其最适MOI各有差别，原则上最适MOI是感染效率较好的最低MOL原则上每种细胞对应每种类型的病毒都应当进行最适MOI摸索试验，设置MOI梯度摸索试
14、验，选择适合的MOl进行试验。MOl一般以1：3：5或者1:3:10进行梯度摸索，一般的细胞基础腺病毒感染Mol可以10为开头，即10,30,50或者10,30,100oMOI对应病毒体积的换算转染时细胞数（一般以传代计数细胞数X2计算）XMOI=病毒个数；则加入的病毒体积数=病毒个数/病毒滴度。例子：转染细胞数为105个，MOl为100,则需要病毒的个数为1。7个，病毒假如滴度为PFUml,则需要加入的病毒体积为107/（1010PFml）=10-3ml=1uL同理,300,500相应为3ul,5uo具体的细胞数/MOU病毒体积换算参见附1孽格（三）I、贴壁细胞感染试验分为两组，分别添加相应
15、腺体病毒载体和等滴度同体积的对比病毒载体，1/2体积培育液感染（详见下表格）。加入的病毒量范围推举MOl为二10,30,100,300,500内，每个MOl值加两个孔。对于增殖力量较弱的细胞，比如特殊是一些原代细胞如神经元、心肌细胞，1/2体积感染2小时足够，2小时后只换成新奇培液。对于增殖力量较强的细胞，如BMSC（骨髓间充质干细胞），1/2体积感染2小时后，不换液，而是追加1/2新奇培液，连续37度感染过夜，有利于提高感染效率。对于Polybrene适用的细胞，1/2体积感染的培液中，polybrene浓度为固定值（58ugml）；如2小时后停止感染置换新奇培液，则无需再加入POIybre
16、ne（针对上述增殖力量弱的细胞）；如2小时1/2体积感染后连续追加培液感染过夜，则补充的新奇培液中要含有等终浓度的Polybreneo病毒小培育体积感染表培育皿类型表面积cm2对应细胞培育液体积病毒感染对应细胞培育液体积96-well0.3cm2100ul50ul24-well2cm2500ul250ul12well4cm21ml500ul6-well10cm22ml1ml60mm20cm24ml2ml100mm60cm210ml5ml慢病毒感染4小时后未卜足至培育体积，是&染24小时后换液，腺病理堂感染2小时后直接换液Ik悬浮细胞上面介绍的是针对贴壁细胞的感染方法，若是悬浮或半悬浮细胞，则需
17、要通过平角离心转染法，即将适量的病毒液加入细胞培育板后（感染体系同贴壁细胞中病毒小培育体积感染表），封好口，放入平角离心机后，低速（90Og150Og）离心1h,然后放入培育箱中连续培育感染1小时即可，这样总共感染了2小时。若由于试验条件有限，没有平角离心机，可用离心管代替，将细胞吹打吸入离心管中，进行低速离心，去掉大部分上清，然后加入适量的病毒液，室温放置IOmin（不能超过半小时），然后将细胞和病毒液同时吸出转入培育皿中连续病毒感染至2小时后换液即可。注：悬浮细胞离心感染1小时+离心后37度小体积感染1小时，一般直置换新奇培液。对于少数感染效果较差的悬浮细胞，追加1/2新奇培液持续感染过夜
18、也有助于提高感染效率，但要留意不能影响细胞状态，具体步骤以试验摸索结果为准。POIybrene的使用事项同样适用于悬浮细胞。（）观看感染状况感染24小时后，可以开头观看到GFP/RFP表达（只对于有GFP/RFP独立表达框的腺病毒载体），过表达和干扰的感染时间以36-48小时试验为最佳。六、动物试验例子：小鼠尾静脉注射将纯化过的腺病毒以每只小鼠15109毒量注射，比如纯化腺病毒滴度为IXlowPFU,则每只小鼠注射体积约为1050ul0具体的注射量需要试验摸索，留意注射体积不要超过200ul,最好掌握在IoOUl以下，注射剂量过多，也会发生充血性心衰。其他病毒动物试验可与我们的动物试验工程师沟
19、通细节寻求关心。汉恒生物腺病毒感染复数(MoD与体积对应表规格大约数目MoI值加入病毒数量腺病毒MOI摸索时的体积梯度/Ul96well2-510450-1001-51060.1；0.3；148well1-210550-1000.5-2X1070.5-2ul0.5；2；624well2-310550-1001-31071-3ul1;3；1012well510550-1002.5-51072.5-5ul2.5；7.5；256well1-210650-1000.5-2X1085-20ul5；15；5035mmdish1-210650-1000.5-2W85-20ul5：15；5060mmdish2
20、-410650-1001-410810-40ul10；30；100IOOmmdish6-1010650-1003-1010830-80ul30；100；300150mmdish1-210750-1000.5-2X10950-200ul60；180；600腺病毒滴度以IOlo/ml为准，其他流度需相应换算；大约细胞数目是依据80%Io0%细胞密度估算而出，具体细胞数请种细胞时进行细胞计数。注:1)24板长满了细胞大约有3X105个细胞。假如一天后要长到70%(2.1105),建议1.21.4X105个细胞。由于细胞刚放进去的前几个小时需要粘在生长表面及适应新的生长条件，不会达到24小时翻一倍的速
21、度。其他规格培育可参照此确定相应CUltUre细胞量。2)Mol值：MOI是multiplicityOfinfeCtiOn的缩写，中文译为感染复数,实际的含义即为每个细胞被多少个有活力病毒所感染。各种细胞的最适MOl值有差别，请客户正式试验前先进行预试验摸索最适MolO腺病毒慢病毒逆转录病毒感染方式直接加入直接加入直接加入换液时间感染后2h感染后24h感染后24h是否需要筛选不需要，腺病毒感染力量很强需要筛选获得稳定感染株，慢病毒的感染力量不强需要筛选获得稳定感染株，逆转录病毒的感染力量不强观看时间如带有GFP等荧光标签，24h后可观看到荧光，36h可达到表达高峰，若不带有荧光标签，则需要鉴定
22、带有GFP等荧光标签，24h后可以观看到表达，36h达到高峰，若不带有荧光标签，则不行直接观看到，需要鉴定带有GFP等荧光标签，24h后可以观看到表达，36h达到高峰，若不带有荧光标签，则不行直接观看到，需要鉴定是否需要助转剂不需要有时需要，但是依据具体状况操作，由于助转剂，如polybrene,对细胞的损害比较大，有的细胞可能承受不r有时需要，但是依据具体状况操作，由于助转剂，如polybrene,对细胞的损害比较大，有的细胞可能承受不了腺病毒慢病毒逆转录病毒感染方式直接加入直接加入直接加入换液时间感染后2h感染后24h感染后24h是否需要筛选不需要，腺病毒感染力量很强需要筛选获得稳定感染株
23、，慢病毒的感染力量不强需要筛选获得稳定感染株，逆转录病毒的感染力量不强观看时间如带有GFP等荧光标签，24h后可观看到荧光，36h可达到表达高峰，若不带有荧光标签，则需要鉴定带有GFP等荧光标签，24h后可以观看到表达，36h达到高峰，若不带有荧光标签，则不行直接观看到，需要鉴定带有GFP等荧光标签，24h后可以观看到表达，36h达到高峰，若不带有荧光标签，则不行直接观看到，需要鉴定是否需要助转剂不需要有时需要，但是依据具体状况操作，由于助转剂，如polybrene,对细胞的损害比较大，有的细胞可能承受不r有时需要，但是依据具体状况操作，由于助转剂，如polybrene,对细胞的损害比较大，有
24、的细胞可能承受不了腺病毒慢病毒过表达干扰过表达感染目的序列获得35天24天目的序列获得35天24天穿梭质粒构建312天372天重组表达质粒构建812天812天质粒重组5T0天510天慢病毒包装5T0天510天腺病毒包装1215天1215天病毒浓缩（可选）12天12天大量扩增1215天1215天滴度测定35天35天纯化（可选）14-21天14-21天目的细胞感染，筛选14天14天滴度测定35天35天过表达/干扰效率验证3天3天时间总计52-83天5182天时间总计37-49天3648天附5：动物试验对腺病毒和慢病毒的要求及实现方式腺病毒慢病毒是否需要纯化及方法需要纯化，纯化方法：CSCl梯度离心不需要纯化是否需要浓缩及浓缩方法纯化之前需要浓缩，PEG8000沉降法需要浓缩，浓缩方法：超速离心法或PEG8000沉淀法。实现方式注射注射
