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1、ICS07.140CCSA92三中华人民共和国国家标准GB/T436362024法庭科学DNA二代测序检验规范ForensicsciencesSpecificationsfornextgenerationsequencing-basedDNAexamination2024-03-15发布2024-10-01实也国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会目次1 范视I2规范性引用文件I3术语和定义、细略语I4总体要求35原理36寄材和试剂47检验旅程48数据分析59遗传参数计算8附录A（资料性）法庭科学DNA：代测摩梭也记北叔9参考文峨17本文件按照GB1.1-2020C标准化工作导则第1部分：标
2、准化文件的结构和起草6糕的规定起草.请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的货任.本文件由中华人民共和国公安部提出.本文件由全国刑事技术标准化技术委员会(SACZrC179)归口.本文件起草单位：公安部鉴定中心、四川大学、中国医学科学院阜外医院、广东省公安厅、中央军委政法委员会侦杳技术中心、中国政法大学、北京生物医药研究所，本文件主要起草人：叶健、李安全、王乐、康克莱、侯一平、周洲、张驰、李春燕、刘?修、张r峰、汤捌、袁明、岐文中、赵杰.法庭科学DNA二代涌序检验规范1范Bl木文件煨定了利用二代测序技术进行法庭科学人类DNA遗传标记把向洌序检的的以体要求以及检验器材
3、和试剂、检聆流程、数据分析、遗传参数计算的基本要求.本文件适用于从事法庭科学人类遗传标记检验的实验室和产品IM造商针对人类生物检材与样本的STRSNP1InDeI等遗传标记以及线粒体DNA进行二代测序枪将分析.2艘范性引用文件下列文件中的内容诩过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款，其中.注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件：不注日期的引用文件，其赋新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GH/T27025检测和校准实验室能力的通用要求GB/T43633法耻科学DNA实验空建设规范GlVT43635法庭科学DNA实货室检验规范3*i三*4m*3.1 *X下列术谱和定义适用于本
4、文件。11.1DNADNAsequencing对DNA分子的核件酸桂列顺序的测定,即测定祖成核酸分子的腺空分（八）、鸟嗯畛(G)、胞吨呢(C)和阳腺唏咤(T)的排列顺序.X1.2二代IH序nextgenerationscquencing;NGS区别于传统Sanger(W脱1.链终止法)测序，能够次并行对大量核酸分子进行序列测定的技术，11.3IBWFtargetedSequeneing针对特定基因案或她因找区域内已知和新曲变异进行的测序.11.4密式PeRbridgepolymeraseChainreaction单燧文库DNAi端序列与芯片表向固定的磔核甘酸特异性结合.当连接片段的另一端泻曲,
5、与芯片灰面固定的另条互补赛核讣酸形成桥”.以文沐DNA为模板进行扩增的反应.X1.6乳化PCRemulsionpolymerasechainreaction将用于ECR扩增的水相体系与油相体系混合，形成大盘油包水的微汽液独立PCR扩地空间,在其中扩增得到大盘相同来源扩增产物的反应.11.6DNAMjmtDNAniinobll;DNB在二代测序的模板扩增过程中,先将DNA进行片段化处理,加接头序列和环化形成单蟋坏状DNA.然精通过浪环扩增将单链环状DNA扩埔23个数后汲收终产生的产物.11.7单次潴序singlerunsequencing测序仪落运行一个测序流程.如一次的向测序或一次双向测序的行
6、为.来源：GB/T309892014.3.20*1.8文JtUbrary通过生物来源的、人I.合成的或克隆技术等所得到的一个型建分子群.注r例如;墟H文库.互补DNA文库.噬语体履示肽文军等。来源：GBT30三-2014,3.5,有修改&1.9接头adapter用于标记和固定特测序片段的小段已知序列的DNA片段.3. 1.10筌index条码barcode一段特征性的脱氧核件酸短片段,在多样本混合榜测时，充当识别特定样本来源的唯一标志.X1.ll测序通量sequencingthroughput单次测序可获得序列信息的底因片段数状或可测定的脱气核糖核酸和核糖核酸（以喊期表示）数fit.来源：GB
7、/T309892014,3.21a1.12测序读长readlengthofsequencing测序能测得的最长IWA片段的长度。注：通常以喇考数表示.来源：GB/T3O9892014.3.21,育修改3.1.13，序SUEdepthofsequencing待测样本中某个指定的核仃酸或某条指定的序列被检测的次数，1来源：GB/T309892014,3.31,有修软a1.14MUIiRJMiEM*accuracyofbasecalling班次测序正确理基数占可识别做琏总数的比例.来源：GB/T30989-2014,3.27,有修改I1.lSMXiRSMrai*inaccuracyofbasecal
8、ling单次测序错误碱基数占可识别碱基总数的比例,j轼基识别正倚率（3.H）相对.来陶GB/T30989-2014,3.28.ftf31.lMqkrsimi(VBIityOfbCaniDg衡麻碱基正确识别的概率.通常以数字值直接表示,麟基识别质精:与碱基识别错误率之间的关系可用式(1)我示：Q=-IO-IgP(I)式中：Q一世堪识别质价：P一减基识别错误率.来源：GR/T30989-203.29,有修改J&1.1T分析诩值nalyticalthreshold能将检测到的估号与基线噪声进行可靠区分的最低测序深度(占比).12甯下列缩珞语适用于本文件.DN:脱氧核助核酸(DeOXyribOnUCl
9、eiCAcid)DNB:DNA纳米球(DNANanoball)InDeI:插入或玦失(InsenionDeletion)NGS:代测序(NeXtGenenilionSequencing)PCR:聚合酹锥式反应(PoIymEiseChainReaction)SNP:单核昔酸多态性(SingleNuclectidePolymorphism)SIR:短串联重更序列(ShortIandcmRepeat)4总体要求1.1 实脸室建设应符合GB/T43633(法庭科学DNA实脸室建设规范)的要求。1.2 实聆人员应熟:悉并掌握基丁二代刈序进行法庭科学遗传标记检船的原理和方法，并能正确使用分析软件对测序结果
10、进行分析与评价.1.3 实验室应有完备的文书体系.准确、清晰、完整地记录实验流程和结果.相关格式参见附录A.原始记录、报告等应归档留存，保证其具有可追溯性，1.4 实脸室的环境与设施应符合GB/T27025的要求，实脸室应设置文库构建区、核酸定量区.为了有效防止DNA污染，实验空应设置分隔独立的工作区域进行PCR扩增前帙作(试剂配制、样本洌;等)和后续PCR扩增、测序分析等检验操作,并标识区分不同工作区.检物流程应单向流动.必要时实现人员的单向流动，所有实龄操作应在规定区域进行.5 *3将生物检材或样本制备成待测样品，通过桥式PCR、乳化PCR或DNA纳米球扩增等PCR扩增技术,将待测样品限放
11、大，并收集成文席，然后进行平行循环测序，利用边合成边测序的策略,加入一种或多种带标记或不带标记的底物核甘酸，在聚合陶的作用卜,按照俄君”.补配对原则，进行DNA琏的延仲，延伸一轮测取一轮底物与模板结合后发出的信号，包括荧光信号、电信号或半导体芯片检测的离子信号等,收集该信号并确定所测位点的碱基信息.当上一轮测序完成后,揖史测序过程,即实现大规模并行茶因测序.6 111mo&i三M6.1.1 对于采用的检验潺材和试剂等产品应按照GB/T27025的要求经方法确认后方可使用。6.1.2 时采用的商业化或白行开发的法庭科学遗传标记：代测序检测试剂应进行质录评价验证，包括但不限于准确性、灵敏度、IS定
12、性、均衡性、理复性、检材适应性、种属特异性等.&2酬主要检验器材包括：a）二代测序仪：ftt基识别质量大于20.碱基识别防Iit过谑之后的测序准确率大于或等于99.1 用测序通量适合相应法庭科学遗传标记检验：b）PCR仪：c）荧光定JPCR仪:DNA提取试剂：用于择放、分离获得各类生物样本中的所有DNA并进行纯化：b）PCK笑合扩增试剂：用于大规模平行笑合扩增针对STR、SNP.InDeI等遗传标记或戏粒体DNA的各目标位点靶序列，试剂盒内至少应包含，拉增引物、犷增油及缓冲液：c）文陈构建试剂：用于核酸样丛的测序文诲构建,试剂盒内至少应包含：接头、DNA连接的或DNA蜃合命、缓冲液：d）测序试
13、剂：用于对测序文库进行二代测序,试剂盒内至少应包含：测序引物.测序反应艇及援冲液。7 Mtxa7.1 三N拉脸流程应符合相应试剂说明仿和仪器操作规范要求，并进行实脸室内部方法验证，制定相应的作业指导回内容至少包括：a）检验步躲：至少包括DNA提取与定量、测序文库构建、测序文库纯化与定出、测序检脸等：b）质量控制：至少包括DNA咙量和浓度控制、文库片段长度和浓度控制、溯序原始数据质附控耐、测序结果质汆评价等.7.2 DNA提取与帏化按照GB/T43635（法庭科学DNA实蕤室检紧规范的方法开展实验，井时DNA提取的桢法和浓度进行质量控制.宜采用荧光定量方法对DNA浓度进行定量.应对符合文库构也的
14、质址要求指标进行方法验证。如果核酸样品顺审不符合要求，应Hi新提取或增加样品址再进行相应操作。7.3 目将适fit的DNA加至引物混合液和PCRHi混体系中进行PCR犷增.旷增后选择合适的方式对PCR产物进行纯化。扩增反应体系及循环参数参照川应试剂说明书操作.实验应设置阳性对照和阴性对照.7.4 %m主要步骤包括添加接头、文阵纯化、文阵侦量控制和文库均化.材料和方法以文阵构建试剂说明书为准,其他注意事项包括：a）清晰标记添加的标签接头.防止标签之间造成污染：b）标签接头连接后采用破珠法或相关文库纯化试剂刈虻淄产物进行纯化处理IC）文库质心控制宜采用荧光定量:方法检测文库浓度，可选择采用生物分析
15、仪检测文库片段大小，实验空应采用方法验证确定符合测序要求的文库版依要求指标：d）符合历fit要求的文库进行均一化和混合.均一化浓度以测序试剂和测序仪器要求为准.7.5 WMMM*测序文库均一化、混合后,宜采用桥式PCR,乳化PCR或DNA纳米球扩增等方法进行信号放大处理,使信号强度涵足测序识别要求.材料和方法以测序模板制备试剂说明书为准.7.6 m测序即加入底物核甘酸,在测序酸的作用下使底物核甘酸与测序文库中的特测样品进行结合.同时收集该过程中产生的信号，包括但不限于荧光信号、电信号或禹子信弓,材料和方法您照相应二代测序试剂说明书.其他注意本项包括：a）根据采用的检测试剂和二代测序平台摸索确定
16、合适的文理上机浓度：b）根据检浏的法耻科学遗传标记特性送拜合适的浏序读长以保证洌序结果准确和完整：c）根据不同测序平台的特性和检测样本垃选祥合适测序通量的测序试剂、豳定合适的测序深度并进行充分验证，保证测序结果淮格.8 Id分析8.1 AM8.1.1 款件的分析解HF放应选用公开数据分析流理，算法和数据分析参数的生沏信息学软件,进行法庭科学遗传阮记二代测序数据分析,确保:代测序实验结果准确、可视源.8.1.2 MMIMtlIMfiMa.*tt*aMWtt通过测序桢量IflJ”化评估原始数据垃址.宜评估的指标包括做星侦Ilh序列整hh序列长度、N（未测到或不确定破J&的比例、接头含m等，&1.2
17、2MHliI根据评估结果过渡去除原始数据中的接头、低侦量或未检出的版基及序列，宜过港的内容包括以下过渡参数应根据检测不同的法庭科学遗传标记或使用不同的二代测序平台进行两整,并经过实验室睑证:a)b)oSNP数据.摩中ID号码（N桁的方式进行SNP位点命名.&4InIM分Sl&4.1以GRCh38作为比对参考序列。&42播入等位茶因以序列侑息标示，缺失等位基因用“一”进行标示.&5DNAMff以人类战粒体DNA参考序列（NCBlReferenceSeqUenCc:NC_（H2920.1）作为比对参考序列，进行序列比对、拼接和定位，惊出与之不同的碱基作为特征点.8.6XVrMMttA与颜8.6.1
18、各蔚因座/位点设定合适的测序深度（占比作为分型研判的分析做依。若序列的测序深度占比（在该培因座/位点总测序深度中的比例）低于分析例值时研判为噪声序列可被过渡：若序列的测序深度占比高于或等干分折阳值时应进一步研判序列的类型.8.6.2实脸室应根据自行检测数据设定分析阈值中的测序深度占比。用值设定方法参照表1、表2和图1的示例.针对已知分型的单一来滁样本，统计某位点的嵯向序列最高测序深度占该位点总测序深度的比例达1%（位点总测序深度为5000,噪评序列最高测序深度为50,见表1）.检测不少于50例样本,获得每例样本某位点的噪声序列最高测序深度占该位点总测序深度的比例（见图1）,在图I的示例中可设定
19、测序深度占比1.5%作为该位点的阈值比例.对于STR基因座.应先确定等位基因和影子峰，再统计噪声序列的最高测序深度占比，在表2的示例样本中噪评序列的以裔测序深收占比1.8%.1巳知分加样本的某SNP位点的*则情况序列己颊类型SNP分型测序深度测序深度占比TGTGCCTCCGTTCCCTGTTGAjGGTTCCC等位基因T49104940/5000=98.HSTGAATGccATcCGTATCACCTGTAGA.AGGnCACC噪声序列5050/5000%TGTGCCATCCGTTCCCTGICGAjGGCCC噪声序列C1010/5000=0.21各样本中某位点的“F1KM*裳度占比情提2巳知分
20、量样本的茶STR苔因的的!情况长度序列已知类型，序深度,序深度占比12ATC12等位基因25002500/500050IOATCTJIO等位基因2121005000=12HATCTJi影子峥150150/5000=3%9ATC.影子修130130/5000=2.6UATCTkMCTATCTJs联声序列9090/5000=1.8%12AACTfATCT噪声序列2525/5000=0.5%IOAACAAKT,噪声序列55/5000=0.1%&a3设定侍分析样本的某基因座/位点的分析阈假时,根据8,6.2中的方法设定测序深度占比,再计算得到对应测序深度（ft（即某基因座/位点的总测序深度与测序深度占
21、比的乘枳）.若该他大于或等广10则作为该基因座/位点的分析阈依,若该值小于10则以测序深度10作为该基因座/位点的分析阙值.8.6.4参照以卜示例样本应用分析阕值进行分型研判.示你:按照8.6.2中的方法设定测序深度占比闺1；为某SNP位点的例值比例.样本A的iSNP位点的总测序深度为10.训测杼僦小Eo的序列（该示例中分别*0、20、10）研判为声序列.详见农3.3XSNP位点的序列情况示例序列SNP分型测序深度测序深度占比研利类型TACATAGGTGGGAAAGCAGAACACATGGGTAcTAATA393098.25%等位法因Tacataggtgggaaagcagaacacgtgggt
22、actaatG300.75%噪声序列TMATAGGTGGGRAGCAGAACAeITGGGTACTAATT200.5%噪声序列TAaTAGGTGGcAAAGCAGAACACCTGGCTACTAATCIO0.25%噪声序列示例2：按照8.6.2中的方法设定测序深度占比圆作为某STR基因座的鲫依比例.样本B的该STR葩因座的总测序深度为IOWW.则测序深度小于200的序列（该示例中分别为】00、20研判为啜声序列.对于测序深或占比算的序列,需迸一步研物ft定为例立基因戒附列.详见表4.4XSTR4因座的摩列情次承例氏度序列测序深度测序深度占比研判类型18CaIMi,GGCAk450045等使网因1
23、8CC,U,CCC4.1200必等位基因17CG4,GGCA.4804.8V.影子峥17GGM0GGC4.100i%影子峰18GGU,(GGClJAAGGCA.3003%哑声序列17OkAlGGCA1GftGAGGCj100K噪声序列17GGAA)IGGGMGGCA)S200.2$噪声序列示例3：按照6.2中的方法设义测序深度3比ltF为某SNP位点的固值比例,样本C的该SNP位点的总测序深度为500.根据设定利序深破占比计算对应前序深度假为5,则按照8.6.3中的安求设定测序深度10作为分析HlJ侦.利序深度为8和9的序列即使满足利序深度占比大于1%,但汽更根据分析阙依测序深度的出优要求判定
24、为噪声.序列,详见表5.5MSNP位点的呼列IR况示例序列SNP分型测序深度测序深度占比研判类型TACATAGGTGGGAAAGCAGAACACATGGGT.CTAATA48396.6%等位基因TacataggtcggaaagcagaacacgtgggtactaatG91.8噪声序列TACATAGCTGGGAAAGCAGAACAClTGGGTACrAATT8l.噪声序列90f*政计算9.1 将STR作为序列多态性遗传标记进行法庭科学杂教和条权指数计比,即长度相同而序列不同的STR等位基因是独立的不同等位必因，所果用人群弹率数据应是序列多态STR等位必因独率统计数%.9.2 在进行法庭科学参数和
25、系权IR数计算过程中.制要充分考虑所桧遗传标记间连钺关系的影响.WA(KMtt)法科学DNA二代京记法型科学DNA二代测序检脸记录表见&Al-A.6.ir*NAAMflise*XXXXDNA实验空抄加fl甘，犷增模板DNA定Stffi果登记表三IrifiHi板DNA定量时间I自年月0时分至_年月S时分（24小时IW）定Ik仪8hOQUbil荧光计口实时级光定鼠PCR仪口五他定IkiiWlh口试剂一口试剂二Mft试剂1.OT号I标本城号浓慢样本城1；浓度样本编号浓慢浓度里位默认为ngW”若使用其他浓度朝位需地”在表格中.第页/共页XXXXDNA实型4*1编号IDNA依验记录扩增作业用操作人,扩埴
26、时问IF1.年一月一日_时_分至_年一月E1.时一分小时制）扩增试剂：口试剂一口试刑二0i二。试剂四KWJ1.OT4：扩增仪器笫号I犷增体系Iu1.循环数:序号位，择本够号模板序;，ft择本修号模板序乡位置择本班号模板f.t1v样本as号模板l25Al49A773AlO2Bl26Bl50B774BJO3Cl27C451C775CM)ADl2852D776DlO5El29E453E777ElO6Fl30F454F778FlO7Gl31G455G779GlO8Hl32IM56H780HlO9A233AS57AB81All1()B234BS58BH82Bll11C235C559C883Cli12D2
27、36D560D884Dn13E237E561E885Ell14F238F562FK86Fll15G239G563GS87Gll16112WIIS64IWSKHll17A341A665A989A1218B342Be66B9B1219C343C667C991C1220D3441)668D992D1221E345E669E993E1222F346H70图91K1223G347Ge71C995G122111348的72119%H12模位-栏朝位就S为噂.若使用其他单位备加”在表格中.第页/共页XXXXDNA实的*柠制-卜：DNA检蛉记录文阵构建作业集（将序f）留乍人：电用时间：自一年月B_W分至一年月
28、H时分（24小时IW）世摩方法,口手动仪溯建库试剂：口建军试剂一口也除试剂二口其他试剂1.OT号I标签试剂：口标卷试剂一口其他试剂Uf4：纯化试剂：。纯化试剂-OHte试剂1.OT号：样本a号标笠号样本编号标维号样本编号标壁号第一页/共（A.4文鼻症UR型记会XKXXDNA实的室控制N：文原定St站!K登记表三:文陈定收时间：自_邠_月一日.时分至_件月日一时分（24小时制）定量仪2h口Q荧光计口实时荧光定量Pal仪口其1U!4li:定金试割h试剂一口试剂二试剂1.OT号I样本脚夕浓僮样本汨号海IS杵本铜5浓废浓慢冷位设认为ng1.,17使用其他浓度中也畲填写在表格中.第一贝/共一贝A.6森作
29、堡学XXXXDNA女崎室拧利螭卜：DNA检验记录测序作业冷”测序平台）操作人：模板别备时何；自一尔一月_日_时一分至_年_月一日时分（24小时制）测序芯片I芯片一芯片二口芯片三口芯片四口芯片五芯片明号I模板M番方法,口手动口工作站仅IS双小树SlW备试剂IiitW-iiWl1.OTO试剂二试剂IJW%测序时何：自年月一日时分至一年一月日时分（2,1小时制）测序仪器I口仪器-口仪推二仪Jft三仪器馍号I洌序试徜：OSWI-试剂1.OT4：iffl-忒制1.OT号，口试剂三流剂1.OT测序参itgxDNAXDNA分型记录一SNP分型研汽idi的1144S._(4点分型测序深度位点分型测序深度位点分型测序深收笠名/HBIh笫一页/共一页Dd分N研网记术的可与照该衣格式,A.6DNA分量记量单(IlnXXXXDNA实宝控号DNA分型汜泵一域敕体DNA符序结JR记录单裒件变现号,杵木饴号特在点注1:也书疗列为烬订的剑桥参考序则(revisedCambridgercfcren-xSCqUECarCRS),注2:“DEI：表示该位点相对O?SM大：空白点示某样本不存在特征点.注3：无法明确代读的核件酸多态性R描述为：唱目较强的破心，信号检在的叫丛S/UMI.第一页/共一页考文1GB/T30989-2014高通盘基因测存技术规程
