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1、附录A（资料性）人正常乳腺及乳腺癌类器官制备、冻存和复苏操作要点A.1仪器设备及试剂耗材A.1.1仪器设备生物安全柜、低温离心机、二氧化碳细胞培养孵箱、光学显微镜、37水浴锅、低温冰箱（4、-20、-80）、液氮罐等。A.1.2耗材细胞培养孔板或芯片、15mL和50mL无菌离心管、各种移液器和吸头、无菌镜子、无菌眼科剪、细胞冻存盒、细胞冻存管等。A.1.3试剂组织保存液、DPBS.胶原酶、支架材料、类器官培养基、细胞级别二甲基亚飒等。A.1.4正常乳腺类器官培养基推荐的正常乳腺类器官培养基的组成成分见表A.1。表A.1正常乳腺类器官培养基组成成分表中文名称英文名称基础培养基AdvanceDME
2、M/F12WNT信号通路激活剂R-Spondin1WNT3aWnt3a神经调节蛋白1Neuregulin1L-谷氨酰胺L-GlutamaxROCK抑制剂ROCKinhibitorY-27632人头蛋白Nogginsirtuins抑制剂NicotinamideTGF抑制剂A83-01TGFinhibitorA83-01纤维母细胞生长因子10FGFlO人表皮细胞因子EGFB27添加剂B27supplement乙酰半胱氨酸N-acetylcysteinePrimocin抗生素Primocin氢化可的松HydrocortisoneB-雌二醇-estradiol腺甘酸环化防激活剂ForskolinA.1
3、.5乳腺癌类器官培养基推荐的乳腺癌类器官培养基的组成成分见表A.2o表A.2乳腺癌类器官培养基组成成分表中文名称英文名称基础培养基AdvanceDMEM/F12WNT信号通路激活剂R-Spondin3青霉素/链霉素Penicillin/streptomycin神经调节蛋白1Neuregulin1L-谷氨酰股L-GlutamaxROCK抑制剂ROCKinhibitorY-27632人头蛋白Noggin4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸HEPESsirtuins抑制剂NicotinamideTGF抑制剂A83-01TGFinhibitor83-01纤维母细胞生长因子10FGFlO人表皮细胞因子EG
4、FP38MAPK抑制剂SB202190B27添加剂B27supplement乙酰半胱氨酸N-acetylcysteinePrimocin抗生素Primocin重组人角质细胞生长因子FGF7在准备乳腺癌类器官培养时，阻止正常细胞生长的方法包括去除正常细胞必需的某些生长因子（如，去除Wnt3a）,或者添加一种能杀死正常细胞的化合物（如，针对TP53突变添加NUtIin3a）,乳腺癌类器官培养基可根据具体情况在正常乳腺类器官培养基的基础上适量增减成分。A.2人正常乳腺及乳腺癌类器官制备操作步骤A.2.1通则所有类器官的制备、培养、冻存和复苏宜在生物安全柜中保证无菌操作。所用试剂、洗液和器材等应无菌。
5、A.2.2组织样本的预处理评估获取的组织样本中上皮细胞的含量，利用眼科剪和镜子尽可能去除非上皮成分，包括肌肉和脂肪组织。对于乳腺癌组织样本，宜去除明显坏死的组织成分。A.2.3组织块的清洗将上述预处理后的组织样本转移至50mL离心管中，用含有抗生素的4预冷的DPBS溶液/或基础培养基漂洗组织样本数次，直至漂洗液呈清液状态。A.2.4组织块的消化将样本转移至10cm的细胞培养皿中，使用手术剪或手术刀将组织样本尽可能剪碎呈现肉糜状态；根据组织量加入组织块组织消化液（210mL）,置于37水浴锅中消化。仔细观察消化情况，每10min15min混合1次；当混合物中组织块被明显解离破碎，光学显微镜下观察
6、到大量细胞簇或单细胞出现时即可终止消化，4C下，200g离心5min,弃上清，保留沉淀置于冰上。A.2.5组织细胞混悬液的过滤将沉淀重悬于基础培养基中，并用70m或者100m细胞滤网过滤。4下，20Og离心5min,弃上清，保留沉淀置于冰上。A.2.6细胞沉淀重悬及三维培养接种取适量支架材料（如基质胶，低温条件下呈液体状态）重悬细胞沉淀，混合均匀后接种于培养孔板，或用培养基重悬后接种于芯片上，待支架材料凝固，添加相应的人正常乳腺类器官或乳腺癌类器官培养基，使培养基没过细胞，置于37C二氧化碳细胞培养箱中培养。A.2.7类器官培养根据类器官生长情况，每2天3天更换1次类器官培养基。A.2.8类器
7、官传代a）待类器官平均直径为150Mm30Pm时，即可进行传代；一般而言，在此平均直径范围内的类器官生长活力较好；b）传代时需要将类器官尽量消化为单个细胞；C）正常乳腺类器官体外连续传代次数尽量控制在10代以内；乳腺癌类器官传代次数可根据实验要求适当延长，但宜对传代类器官定期做分子分型鉴定。A.3人正常乳腺及乳腺癌类器官冻存和复苏核心步骤A.3.1类器官冻存类器官冻存步骤如下：a）预先准备含有10%的二甲基亚飒的无血清细胞冻存液，现配现用；b）使用配置好的冻存液重悬细胞簇或单细胞沉淀，并按500LlmL体积分装至细胞冻存管中；c）将细胞冻存管放入细胞冻存盒中，置于-80C保存24h后，将细胞冻
8、存管转移至液氮罐中长期保存。A. 3.2类器官复苏类器官复苏步骤如下：a）预先准备一个装有10InL基础培养基的15mL离心管；b）将冻存管从液氮罐中取出后，宜立即放入37水浴中，轻轻摇动冻存管，尽量使其在短时间内全部融化；c）将融化后的类器官冻存液悬液吸出，逐滴加入到15InL离心管中，使液体中二甲基亚碉总量低于1%。4下，20Og离心5min,弃上清，保留类器官沉淀置于冰上；d）将细胞沉淀再次与支架材料混匀，接种于培养孔板或生物芯片上，待支架材料稳定后，添加相应的类器官培养基，置于37二氧化碳细胞培养箱中进行培养。附录B（资料性）人正常乳腺类器官和乳腺癌类器官的鉴定B.1概述根据需要对培养
9、的类器官进行鉴定，宜科学规划鉴定内容，可参考的鉴定指标如：形态、活性、组织学特征、分子分型等，作为参照来评估培养形成的类器官与来源组织的相似性。8. 2类器官显微镜下的形态学观察在类器官培养的第2天，即可在光学显微镜下进行形态学观察。正常乳腺类器官在培养数天后通常会形成直径50m及以上的球状结构，折光性良好，而乳腺肿瘤类器官的大小与形态可能有较大的个体差异。在进行大规模类器官培养及应用时，宜关注各组类器官的大小、形态及数量的均一性。8. 3类器官细胞活性分析8. 3.1台盼蓝染色法台盼蓝染料用于死细胞的着色，在光学显微镜下可以通过颜色区分死活细胞。使用细胞消化液将类器官解离成单细胞,使用台盼蓝
10、染液进行染色,染色后的细胞转移至血球计数板，置于光学显微镜下统计未染色细胞总数和着色细胞总数，根据公式：未染色细胞总数/（未染色细胞总数+着色细胞总数）机计算分析活细胞比例。一般情况下，计算或统计出的类器官活细胞比率90%时则表示培养的类器官活力优秀，质量良好。B. 3.2羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）染色法CFSE能够轻易穿透细胞膜，在活细胞内与胞内蛋白共价结合，水解后释放出绿色荧光，而死细胞无法着色。具体检测步骤包括：类器官消化成单个细胞后，离心弃上清，沉淀用AdvancedDMEM/F12培养基重悬（约1ml）,吹打混匀后加入CFSE溶液（终浓度为2.5UM5uM）,在37C
11、水浴锅中孵育10min。用40%体积的预冷小牛血清立即终止染色标记10min。离心洗涤两次后，用适量的完全培养液重悬细胞。取100UL左右细胞悬液置于干净的细胞培养皿中，放置于倒置显微镜下，使用488run激发光观察细胞着色情况。活细胞将会着色，死细胞将不会着色。同时，剩余的单细胞悬液可以使用流式细胞仪进行细胞活性定量分析。一般情况下，计算及统计出的类器官活细胞比率90%时则表示培养的类器官活力优秀,质量良好。B.4类器官组织学特征分析B.4.1样品准备从来源组织中切取1块2块具有代表性的组织块，用组织固定液进行固定保存。建议选取直径大于100Um的类器官用于组织学分析。B.4.2石蜡包埋及切
12、片石蜡包埋及切片处理步骤如下:a）使用吸头将包含类器官的基质材料从培养器皿上剥离，尽可能保持基质材料的完整性，放入组织盒中，用组织固定液（建议4%多聚甲醛）对类器官进行固定；b）梯度乙醇脱水（建议使用浓度为70%,80%,95%以及100%的乙醇依次处理，每个梯度5min10min）,二甲苯透明处理大约5min,直至观察到类器官呈半透明状态；c）完成石蜡包埋,制作类器官切片，建议每张切片厚度在5m左右。B.4.3苏木素&伊红（H&E）染色苏木素&伊红（H&E）染色步骤如下：a）将类器官切片置于烘片机上烘烤，增加类器官的粘附，防止在后续染色过程中类器官脱落；b）脱蜡：依次将类器官切片浸泡于二甲苯
13、溶液中3次，100%乙醇溶液中3次，95%乙醇溶液中3次，每次3min,再置于超纯水中3min,使组织细胞间的石蜡完全置换为水；c）细胞核染色：在类器官上滴加苏木精染料，用量以覆盖整个组织为宜（约40L）,时间约10s；d）在流水下冲洗数分钟洗去浮色，再依次利用盐酸酒精溶液及碳酸氢钠溶液进行返蓝处理；e）细胞质染色：放入伊红溶液中浸泡，时间约10s；f）接着依次浸泡于95%乙醇溶液中3次，100%乙醇溶液中3次，二甲苯溶液中3次中，每次3min；g）用中性树脂封片保存；h）光学显微镜下观察拍照，分析染色结果。B.4.4免疫组化检测免疫组化检测步骤如下：a）将类器官切片（B.4.2）置于烘片机上
14、烘烤，增加类器官的黏附，防止在后续染色过程中类器官脱落；b）脱蜡：依次将类器官切片浸泡于二甲苯，100%乙醇，95%乙醇，每次3min,以上步骤重复3次，再置于超纯水中3min,使组织细胞间的石蜡完全置换为水；c）取出切片放入装有抗原修复液的容器中，加热容器使溶液沸腾后，置于通风处自然冷却至室温；d）转移至装有0.3%TritonX-100PBS溶液的染缸中,浸泡20min；e）建议用PBS浸洗3次，每次5min；f）滴加山羊血清，覆盖类器官为宜（约40L）,封闭30Inin60min；g）吸去山羊血清，滴加一定比例的用封闭液稀释的一抗（浓度根据不同抗体而定），以覆盖类器官为宜（约40PL）,
15、置于4孵育过夜；h）吸去一抗，将切片再次放入染缸中，用PBS浸洗切片3次，每次5min；i）加反应增强液，覆盖类器官为宜（约40UD,富温孵育20min；j）吸去反应增强液，将切片再次放入染缸中，用PBS浸洗切片浸洗3次，每次5min；k）选择对应一抗的辣根过氧化物能联二抗试剂，滴加于类器官上，覆盖类器官为宜（约40IIL）,室温孵育1h；1）弃除二抗，滴加DAB反应液，覆盖类器官为宜（约40L）0当类器官呈棕色后迅速放入流水下冲洗3min左右；m）加苏木精染料进行细胞核染色，约10s,在流水下冲洗5min10min；n）切片放入盐酸酒精溶液和碳酸氢钠溶液，各1min,进行返蓝处理；o）流水下
16、冲洗后，依次浸泡于95%乙醇，100%乙醇，二甲苯中，每次3min,以上步骤重复3次；P）中性树脂封片保存；q）光学显微镜下观察拍照，分析染色结果。B.5类器官分子分型鉴定对于乳腺癌而言，建议分为几种临床常见分子分型如管腔A型、管腔B型、HER2过表达型、三阴型等，通常以ER,PR,HER2,Ki67等标志物所占肿瘤细胞比例划分。乳腺癌类器官可根据上述免疫组化步骤进行ER,PR,HER2,Ki67等指标的检测，并与原代肿瘤组织进行比较。正常乳腺上皮细胞进一步分为管腔谱系（表达KRT818,CD24）和基底/肌上皮谱系（表达ATAC2,CNNbMME）,分别构成乳腺导管系统的内层和外层。在管腔谱系中，基于GABRP、KlT和ALDHlA3的表达被标记为管腔祖细胞,基于AGR2、ANKRD30A、ESRKFOXAl和PGR的表达被标记为成熟管腔细胞。在基础/肌上皮细胞谱系中，基于ITGA6、KRT56B.KRTI4和TP63的表达，分别被标记为基础祖细胞和肌上皮细胞。以上识别乳腺癌或者正常乳腺上皮细胞的生物标志物均可用于分子层面的鉴定，包括但不限于RNA-seq或者荧光定量PCR实验用于检测目标基因的转录水平变化，免疫印迹实验用于检测目标蛋白表达水平变化等。
