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1、Biosynthesis of nucleic acid,第十二章核酸的生物合成,分子生物学(分子遗传学)中心法则,反映了从DNARNA蛋白质的遗传信息主流，揭示了生物体内遗传信息的贮存、传递和表达的规律。,ATGC,第一节 DNA的生物合成Biosynthesis of DNA,DNADNA DNA复制,RNADNA 反转录,两种方式,一、DNA的复制,基本概念 以参与反应的要素进行定义,必须具备的基本条件,模板：母链DNA,原料：dNTP(包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP),酶和蛋白质因子：,引物：一小段RNA,能量（ATP）及某些无机离子,DNA的复制的方式-,1958,Mes
2、selson and Stahl实验证实,DNA半保留复制,Watson 和Crick 提出的DNA 双螺旋复制模型,含15N-DNA的细菌,第一代,普通DNA,细菌的DNA双链,(黄线的代表含15N),DNA半保留复制的证据,可排除全保留式,Why?,排除全保留式,培养第一代结果,参与DNA复制的酶类与蛋白质因子及其主要作用,1.拓扑异构酶（topoisomerase,Topo）,无ATP时：作用相当于Topo,但切割的是双链DNA某一部位(断双链)。,有ATP时：使带断口、松弛状的DNA分子旋紧转变成负超螺旋结构，再连接断端。,不需耗能(ATP)，切割(断)双链DNA中的一链，松解螺旋,封
3、闭切口。又称切割封口酶。,Topo的作用,Topo(又称旋转酶)的作用,2.解链酶(又称解螺旋酶或螺旋酶,helicase),作用：断裂互补碱基间的氢键,使DNA双链分离形成“复制叉”。具有这种功能的是一类酶如复制蛋白(rep蛋白)、解链酶II等。,3.单链DNA结合蛋白(DNA结合蛋白),(single stranded DNA-binding protein,SSB),作用：防止重新形成双 链和防止单链模板被核酸酶水解,维持DNA单链状态和完整性.,4.引物酶(Primase),RNA的合成：需引物酶，它是一种特殊的RNA聚合酶。,DNA不能从无有合成，需在一小段RNA基础上合成DNA,原
4、核生物（E.coli）迄今已知只有3种：DNA pol、DNA pol、DNA pol。,真核生物 亦发现有多种DDDP：DDDP、。,其性质与功能 见表12-1 P293 和表12-2 P297,5.DNA聚合酶（DNA polymerase,DNA pol）,即依赖于DNA的DNA聚合酶（DDDP）,3 模板链 5,DDDP 53聚合作用示意图,5,3,6.DNA连接酶(DNA Ligase),作用：在有模板指导的条件下，催化2个 DNA片段(两片段间的距离为1个3,5-磷酸二酯键的键长)的连接。,原理：在一个DNA片段的3-OH末端和另 一个DNA片段的5-P末端形成3,5-磷酸二酯键，
5、从而实现连接。,特点：原核细胞:需辅助因子NAD+,真核细胞:不需辅助因子NAD+,但需 耗能(ATP),参与DNA复制的酶及蛋白质,酶或蛋白质 主要作用,拓扑异构酶类 克服解链时打结及缠绕、松驰或引,进负超螺旋,解链酶类 解开DNA双链,单链DNA结合蛋白 维持已解开单链DNA的稳定,引物酶 合成RNA引物,DNA聚合酶 DNA复制,DNA聚合酶 水解引物、填补空隙、修复作用,DNA连接酶 催化双链DNA中单链缺口的连接,DNA的复制过程,复制的起始,链的延长,复制的终止,复制的起始,1.在拓扑异构酶、解链酶及单链DNA 结合蛋白的共同作用下，DNA解旋、解链，形成复制叉。,2.依赖于单链模
6、板，由引物酶催化按 碱基配对规律合成一小段RNA引物(原核细胞引物长50-100个碱基，真核约10个碱基)。,复制起始阶段的特点,真核细胞：具有多个 起始位点,原核细胞：仅有一个复制起始位点，但往往是双向复制,链的延长,引物合成后，由DNA pol（真核细胞为DNA聚合酶或)催化，在引物3-OH末端逐一添加与模板链对应互补的脱氧核苷磷酸,使新合成的链不断延长。,领头链:链的延长方向(53)与解链方向(复制叉移动方向)相同,为连续合成。,随从链:链的延长方向(53)与解链方向(复制叉移动方向)相反，为不连续合成。,分段合成的DNA片段,最初被命名为冈崎片段,复制的终止,1.水解引物及填补空隙,冈
7、崎片段合成后，由DNA pol(真核细胞可能是DNA聚合酶)水解去除RNA引物，并填补留下的空隙(5 3)聚合。,2.完整双链DNA分子的形成,填补空隙后，DNA片段与片段之间还有一个缺口(一个3,5-磷酸二酯键的长度),由DNA连接酶催化连接成完整的链，从而产生完整的双链DNA分子。,二、反转录(reverse transcription),概念,以RNA为模板，dNTP为原料，反转录酶催化，按碱基配对规律合成DNA的过程。,反转录酶,又称为依赖RNA的DNA聚合酶,(RNA-dependent DNA polymerase,RDDP),DNA,RNA,RNA(病毒),病毒RNA,RNA-D
8、NA,杂化分子,cDNA,前病毒,(双链DNA),酶催化反应示意图,反向转录酶存在于所有致癌RNA病毒中,其功能可能与病毒的恶性转化作用有关;,但它也存在于某些正常细胞中，在细胞分化与胚胎发生中可能起某些作用。,反转录病毒和反转录酶的发现,提出了一个重要的医学问题病毒致癌及癌基因。,反转录的医学意义,反转录的医学意义,癌基因(oncogene):能在体外引起细胞恶性转化,在体内诱发肿瘤的基因.,细胞癌基因(c-onc)或原癌基因(pro-onc):存在于生物正常细胞基因组中的癌基因.正常情况下基因处于静止或低表达的状态.当受到致癌刺激被活化并发生异常时则可发生细胞癌变.,病毒癌基因(v-onc
9、):存在于致瘤病毒中的能使靶细胞发生恶性转化的基因.,用三个小写字母表示癌基因名称,如myc,fos,ras,src等,抑癌基因:是一类抑制细胞过度生长,增殖从而遏制肿瘤形成的基因.如Rb,P53,P16等,癌基因与抑癌基因之间一般处于动态平衡状态,是一种反转录病毒,可引起获得性免疫缺陷综合征(AIDS,艾滋病).,反转录酶在基因工程,分子病的基因治疗方面也有重要作用.,人类免疫缺陷病毒(HIV),反转录的医学意义,DNA的损伤与修复,一、DNA损伤(DNA damage),生物体受某些理化和生物等外源性因素或机体内环境改变的影响，引起DNA分子结构的任何异常改变称为DNA损伤,概念,UV,引
10、起DNA损伤的因素,紫外线(常产生嘧啶二聚体),电离辐射(断磷酸二酯键),物理因素,胸腺嘧啶二聚体的产生,化学因素：均能干扰复制与转录功能,烷化剂：(如氮芥类,CTX)，使鸟嘌呤的 N7烷基化后脱落，成为无鸟嘌呤的位点,亚硝酸盐：使碱基脱氨,原G-C配对最终变为A-T配对，导致错配,CU,AI,GX,丝裂霉素：与DNA共价连接引起链交联,I（次黄嘌呤）,糖苷键自行断裂；自发脱氨基作用,CU，AI。,生物因素：目前多指病毒,生理因素：机率极低,突变(mutation)：有机体基因组可遗传的改变，即DNA序列的改变.,根据引发的原因，可将突变分为：诱发突变和自发突变。,缺失,根据 DNA分子的改变
11、，突变可分为4类：,点突变,缺失或插入的碱基数不是3的整倍数时，则引起移码突变,插入,倒位(或易位),转换：同型碱基间变异,Pu Pu Py Py,转换：同型碱基间变异,Pu Pu Py Py,转换：同型碱基间变异,Pu Pu Py Py,转换：同型碱基间变异,Pu Pu Py Py,基因突变可能出现的后果,生物体致死,生物体某些功能丧失,仅改变基因型，表现型不受影响,改变生物物种，出现新的生物特征,DNA复制过程所发生的突变(碱基配对错误)，由核内DNA聚合酶以其校读功能予以纠正.,若碱基错配频频发生或损伤范围大，则需采用以下修复方式进行修复.,二、DNA损伤的修复,T+T,DNA修复方式,
12、1.光修复:,2.切除修复：由3种酶共同参与完成。,DNA pol I,DNA连接酶,过程,3.重组修复：亦称复制后修复,4.SOS修复：DNA分子受到较大范围的损伤，细胞对危急状态所作出的反应。,机制,引起DNA较长期的、广泛的突变。,SOS调节网诱导产生的DNA聚合酶特异性低，识别碱基能力差,使修复部位仍存在较多错配的碱基，但细胞能继续生存。,后果,第二节RNA的生物合成（Biosynthesis of RNA）,转录（transcription）生物体以DNA的一条链为模板，以NTP为原料合成RNA的过程,转录,复制和转录的区别,转录的模板和酶,转录以在DNA的一条链为模板，另一条链为编
13、码链（不转录），这样模板链不总在同一条链上，这种转录方式称为不对称转录 DNA双链中按碱基配对规律能指引转录生成RNA的一股单链，称为模板链，也称作有意义链或Watson链。相对的另一股单链是编码链，也称为反义链或Crick链,5GCAGTACATGTC 3,3 c g t g a t g t a c a g 5,5GCAGUACAUGUC 3,NAla Val His Val C,编码链,模板链,mRNA,蛋白质,转录,翻译,53,35,模板链,编码链,编码链,模板链,结构基因,结构基因,RNA聚合酶,（一）原核生物的RNA聚合酶,核心酶,全酶,转录起始,转录延长阶段亚基脱落,RNA聚合酶全
14、酶在转录起始区的结合,（二）真核生物的RNA聚合酶,模板与酶的辨认结合,原核生物一个转录区段可视为一个转录单位，称为操纵子，包括若干个结构基因及其上游的调控序列,RNA聚合酶结合模板DNA的部位，称为启动子,开始转录,T T G A C AA A C T G T,-35 区,(Pribnow box),T A T A A T Pu A T A T T A Py,-10 区,原核生物启动子保守序列,RNA-pol辨认位点,转录过程,一、原核生物的转录过程（一）转录起始,1.RNA聚合酶全酶(2)与模板结合-35区，酶移向10区，跨入转录起始点,2.DNA双链解开，20bp以下，通常是（171）b
15、p,转录起始过程,3.在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应，形成转录起始复合物（5-端GTP、ATP）,RNApol(2)-DNA-pppGpN-OH 3亚基脱落，进入延长阶段,转录起始复合物:,5-pppG-OH+NTP 5-pppGpN-OH3+ppi,（二）转录延长,1.亚基脱落，RNApol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移；,2.在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链不断延长。,(NMP)n+NTP(NMP)n+1+PPi 3.转录空泡 DNA/DNADNA/RNA G-CA-TA-U,转录空泡：,RNA-pol（核心酶）DNA RNA,DNA/DNADNA/R
16、NAG-CA-TA-U,5,3,DNA,原核生物转录过程中的羽毛状现象,核糖体,RNA,RNA聚合酶,5,3,依赖Rho()因子的转录终止非依赖Rho因子的转录终止,（三）转录终止,指RNA聚合酶在DNA模板上停顿下来不再前进，转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来。,分类,ATP,1.依赖 Rho因子的转录终止,2.非依赖 Rho因子的转录终止,DNA模板上靠近终止处，有些特殊的碱基序列，转录出RNA后，RNA产物形成特殊的结构来终止转录。,5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU.3,5UUGCAGCCUGACAAA
17、UCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU.3,RNA,5TTGCAGCCTGACAAATCAGGCTGATGGCTGGTGACTTTTTAGTCACCAGCCTTTTT.3,DNA,茎环/发夹结构,茎环结构使转录终止的机理,使RNA聚合酶变构，转录停顿；使转录复合物趋于解离，RNA产物释放。,二、真核生物的转录过程,（一）转录起始,真核生物的转录起始上游区段比原核生物多样化，转录起始时，RNA-pol不直接结合模板，其起始过程比原核生物复杂。,转录起始点,TATA盒,CAAT盒,GC盒,增强子,顺式作用元件(cis-acting element),1.
18、转录起始前的上游区段,AATAAA,切离加尾,转录终止点,修饰点,外显子,翻译起始点,内含子,OCT-1,OCT-1：ATTTGCAT八聚体,2.转录因子,能直接、间接辨认和结合转录上游区段DNA的蛋白质，现已发现数百种，统称为反式作用因子,反式作用因子中，直接或间接结合RNA聚合酶的，则称为转录因子(TF),参与RNA-pol转录的TF,3.转录起始前复合物(pre-initiation complex,PIC),真核生物RNA-pol不与DNA分子直接结合，而需依靠众多的转录因子。,TFF,A,B,由RNA-Pol 催化转录的PIC,H,E,TBP,TAF,TFD-A-B-DNA复合物,T
19、ATA,A,B,TBP,TAF,TATA,H,E,PIC组装完成，TFH使CTD磷酸化,4.拼板理论(piecing theory),一个真核生物基因的转录需要3至5个转录因子。转录因子之间互相结合，生成有活性，有专一性的复合物，再与RNA聚合酶搭配而有针对性地结合、转录相应的基因。,（二）转录延长,真核生物转录延长过程与原核生物大致相似，但因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的现象。,RNA-pol前移处处都遇上核小体。,转录延长过程中可以观察到核小体移位和解聚现象。,5-AAUAAA-,5-AAUAAA-,核酸酶,-GUGUGUG,RNA-pol,-AATAAA-GTGTGTG,转录终止的修饰
20、点,5,5,3,3,3加尾,AAAAAAA 3 mRNA,（三）转录终止,和转录后修饰密切相关,一、真核生物mRNA的转录后加工,（一）首、尾的修饰,5端形成 帽子结构(m7GpppGp)3端加上多聚腺苷酸尾巴(poly A tail),真核生物的转录后修饰,5 pppGp,帽子结构的生成,帽子结构,（二）mRNA的剪接,1.hnRNA 和 snRNA,核内的初级mRNA称为杂化核RNA(hetero-nuclear RNA,hnRNA)snRNA(small nuclear RNA),真核生物结构基因，由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨
21、基酸组成的完整蛋白质，这些基因称为断裂基因。,断裂基因(splite gene),编码区 A、B、C、D,C,A,B,D,2.外显子(exon)和内含子(intron),外显子在断裂基因及其初级转录产物上出现，并表达为成熟RNA的核酸序列内含子隔断基因的线性表达而在剪接过程中被除去的核酸序列,鸡卵清蛋白基因,hnRNA,首、尾修饰,hnRNA剪接,成熟的mRNA,鸡卵清蛋白基因及其转录、转录后修饰,鸡卵清蛋白成熟mRNA与DNA杂交电镜图,DNA,mRNA,3.内含子的分类,根据基因的类型和剪接的方式，通常把内含子分为4类,I：主要存在于线粒体、叶绿体及某些低等真核生物的rRNA基因；II：也
22、发现于线粒体、叶绿体，转录产物是mRNA；III：是常见的形成套索结构后剪接，大多数mRNA基因有此类内含子；IV：是tRNA基因及其初级转录产物中的内含子，剪接过程需酶及ATP。,4.mRNA的剪接,除去hnRNA中的内含子，将外显子连接。,snRNP与hnRNA结合成为剪接体,pG-OH(ppG-OH,pppG-OH),剪接过程的二次转酯反应,RNA编辑作用说明，基因的编码序列经过转录后加工，是可有多用途分化的，因此也称为分化加工,5.mRNA的编辑(mRNA editing),二、tRNA的转录后加工,tRNA前体,tRNA核苷酸转移酶、连接酶,ATP,ADP,碱基修饰,1,1,三、rRNA的转录后加工,具有酶促活性的RNA称为核酶,四、核酶(ribozyme),核酶作用的基础锤头结构,底物部分,通常为60个核苷酸左右同一分子上包括有催化部份和底物部份 催化部份和底物部份组成锤头结构,核酶研究的意义,核酶的发现，对中心法则作了重要补充；核酶的发现是对传统酶学的挑战；利用核酶的结构设计合成人工核酶,人工设计的核酶,粗线表示合成的核酸分子细线表示天然的核酸分子X 表示一致性序列箭头表示切断点,
