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1、h,1,第 五 节,干细胞应用举例,h,2,造血干细胞(Hemapoietic Stem Cell,HSC)是指一群在特定时期能够分裂的未分化细胞，具有自我更新能力和产生高度特异性的功能后代细胞。造血细胞是体外分化研究报道最多的一种分化细胞类型。造血干细胞是体内各种血细胞的唯一来源，它主要存在于骨髓、外周血、脐带血中。,一、造血干细胞移植,h,3,h,4,造血干细胞移植(Hemapoietic Stem Cell Transplantation,HSCT)是指将异体或自体的造血干细胞植入到受者体内，使其造血及免疫功能恢复。,h,5,根据供体的不同，HSCT分：,1、同基因(Syngeneic)
2、：指同卵双胎，供受者基因型完全相同。2、异基因(Allogeneic)：非同卵双胎，人类白细胞抗原（HLA）相合，来自患者的兄弟姐妹，无关供髓者，脐带血。3、自体(Autologous)：自体解救措施。,h,6,根据HSCT来源的不同分为：1.骨髓移植：13108有核细胞/kg 2.外周血造血干细胞移植：2106 CD34+细胞/kg 3.脐带血干细胞移植：3107有核细胞/kg,h,7,主要适应症(EBMT),淋巴瘤和骨髓瘤：53，其中异基因4，自体96。白血病：32，其中异基因76，自体24，包括AML、ALL、CML、MDS、CLL。实体肿瘤：7，其中异基因8，自体92，包括、神经母细胞
3、瘤、脑胶质细胞瘤、胚胎细胞瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌等。非恶性疾病：4，其中异基因92，自体8，包括再生障碍性贫血、范可尼氏贫血、地中海贫血、严重联合免疫缺陷症、自身免疫性疾病等。,h,8,干细胞移植过程,自体造血干细胞移植：异体造血干细胞移植：供者细胞无须冻存，直接输注。,合适患者,冻存干细胞,动员,采集,患者预处理,支持治疗植活,40度水浴,h,9,APBSCT治疗步骤和策略,1、常规化疗45个疗程白血病患者达到CR后，巩固治疗45次；实体肿瘤消失或进入平台期。2.外周血干细胞动员、采集及冷冻保存。3.预处理、细胞回输。4.并发症的防治及支持治疗。,h,10,不同来源（骨髓、动员外周血、脐带
4、血）造血干细胞的分离纯化、体外扩增与定向诱导分化；造血干/祖细胞增殖分化的分子调控机制；造血干细胞移植效率与归巢（Homing）；移植免疫耐受；相关的细胞治疗与基因治疗等。,造血干细胞移植存在的问题和研究热点,h,11,造血干细胞移植临床应用的推广,1.下肢缺血性疾病：糖尿病足、血栓闭塞性脉管炎、动脉硬化闭塞症等。2.股骨头坏死。3.缺血性心脏病：心梗4.失代偿期肝硬化。5.神经系统疾患：脑梗死、肌萎缩性侧索硬化症（ALS）、脑脊髓损伤（因创伤、缺血、变性疾病等造成神经元损伤）等。,h,12,二、自体角膜缘干细胞移植,角膜上皮干细胞位于角膜缘，角膜上皮病变是由于角膜缘干细胞功能缺陷或数量不足而
5、引起的。角膜干细胞可以治疗各种角膜干细胞疾病。将自体健康眼角膜缘含干细胞组织在内的球结膜片移植到患眼受损的角膜缘处，取得满意的疗效。,h,13,干细胞培养眼角膜，进行眼角膜移植修补手术,h,14,三、神经干细胞,神经干细胞最大的潜力就在于它可以治疗由于神经细胞的病变引起的各种各样的疾病，如老年性痴呆和帕金森病 当移植入中枢神经系统后不具有免疫排斥反应,存在于胚胎和成年神经系统的某些特定部位，在一定条件下能够大量增殖并分化为神经元和神经胶质，在其特征性的标记物为神经巢蛋白，RNA结合蛋白musashi,h,15,世界著名拳王阿里40多岁就患上了帕金森症，昔日雄风难在；美国前总统里根，患上老年痴呆
6、症。,h,16,老年性痴呆,主要症状：部分或者全部的丧失记忆能力和认识能力。,h,17,帕金森病,主要症状：全身发抖，肌肉僵硬。,h,18,研究发现应用一种18F-氟多巴的试剂注入人体，再经PET扫描，可以确诊早期PD病人。能透过血脑屏障被黑质纹状体神经元摄取，其摄取量可反映突触前多巴脱羧酶的活性，从而间接反映黑质多巴胺神经元数目和病情的严重度。一些研究表明PD病人的纹状体区的18F-氟多巴的积聚明显较正常人低，只有正常值的57%-80%。,h,19,上个世纪90年代初，人们发现通过把神经细胞注射入病害的区域可以有效的缓解帕金森病的症状。而捐献的神经细胞是从夭折的胎儿的脑中获得的。,PET正电
7、子扫描,h,20,但是，人类的胎儿不应该是移植组织的来源。这涉及到许多的伦理的问题，而且这样的细胞的来源也根本不能满足人们的需要。基于此，临床如何获得神经干细胞？,此外神经干细胞可作为基因载体,用于颅内肿瘤和其它神经疾病的基因治疗,利用神经干细胞作为基因治疗载体，弥补了病毒载体的一些不足。,h,21,四、自身皮肤干细胞培养及 美容除皱新技术,郑州大学医学院干细胞中心,h,22,1.人体最大的器官,2.维持外貌,3.抵御微生物入侵,4.紫外线辐射,皮 肤,h,23,皮肤的基本结构：,表皮：0.070.21mm，抗酸、抗碱、承受摩擦，防御异物和病原体的侵入，还要阻挡紫外线射入体内危害身体。,真皮：
8、厚度为12mm，70是由胶原蛋白所组成，胶原蛋白的作用：支架、储水,h,24,角蛋白,角质化细胞,颗粒细胞,棘细胞,基底细胞,基膜,真皮,外界,迁移细胞,干细胞,分裂中的干细胞,核解体,表皮层,哺乳动物皮肤剖面图（示干细胞）,(b)哺乳动物表皮增殖单位,迁移细胞,分裂中的干细胞,(a)皮肤剖面,h,25,皱纹悄然到来的主要原因：,1.真皮层成纤维细胞死亡的数量大于新生的数量，死亡与增殖失衡；2.真皮层胶原蛋白减少、蓄水能力下降，真皮塌陷，皱纹出现,青年期,老年期,h,26,成纤维干细胞的体外扩增：取材与培养,培养前,2周后,4周后,6-8周后，扩增出1-610万个细胞,h,27,h,28,h,
9、29,自体细胞除皱的两大优势：,二、安全性：,细胞取材自身，组织抗原完全相容，无排斥反应，不导致免疫性疾病，无过敏源即无过敏反应，不致畸、致瘤性，各种生理功能不受任何影响。,一、有效性：,一般在第一次注射后5个月开始见效，而且持久。,h,30,六、干细胞在其他系统疾病中的应用,h,31,1.心肌修复,干细胞培养心肌细胞治疗原发性心脏病,h,32,小鼠的心臟切片，圖中顯示左心室有38%的組織因心肌梗塞而受損（長方框處），於體外複製的幹細胞，在一個月內修復好組織。受損區域的特寫（上圖右）照顯示原來複製的幹細胞（藍色）和新長出的心臟細胞（紅色）。,h,33,2.ES细胞疗法治疗糖尿病,h,34,3间
10、充质干细胞的应用,骨髓间充质干细胞，是骨髓中除造血细胞以外的中胚层来源的细胞，其细胞特性稳定，在连续传代培养和冻存后仍具有多向分化潜能。在特定的诱导条件下，骨髓间充质干细胞可以分化为间充质组织中的各类细胞，包括：骨、软骨、脂肪、肌腱、韧带等细胞。,h,35,容易克隆，得到的克隆可分化没有融合,肌管 神经前体细胞,单细胞克隆,软骨细胞,成骨细胞,脂肪细胞,h,36,将MSCs用于治疗的优势,1、相对容易：分离和扩增，由同一个患者获得；2、具有多向分化的潜能；3、不会形成肿瘤；4、倾向于定向于损伤组织和修复组织。,h,37,源于MSCs已能或可能治疗许多疾病,骨髓间充质干细胞,治疗,h,38,一、
11、诱导产生的多能性干细胞二、肿瘤干细胞理论及其在肿瘤治疗中的意义,第六节：专题,h,39,一、诱导产生的多能性干细胞,（induced pluripotent stem cell,iPS）,h,40,是什么让干细胞成为了干细胞？,当胚胎长到几天大时，干细胞开始分化成特殊的组织类型，并且这种干细胞的全能性永远地丧失了。如果胚胎干细胞被提取出来，就能使它们一直处于全能状态。接着，在诱导因素的作用下，这些细胞能被诱导分化成肝脏或者大脑组织，等。到底是什么使它们处于全能状态？为何胚胎干细胞有如此能力呢？,h,41,Whitehead实验室的Young、RudolfJaenisch、DavidGiffor
12、d和DouglasMelton研究了三种对干细胞至关重要的蛋白质。这些分别称为Oct4、Sox2和Nanog的蛋白是转录因子。,Boyer 等在基因组水平利用位置分析法,鉴定出人类ES 细胞中有623个(3%)蛋白质编码基因和5个(3%)miRNA 基因的动子与OCT4关联。同时,还有许多蛋白质编码基因和miRNA 基因是SOX2 和NANOG 的靶基因.人类ES 细胞中,分别有1279个(7%)和1657个(9%)蛋白质编码基因的启动子与SOX2 和NANOG 相关。,h,42,Oct4 Sox2 Naong对靶基因的调节,h,43,研究发现这些转录因子不但能活化对细胞生长、增殖很关键的基因
13、，而且还抑制一些胚胎发育所必须的关键基因。这套关键基因负责调控产生不同特异细胞和组织所需的整个基因网络的其他转录因子。因此，Oct4、Sox2和Nanog是主控调节因子，能够沉默用于产生下一代细胞的基因。当Oct4、Sox2和Nanog在胚胎开始发育时被失活，这些网络就会恢复生机，并且这个干细胞也终结了它的干细胞状态。将这3个基因重新激活，能否将成体细胞重新转变为干细胞？从而为干细胞的产生带来无尽的源泉，使组织修复工程变得指日可待。,h,44,方法1：核移植,通过将体细胞核注入到去核卵母细胞中，使体细胞发生重编程，建立核移植胚胎的胚胎干细胞系。迄今，人们已经获得了多种核移植动物。,h,45,体
14、细胞核移植试验也具有很大的局限性,克隆的效率极低产生的许多后代在各个阶段都体现出严重的发育异常由于需要卵母细胞，核移植实验在人类中的应用受到强烈的伦理学质疑 这些不足，都制约了核移植技术的进一步发展和应用。,h,46,方法2核融合 将成熟的体细胞与多潜能的细胞（ES细胞、胚胎癌细胞等）融合，也可以在一定程度上使体细胞发生重编程。,利用这两种方法，可以实现某些多功能性标志分子的重新表达和多种分化潜能的获得。但是，体细胞与多能性细胞的融合率较低，融合之后的细胞具有两套染色体，并且在移植后会发生排斥现象，这就制约了细胞融合的临床应用。,h,47,细胞重编程,细胞重新编程指的是分化细胞在特定的条件下被
15、逆转后恢复到全能分化的状态，或者形成胚胎干细胞系，或者进一步发育成一个新的个体。,核移植后供体核停止本身的基因表达程序，恢复为胚胎发育所必需的胚胎化基因表达程序状态，体细胞重新编程。此过程包括：染色体结构重建、DNA甲基化、组蛋白乙酰化、印记基因表达、端粒长度恢复、X染色体失活等。,h,48,细胞重编程,有没有相对简单，又可摆脱材料来源和伦理学诸多限制，重编程的效率和程度都十分可观的新方法呢？,2008年12月18日美国科学杂志评出的本年度十大科学进展，细胞重新编程成为十大科学进展之首。之所以把细胞重新编程列为2008年十大科学进展之冠，是因为这一方式开辟了再生医学的新天地，研究人员可以绕过胚
16、胎干细胞的伦理争论而直接让细胞重新编程，成为各种类型的干细胞，并可以生长为各种组织和器官，为再生医学奠定物质基础。,h,49,里程碑式的科学突破,此之前的一项研究已经提示了这个领域的重大进展，即“诱导性多能干细胞”(又称干细胞样细胞)，该研究曾被评为2007年十大科学进展的第二项。2006年11月20日，日本京都大学的山中伸弥（Shinya Yamanaka)和美国威斯康星大学的詹姆斯汤姆森（James Thomson）分别在细胞和科学杂志上发表重量级论文，宣布他们用基因改造的手段，将人类体细胞改造成了类胚胎干细胞，在功能上几乎可以和胚胎干细胞相媲美。,h,50,2006年8月，日本科学家山中
17、伸弥小组首先在小鼠身上取得成功,h,51,诱导产生的多功能性干细胞,2006年，Takahashi 和 Yamnaka 将几个转录因子导入已分化的小鼠皮肤成纤维细胞，进而获得了类似于胚胎干细胞的多能性干细胞，称之为“诱导产生的多功能性干细胞”（induced pluripotent stem cells,iPS细胞）。这一研究明确地证实了分化的细胞可以通过少数几个因子的外源导入而被重编程到具有多能性的状态，因而受到了整个生命科学领域的广泛关注。,h,52,ips细胞系建立的一些重要环节,日本科学家发现ES细胞中存在着一些因子，这些因子对于多能性的建立可能至关重要。科学家对24个与多能性维持相关
18、的候选基因导入小鼠成纤维细胞中，依次去掉其中一个基因，最后在得到的10个基因中发现了4个至关重要的基因，其中任何一个缺失都将导致实验的失败，这4个基因中的任意2个或3个组合都无法形成具有ES细胞特性的ips细胞。从而确定了：Oct4,Sox2,c-myc和（Krueppel-like factor 4）Klf4这4种基因。,h,53,h,54,美国科学家比较了人类ES细胞和髓前体细胞的基因表达谱，挑选出许多在ES细胞和髓前体细胞的基因表达谱，挑选出许多在ES细胞中相对高表达的基因。再根据这些基因在多能性调控中的已知功能对其进行了排序，从中选出14个候选基因。将这些基因以不同的组合方式导入一种由
19、人类ES细胞分化得到的间充质样细胞后，检验了不同基因的导入对这种细胞重编程的作用。最后锁定了4种因子：Oct4,Sox2,Nanog,Lin28。,h,55,iPS细胞诱导机制,已分化的细胞,导入病毒基因Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4,病毒逆转录,胚胎干细胞培养条件和筛选,Ips细胞,h,56,h,57,1、利用iPS细胞作为实验模型，只操纵几个因子的表达，加速对多能性调控机理的深入研究。2、获得的方法相对简单稳定，不涉及胚胎的破坏，无伦理道德限制。3、对于疾病机理研究和新药开发等方面将有很大贡献。4、可望制造特定病人来源的iPS细胞，用“个性化”移植来治疗诸多疾病。,ips细胞
20、研究的意义,h,58,ips细胞研究中存在的问题,1、肿瘤相关基因，如c-myc的使用，有诱发癌症的可能2、逆转录病毒转染可能会导致一些癌基因的激活，也可能导致某些重要基因功能受阻。3、基因表达模式与ESC还存在一些不同。4、效率较低，重组率只有0.1%。,h,59,二、肿瘤干细胞理论及其在肿瘤治疗中的意义,h,60,肿瘤细胞的起源,细胞去分化:细胞去分化变为幼稚细胞,具有 分裂能力 干细胞:组织内存在的干细胞,h,61,人肿瘤细胞的去分化起源,甲状腺黏液表皮样癌（mucoepidermoid carcinoma,MEC):TTF-1和Pax-8共表达胃癌：CK7阳性细胞和-连环蛋白的表达 C
21、K7在胎儿组织中高表达 CK7 在成年组织中不表达 CK7在胃癌组织重新表达,表明上皮细胞发生 了去分化,h,62,肿瘤细胞的干 细 胞起源,肿瘤的去分化起源，但不是肿瘤就不能起源於干细胞的分化抑制，事实上，两种起源都是存在的。,h,63,肿瘤干细胞理论的提出,何为肿瘤干细胞？肿瘤干细胞是否存在？探索肿瘤干细胞有何理论价值和应用前景？,h,64,肿瘤干细胞的概念,近年来随着干细胞研究的不断深入,人们发现肿瘤细胞与干细胞有许多共性，提出了肿瘤干细胞(cancer stem cell)理论 该理论认为，肿瘤组织中存在着极少数分化相对低的细胞，充当干细胞角色，肿瘤可看作是干细胞生长调控机制失调引起的
22、异常组织器官。,h,65,肿瘤干细胞存在的依据,造血系统肿瘤 已有较多证据支持肿瘤干细胞理论在实体瘤中 虽然分离纯化实体瘤干细胞很困难，但最近的研究显示实体瘤中存在着肿瘤干细胞,h,66,肿瘤干细胞的分离,白血病：白血病是由造血干细胞引起的恶性肿瘤，白血病特定的染色体的易位，缺失，扩增或倒位都发 生在造血干细胞(HSC)阶段，白血病的细胞具有和造 血干细胞相似的表型，都表达CD34+CD38-.,h,67,肿瘤干细胞（Cancer Stem Cells),Hewitt:小鼠白血病-小鼠体内只有1-4%在脾 内形成克隆，因此，部分肿瘤细胞有致 瘤性Trott:提出假设:在肿瘤中干细胞的比例1%,
23、肿瘤干细胞分裂增殖，产生自身表型的子细胞以及分化的细胞,h,68,h,69,h,70,实体瘤中的肿瘤干细胞,目前已在乳腺癌、肺癌、神经胶质母细胞瘤、前列腺癌、胚胎瘤、绒毛膜癌、精原细胞瘤等实体瘤内证实有肿瘤干细胞存在。,h,71,乳腺癌:1、2002年,Clarke等首次从乳腺癌分离出干细胞，表达 CD44,B38.1和ESA，将细胞植 入NOD/SCID小鼠，能形成肿瘤。证明这部分细胞具有肿瘤源性。2、Al-Hajj等从乳腺癌分离出表达CD44+CD24/lowLineage-的细胞，具有正常干细胞特性，能无限 增殖，产生多种类型细胞，将CD44+CD24/lowLineage-的细胞植入N
24、OD/SCID小鼠，能形成肿 瘤。也表达ESA和CD44,肿 瘤 干 细 胞 的 分 离,h,72,h,73,h,74,Breast cancer cells with stem cell-like markers formed a large tumor(bottom left and mouses left side),whereas injections of other breast cancer cells didnt grow(top left and mouses right side).,h,75,精原细胞瘤,胚胎瘤,畸胎瘤,绒毛膜癌,h,76,肿瘤干细胞的分离,肝 癌 一系列
25、研究支持卵圆细胞产生肝癌的观点,卵圆细胞是肝脏中的一类干细胞.Hixson等发现卵圆细胞，癌前灶，早期肿瘤结节以及原生的肝癌细胞都表达卵圆细胞和肝细胞抗原，提示原细胞和肿瘤是前体-产物关系。,h,77,前列腺癌干细胞,前列腺干细胞抗原(prostate stem cell antigen,PSCN),在80%前列腺癌中表达 前列腺癌细胞植入动物体内，再注PSCN 单抗，阻止肿瘤生长,h,78,肿瘤细胞与干细胞的主要共性,干细胞自我更新有利于受损伤组织的修复和功能重建 肿瘤细胞自我复制可能是肿瘤组织无限增殖和呈浸袭性生长的基础 干细胞的分化形成各种组织器官 肿瘤的分化使瘤体呈现异质性,自我更新能
26、力,具有分化潜能,h,79,从干细胞和癌细胞之间的这种惊人相似之处可以推测：肿瘤可能起源于正常干细胞的转化。,h,80,干细胞是癌变的靶标,干细胞是环境致癌因素作用的突变靶标 1.干细胞是细胞癌变起始阶段或第一次 打击(first hit)突变的靶标 2.肿瘤常表达与干细胞相关的蛋白 3.干细胞自我更新的信号通路，如 Notch,Wnt,Sonic hedgehog(shh)通路,h,81,肿瘤干细胞理论扩展了对肿瘤本质的认识,该理论认为，肿瘤生长是肿瘤组织中极少量肿瘤干细胞增生的结果，其余大部分细胞无长期增生能力，经过短暂的分化，最终死亡。它与传统理论认为所有瘤细胞都有无限生长的能力、肿瘤生
27、长是所有瘤细胞增生的结果不同。,h,82,h,83,肿瘤干细胞理论改进了传统治疗肿瘤的观点,治疗肿瘤，必需充分地杀灭肿瘤干细胞,h,84,h,85,肿瘤干细胞理论对肿瘤生物治疗的启示,h,86,针对肿瘤干细胞进行的干细胞移植，其疗效在血液病中得到了充分证实,目前针对血液病的治疗所采取的骨髓移植、脐血移植等，都以替代异常的造血干细胞为目的，并取得了明显的疗效,干细胞移植,h,87,肿瘤免疫治疗,1、寻找肿瘤干细胞特异抗原，制备特异性抗体，进行肿瘤免疫治疗 目前在前列腺癌的研究已有所突破。前列腺干细胞抗原(prostate stem cell antigen,PSCN)是前列腺特有的，在80%前列
28、腺癌中表达，肺转移癌细胞中100%表达，而且表达程度与肿瘤进展有关。Saffran等将前列腺癌细胞系注射到小鼠腹部或原位注射，再通过静脉注射PSCN单克隆抗体，单抗以剂量依赖方式有效阻止了肿瘤的生长，延长了小鼠的存活时间，几乎完全抑制了肿瘤肺转移。2、利用肿瘤干细胞特异抗原，制备肿瘤疫苗 制备肿瘤疫苗的关键是确定特异性肿瘤抗原，但许多肿瘤相关抗原在某些正常组织也表达，抗原特异性差。从肿瘤干细胞中寻找特异性标志物，可能是发现肿瘤的专一抗原的一条有效途径,h,88,基因治疗 针对肿瘤干细胞的遗传学进行研究，以发现可以评价肿瘤干细胞生长的新基因，这不仅可以为诊断肿瘤提供新的标志物，而且这些基因的鉴定对于确定肿瘤治疗新的靶相是非常重要的。,h,89,信号转导治疗（signal transduction therapy）探索肿瘤干细胞特异的信号转导通路，以其信号转导蛋白为靶分子，阻断、干扰肿瘤细胞的异常增殖。目前研究较多的是抑制酪氨酸蛋白激酶（TPK）介导的细胞信号转导途径：采用单克隆抗体阻断配体与受体TPK结合；抑制TPK的催化活性。,h,90,此外，用纯化的肿瘤干细胞作为实验模型，进行药物和生物制剂的筛选，可能找到更有效的抗癌途径。,肿瘤干细胞的深入研究必将进一步推动肿瘤学的发展。,
