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1、常用微生物染色方法,1、革兰染色2、抗酸染色3、墨汁染色,革兰氏染色,革兰氏染色原理,一 通透性学说二 等电点学说三 化学学说,G-/G+细菌细胞壁比较示意图,肽聚糖层,磷脂层,LPS,磷壁酸,革兰氏阳性菌细胞壁结构比较致密，肽聚糖层很厚，脂类含量较少，酒精不易渗入，而且95酒精可使细胞壁脱水，间隙变小，通透性降低，阻碍结晶紫-碘复合物渗出；革兰氏阴性菌细胞壁结构比较疏松，肽聚糖层很薄，外膜、脂蛋白、脂多糖均含有大量脂质，易被酒精溶解，致使细胞壁通透性增高，细胞内的结晶紫-碘复合物被酒精溶解洗出而脱色。,原理一 通透性学说二 等电点学说三 化学学说,革兰氏阳性菌等电点（pH 2-3）比革兰氏阴
2、性菌等电点（pH 4-5）低，加之媒染剂碘为弱氧化剂能降低革兰氏阳性菌的等电点，因此在同样的pH的染色环境中，阳性菌所带负电荷比阴性菌多，与带正电荷的结晶紫染料能牢固结合，不易被酒精脱色。,原理一 通透性学说二 等电点学说三 化学学说,革兰氏阳性菌含有大量核糖核酸镁盐，其可与结晶紫-碘结合成大分子复合物，因而不易被95酒精脱色；而阴性菌中此物质含量较少，因而吸附染料量很少，分子量也较小，故易被酒精脱色。,原理一 通透性学说二 等电点学说三 化学学说,细菌涂片的制备,涂片：取一张洁净载玻片，用已灭菌的接种环取一环生理盐水于玻片中央，再将接种环灭菌，取菌与生理盐水磨匀，涂布成1cm1cm大小区域的
3、均匀薄膜，使盐水磨成灰白色为宜，接种环灭菌后放回试管架。干燥：涂片最好在室温下自然干燥或将标本片涂抹面向上，置酒精灯火焰上半尺高处慢慢烘干。固定：常用火焰加热法，手执载玻片一端，标本面向上，迅速来回通过火焰三次。,注意点 取菌量不可太多，涂片应均匀，否则影响染色结果 干燥时切忌高热，以免细菌变形 固定时温度不可过高时间不可长，以防涂抹面 烧焦及玻片烧裂固定的目的杀死细菌，使菌体蛋白凝固，染料易于着色改变细菌通透性，以利于染料进入细胞内使菌体与玻片粘附牢固，在染色时不致被染 料和水冲掉,BASO快速革兰染色,初染：加龙胆紫液染色10秒，水洗，甩干媒染：加碘液数滴，染色10秒，水洗，甩干脱色：加脱
4、色液脱色，不时摇动约1020秒，至无紫色脱落为止，水洗，甩干 复染：加沙黄溶液复染10秒，水洗，甩干吸水纸吸干，油镜观察标本,注意事项,1染液方面：1）试剂用完后，请迅速盖好，以免挥发。2）脱色液用完后，可用丙酮作为代用脱色液，脱色时间可稍短。3）试剂效期过后，请不要使用。试剂盒储存时，尽量避免高、低温环境及阳光直射。,2涂片染色技术方面：1）涂片不能太厚，太厚时常不易完全脱色，使阴性菌呈紫色。2）涂片后最好自然干燥，若用火焰干燥或固定不能太靠近火焰，以免破坏菌体或炭化。3）脱色时注意勿脱过头，使阳性变成阴性，尤其是链球菌很容易脱过头变成阴性。4）染色时间要掌握好。,3.观察细菌形态或染色性不
5、能用幼龄菌或衰老菌，一般采用培养16-18小时的菌落或菌液涂片染色。,革兰染色意义,鉴别细菌 革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌选择药物 革兰氏阳性菌对青霉素等敏感 革兰氏阴性菌对链霉素等敏感与细菌的致病性有关 革兰氏阳性菌产生外毒素 革兰氏阴性菌产生内毒素,抗酸染色,原理：结核菌、麻疯杆菌、耻垢菌等抗酸性菌，因其菌体表面有一层类脂或脂质而不易着色，但一经着色后酸或已醇的作用亦是不易脱色。利用此特性并以增强的染色液染色，然后再用酸及乙醇加处理，使其脱色后再对比染色，此时抗酸性菌仍是固定着最初色素的颜色（红色），而其他细菌及背景中的物质为蓝色。,操作步骤1、涂片经火焰固定，加石碳酸复红溶液用火焰微热至出
6、现蒸气约3分钟（防止染液蒸发干，必要时可续加第一液数滴，水洗。2、用3%盐酸酒精脱色约1分钟，直至涂片无色或淡粉红色为止，水洗3、再加复染液复染1分钟，水洗，干后镜检。结果判断 抗酸杆菌呈红色，其他细菌及细胞呈蓝色。,注意事项1抗酸染色直接用于痰标本时，可以适当增加标本涂片的厚度，发提高检出率。染厚涂片时，须掌握复染时间，如果背景过深，会影响镜检。痰标本找抗酸杆菌，应先高压杀菌，避免实验室污染。2尿、粪中找到抗酸杆菌须作潘氏染色，排除耻后杆菌，才能报告。标本中找到抗酸杆菌，须作传染病报告。3离心应为3000转/分，30分钟。4涂片至少保留三个月。,墨汁染色,通常用于检查脑脊液或分泌物涂片中的隐球菌，具有方便、快速、节约成本等优点，是涂片中检查隐球菌感染的首选方法。,隐球菌：显微镜暗视野（负染）下找隐球菌，可见圆形菌体，外周有一圈透明的肥厚荚膜，内有反光孢子，但无菌丝。反复多次查找 阳性率高，脑脊液应离心后沉淀涂片。隐球菌墨汁染色阳性，需进一步做真菌培养,操作步骤：脑脊液等其他标本离心取沉淀物或者挑取菌液1环涂于沽净玻片上，然后加印度墨汁1环，覆以盖玻片后镜检。镜下背景呈黑褐色，菌体无色透明。,结果判断 新型隐球菌可呈宽阔透亮的厚荚膜，背景为纤细均匀的黑色，白细胞被染成黑色不透亮，但核形明显。,注意事项1、不要使用过期的印度墨汁。2、墨汁应无污染、无颗粒等。,
