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1、微生物与环境监测,一、指示微生物,指示微生物（indicator microorganism）或称指示菌（indicator bacteria）是在常规环境监测中，用以指示环境样品污染性质与程度，并评价环境卫生状况的具有代表性的微生物。主要生物性污染：细菌、真菌、病毒等各类微生物均有。,1.细菌总数,细菌总数（total bacteria count）：指环境中被测样品，在一定条件下（培养基成分、培养温度和时间、pH、通气状况等）培养后所得的1m1或lg检样中所含的细菌菌落总数。它反映环境中异养型细菌的污染度，也间接反映一般营养性有机物的污染程度。,1液态与固态对象中的细菌总数天然水体、饮水、
2、饮料等液体物土壤、污泥、堆肥、食品、化妆品、药品等固态物，常用倾注平板培养法或平板表面涂布培养法。,国家卫生标准中规定：营养肉汤琼脂培养基，将经过一定倍数稀释的样品悬液，定量接种于琼脂培养基平板，或倾注混匀，或表面均匀涂布；在有氧条件下，37培养48h观察平板上菌落生长结果。,2空气中的细菌总数平板暴露沉降法仪器法,平板暴露沉降法：采用直径9cm平皿，将营养琼脂平板在1.2 m高处暴露5 min，37培养48h，计数生长菌落数。测定的结果不是十分准确。经济方便，有实用价值。,仪器法中以固体撞击式采样器多用。结果：采用个m1为单位来表示 cfu（colony forming unit）表示：指单
3、位体积、单位表面积或单位质量检样中的菌落形成单位。,细菌总数的卫生标准,我国公共场所空气细菌总数标准*,2.霉菌和酵母菌总数,霉菌和酵母菌数（fungi and yeast count）是指环境中被测样品经过处理，在一定条件下培养后，所得1g或lm1检样中所含的霉菌和酵母菌菌落数。霉菌和酵母菌是异养型微生物，能致病或产毒素。,检测方法用倾注培养平板法。多采用孟加拉红（虎红）培养基、高渗察氏培养基或加有抗菌素的马铃薯葡萄糖培养基。环境样本作一定倍数稀释后，定量注入灭菌平皿。倾入培养基混匀，凝固后置入2528 温箱培养35天观察平板上菌落生长情况并计数。,结果：以每毫升或每克检样中菌落形成单位（c
4、fum1或g）来表示。,二、粪便污染指示菌,病原菌一般在环境中存在的数量不大，而且检测方法较复杂，难以直接测定。其他微生物作为代表，间接指示肠道病原菌存在。粪便污染指示菌。,理想条件：（1）是人畜粪便中的正常菌，且数量比粪便中其他菌为多；（2）受人畜粪便污染的环境中可检出，而未受污染环境无该菌存在；（3）排出至环境后，该菌存活时间与肠道致病菌相当或略长；（4）对氯等消毒剂及其他不良因素的抵抗力略强于肠道致病菌；（5）检出与鉴定方法比较简便迅速。,大肠杆菌较理想，109个ml；但鉴定方法比较复杂；含有大肠杆菌在内的总大肠菌群与粪大肠菌群。,1.总大肠菌群,总大肠菌群（total co1iform
5、），也称大肠菌群（coliform group或co1iform）；它们是一群能在37，24 h内发酵乳糖产酸产气，需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。形成特殊的菌落特征；大肠菌群不是分类学上的一个名称，而是人为定义的名词。,肠杆菌科细菌主要包括4个菌属：埃希氏菌属（Escherichia）在此菌属中与人类生活密切相关的仅有一个种，即大肠埃希菌也称大肠杆菌；其次有柠檬酸杆菌属或称枸橼酸杆菌属（Citrobacter）、克雷伯菌属（Klebsiella）、肠杆菌属（Enterobacter）。,（1）测定方法,1多管发酵法（multiple-tube fermentation），又称最大可能数
6、法（most probable number，MPN）主要步骤：初发酵试验：加入含有乳糖蛋白陈培养基（液）中，经37 培养24 h，观察产酸产气情况以初步判别是否有大肠菌群存在。,平板分离。将初发酵试验产酸产气的发酵管分别接种在伊红美蓝琼脂平板上，置37培养24h，观察菌落形态。挑选可疑为大肠菌群细菌的菌落涂片、革兰氏染色、镜检和进行证实试验。复发酵试验（证实试验）。上述可能为大肠菌群的菌落再次接人乳糖蛋白陈培养液，置37温箱培养24h后观察结果。,观察结果：复发酵试验中仍有产酸产气者即最后确证为有大肠菌群存在。根据初发酵管的数目及试验所用的检样量，利用数理统计原理或查阅专用统计表，最后算出每
7、毫升检样中大肠菌群的最可能数目。,2.滤膜法（membrane filtration technique，MFT）水样滤膜抽滤细菌滤膜培养，鉴定并计数典型菌落，计算总大肠菌群数。,主要步骤：水样过滤培养 观察结果：通过菌落特征及镜检菌体形态初步确定大肠菌群细菌；凡革兰氏阴性无芽孢杆菌再接入含乳糖蛋白陈培养基中以确证为大肠菌群细菌；最后根据通过水量及滤膜上长出的肯定为大肠菌的菌落数换算出每升水中大肠菌群数。,结果表达方式：大肠菌群数又称大肠菌指数，其表示方法有多种，地表水环境质量标准、生活饮用水卫生标准、游泳池水卫生标准中以个L表示之；食品卫生标准中用个m1表示。大肠菌群值是指水样可检出1个大肠
8、菌群细菌的最小水样容积，此值愈大即表示水中大肠菌群数愈少。,水：大肠菌群值1 000 m1大肠菌群数土壤 大肠菌群值l g大肠菌群数,方法评价（1）发酵法：（MPN法）步骤多，耗时长，得到结果需要72h，不能及时指导实践工作。（2）滤膜法（MFT法）：操作简单，可现场过滤水样，避免运送水样的麻烦，且缩短时间。但此法不适用于混浊度高的水样。（3）总大肠菌群中细菌并非全部来自粪便，可能由腐败的植物、土壤等其他环境带来，放可能导致某些不准确性。（4）饮水加氯消毒可杀灭大肠菌群而难杀灭肠道病毒，故大肠菌群不能指示水中病毒。,2.粪大肠菌群,粪大肠菌群（fecal co1iform）是能在44.5（44
9、45）发酵乳糖的大肠菌群，亦称耐热性大肠菌群（thermoto1erant coliform）。包括4个属，埃希氏菌属为主，其他3个属数量较少。多数大肠杆菌的菌种可以在4445条件下生长。,粪大肠菌群数与粪便中大肠杆菌数直接相关，在人粪中粪大肠菌群细菌占总大肠菌群数的96.4；在外环境中粪大肠菌群不易繁殖，粪大肠菌群较总大肠菌群作为粪便污染指示菌意义更大。,常用的方法也有多管发酵法和滤膜法。多管发酵法是自总大肠菌群乳糖发酵试验的阳性管中取1滴转种于EC培养基，44.5培养。然后观察结果。用滤膜法检测时采用的培养基有区别，总大肠菌群滤膜法采用的固体培养基为品红亚硫酸盐（钠）培养基，粪大肠菌群则采
10、用FMC培养基。,水中粪大肠菌群与肠道病原微生物具有相关性，是粪大肠菌群作为指示菌的重要依据；,3.粪链球菌,粪链球菌（Streptococcus faecalis）是短链状的革兰氏阳性球菌。在人粪便内数量很多，每克成人粪便中约含有2108个，仅次于大肠菌群细菌。其为粪便污染指示菌的优点是在水中不会自行繁殖，但抵抗力弱于病菌。粪链球菌可为水质细菌学评价提供有意义的补充材料。,由于人粪便中粪大肠菌群数多于粪链球菌，动物粪便中则相反，因此，在水质检测时可根据两菌菌数比值不同而推测粪便污染的来源。粪大肠菌群粪链球菌的比值（FeFs）大于或等于4，则认为污染主要来自人粪；如小于或等于0.7，则认为污染
11、主要来自温血动物的粪便；如比值小于4而大于2，则为混合污染但以人粪为主；如比值小于1而大于0.7，则为混合污染但以动物粪便为主。,4.产气英膜梭菌,产气英膜梭菌（Clostridium perfringenes）为革兰氏阳性具有芽孢、能还原亚硫酸盐的厌氧杆菌。存在于人粪（成人每克粪内有此菌105106个）及温血动物的粪便内，可作为粪便污染指示菌。,优点：有芽孢，对氯等消毒剂及外界不良环境具有较强的抵抗力，能在水中较长期存在，特别适用于在含有有毒物质（如氯等）的水体中检测是否有过粪便污染。,5.蛭弧菌,蛭弧菌（Bdellovibrio）是一类以捕食细菌为生的寄生菌，依靠对宿主菌的寄生和裂解使自身
12、得到生长繁殖。当水体受到粪便污染时，可供蛭弧菌寄生的宿主增加，蛭弧菌因而大量繁殖，数量增加，从而对污染起到指示作用。,生长繁殖需要一定的时间，故其对污染的指示有一个滞后期。当蛭弧菌数量升高后，可长时间持续较高的水平。可用蛭弧菌联合大肠菌群表示水体所受粪便污染的新旧或区别污染是否连续。,三、其他指示微生物,致病菌的指示菌：1.沙门氏菌（Salmonella）种类繁多，有些对人和动物均有致病力，如肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌等，能引起人类伤寒症、急性胃肠炎和败血症等，经粪口传播，污染食品、药用动物脏器等，在口服用药和食品中不得检出。,2.志贺氏菌（Shigella）引起人类细菌性痢
13、疾，经粪-口传播，被规定为食品卫生指示菌，不得检出。,3.铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）也称绿脓杆菌，为革兰氏阴性具有单根鞭毛的细小杆菌，存在于人畜粪便及污水中，可作为粪便污染指示菌。此菌还存在于人的皮肤和上呼吸道，是常见的条件致病菌，它常被作为药品、化妆品、游泳池水的卫生指示菌。如我国眼科制剂、外伤用药、化妆品中不得检出铜绿假单胞菌。,4.金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）为革兰氏阳性，排列呈葡萄状的球菌，存在于正常人的皮肤、鼻咽部和肠道及家畜的皮肤和肠道。侵入破损的皮肤和黏膜，可引起局部化脓性炎症，严重者可引起败血症；有些菌株污染食品
14、可产生肠毒素，达到一定剂量时可引起食物中毒。在食品、化妆品、外用药品以及游泳池水等的监测中都被作为重要的卫生指示菌之一，如我国规定1g（m1）化妆品中不得检出金黄色葡萄球菌。,5.链球菌属（Streptococcus）对人体致病性较强者为化脓性链球菌，在外环境中生存能力较强。可以通过飞沫气溶胶、污染的食品等传播，引起化脓性感染和食物中毒。在我国许多食品卫生标准中都规定不得检出,6.破伤风梭菌（Clostridium tetani）属专性厌氧梭状芽孢杆菌属，广泛分布于泥土中。通过外伤后经皮肤感染，在坏死组织中厌氧繁殖，产生外毒素致病。以根、茎类植物为原料的药品易受破伤风梭菌污染，外用药，特别是用
15、于深部组织、创伤、溃疡的外用药不得检出。,肠道病毒的指示微生物 脊髓灰质炎病毒噬菌体,四、有毒物质的检测,原理：选择微生物的生理指标（如细胞生长、呼吸、酶活性等），根据待测物影响或抑制这些指征的程度来判断毒性的强度。采用的评价指标多为EC50（50 effective concentration，半数有效浓度）或IC50（50 inhibition concentration，半数抑制浓度）值，即计算影响或抑制微生物某种正常生理指标值50所需的待测物浓度。不同方法和实验室的检测结果易于比较。一般认为EC50或IC50可与哺乳动物试验的LC50进行类比。,1.发光细菌细菌生物发光抑制试验（mic
16、rotox）一类能产生生物发光的细菌，统称为发光细菌（luminous bacteria）。目前发现的发光细菌分属弧菌属、发光杆菌属和异短杆菌属。发光细菌均为革兰氏阴性、兼性厌氧菌。（0.4-1.0）（1.0-2.5）m，无孢子、荚膜，有端生鞭毛一根或数根，最适生长温度为20-30，pH6-9，培养基中NaCl浓度2-40%。,试验原理：生物发光是发光细菌生理状况的一个反映，在生长对数期发光能力最强。当环境条件不良或有毒物存在时，因为细菌荧光素酶活性或细胞呼吸受到抑制，发光能力受到影响而减弱，其减弱程度与毒物的毒性大小和浓度成一定比例关系。通过灵敏的光电测定装置，检查在毒物作用下发光菌的光强度
17、变化，可以评价待测物的毒性。,人们筛选对环境敏感而对人体无害的菌株，用以快速监测环境毒物。美国，Beckman公司，将毒性测定过程标准化，并命名称为“Microtox”。目前该方法是国际通用、使用最为广泛的污染物毒性微生物学检测方法。,毒性测定：向测试管中定量加入菌液和样品，以苯酚作为阳性有机毒物对照、Zn2+作为阳性无机毒物对照，蒸馏水为阴性对照。在15条件下培养5min或15min后（目前国际上测定时间有这两种方式），即可通过生物发光光度计直接读出或扫描5min或15 min光量抑制百分率（inhibition rate，IR），计算抑制细菌发光强度50所需的待测物浓度（IC50）。,2.
18、硝化细菌硝化作用抑制试验（nitrification inhibition test）亚硝化细菌，如亚硝化单胞菌属（Nitrosomkonas）；硝化细菌，如硝化杆菌属（Nitrobacter）。,硝化作用易受到外界环境因素的影响；重金属、农药、有机污染物等可以通过抑制硝化作用的酶类（如氨单加氧酶、经氨氧化酶、亚硝酸氧还酶），导致亚硝化或硝化细菌对底物的利用能力或产物生成量下降；建立硝化作用抑制试验，通过测量底物或产物的变化来检测污染物毒性作用的程度。,3.藻类生长抑制试验（algoe growth inhibition test）试验原理：藻类对水体污染反应十分敏感。例如，在河流中，当水温为
19、20时，硅藻占优势，30时，绿藻占优势，当热污染使水温升高到35-40时，则蓝细菌（蓝藻）占优势。水体自净过程，水中无机氮化合物含量不断增加，在光照和温度适宜时，藻类生长量亦相应增加；反之，在含有毒物的水中，由于毒物的抑制作用，使藻体叶绿素浓度降低，影响了光合作用，藻类生长量亦相应减少。,水质生物检测中比较常用的有硅藻、栅藻、小球藻等；因为生长繁殖迅速，对水质变化敏感，可以通过测定水中这些藻类的生长量来测定水质污染情况或物质毒性程度。,测定藻类生长量的方法有下列几种：藻体生长量；释出氧量；摄取14C量；细胞DNA及ATP测定。,4.原生动物微尺度群落级毒性试验（microscale commu
20、nity-level toxicity test）又称微型生物群落（microbial community）监测法，广泛地用于水环境的毒性检测与评价。所涉及的微生物种群不止一种，包括细菌、真菌、原生动物、藻类、小型轮虫等。其中最具特色的是原生动物，将其归于此类。,试验原理正常条件下自然界水环境的微型生物群落种类、分布与构成均有一定规律。在外界环境因素的干扰下，群落的平衡被破坏，结构特征也随之变化。通过分析相关的微型生物群落结构参数，即可判断水环境的质量状况或污染物质的毒性特征。该方法突破了单一微生物种类用于毒性检测的局限性。由于微型生物群落中有生产者、分解者、消费者，构成了一个复杂的食物网，所
21、以检测的结果有很强的生态学意义。,该方法中最成熟、应用最广泛的是PFU（Polyurethane foam unit，聚氨酯泡沫塑料块）法。聚氨酯泡沫塑料块，可浸没于水体，能收集到85的种类，具有环境真实性；在一定时间内，PFU中原生动物种群构成会达到平衡，而有害污染物会破坏这一平衡。通过比较试验组和对照组的群落结构和功能参数，即可评价水体质量与污染程度。,活性污泥毒性检测法,1.脱氢酶活性试验（dehydrogenase actZvity test）脱氢酶类能使被氧化有机质的氢原子活化并传递给特定的受氢体，反映活性污泥对污水中有机质的氧化分解能力；,有毒物质的存在会使脱氢酶类活性降低并影响活
22、性污泥的效果。可通过指示剂的还原变色速度来确定脱氢酶活性，以判断毒性物质的作用强度。,2.呼吸抑制试验（respiratiion inhibition test）微生物在进行有氧呼吸、分解有机质的过程中会消耗氧，产生CO2，因此测定呼吸速率可以反映活性污泥中微生物的代谢速率，对分析废水生物可降解性有重要意义。废水中有毒物质可以抑制微生物的呼吸，使其耗氧量和CO2产生量下降，下降的程度与毒性物质的浓度和强度有关。,特点：（1）简便：与哺乳动物的喂养相比，微生物培养繁殖易掌握和控制，检测方法也很简捷。（2）灵敏：许多微生物的代谢活动对毒物干扰十分敏感，可以反映痕量毒物的效应。（3）快速：微生物细胞
23、的繁殖速度快，世代时间短，所以检测时间较哺乳动物试验短。（4）经济：微生物菌株易于保藏、复苏，且许多检测手段已自动化，因此试验成本较低。,五、致突变性污染物的微生物检测,20世纪70年代 开始环境致突变物（mutagen）、致癌物（carcinogen）的生物学试验；,1.鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶（Ames试验）,美国Ames教授，1975年，致突变性测试法，也称Ames致突变试验。检测DNA碱基序列是否发生改变即基因突变的一种方法。,原理：Ames试验利用鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）的组氨酸营养缺陷型菌株发生回复突变的性能来检测物质致突变性的方法。常
24、用的组氨酸缺陷型沙门氏菌有5种，均各含有控制组氨酸合成的基因。当培养基中不含有组氨酸时它们不能生长。当受到某些致突变物作用时，菌体内DNA特定部位发生基因突变而回复为野生型菌。培养基中不含有组氨酸时该菌也能生长。,哺乳动物微粒体酶：混合功能氧化酶系，其中包括细胞色素P450、NADPH细胞色素P450还原酶、细胞色素b5、NADH细胞色素b5还原酶、芳烃经化酶、环氧化物水化酶及磷脂等；P450最为重要：一是降解作用，使化学物变为低毒或无毒物排出；二是激活作用，使化学物转化为具有亲电子性质，导致毒性增强，成为致突变物或终致癌物。,又称鼠伤寒沙门氏菌哺乳动物微粒体试验法（Salmonella ty
25、phimurium/mammalian microsome test）。,2.发光细菌试验,利用发光细菌暗变异株恢复发光的现象，可对各种遗传毒性物质进行检测、筛选；此方法与其他微生物学方法（如Ames试验）相比有灵敏、简便、快速等特点。,原理发光细菌的自发暗变异株（K.variant）与致突变物接触后，则可恢复一定强度的发光能力（通常可使暗变异株的发光强度增加1000倍左右）。,3.营养缺陷型菌株回复突变试验,与Ames试验的原理与方法类似；大肠杆菌与枯草芽孢杆菌进行的致突变试验。大肠杆菌色氨酸营养缺陷型菌株：检查碱基置换型致突变物；枯草芽孢杆菌蛋氨酸与组氨酸缺陷型菌株,4.细菌的正向突变试验
26、,菌种：鼠伤寒沙门氏菌、枯草芽孢杆菌等。枯草芽抱杆菌的芽孢形成试验即是其中一种。正常的野生型枯草芽孢杆菌，是一种能产生芽孢的细菌，由于某种因素的影响使其发生突变，而变为不能形成芽孢的变异株。该菌染色体中有25个以上的操纵子控制着芽孢形成，只要其中有任何一个发生变化，芽孢便不产生。正常野生型的枯草芽孢杆菌菌落带棕黄色，而突变型菌株的菌落不产棕色素，因而可以通过肉眼鉴别出待测物是否为突变物。,5.粗糙脉孢菌的正向突变试验,粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）基因组ad3位点的正向突变；在数量众多的白色菌落（野生型）中鉴定出紫红色的菌落（突变体）。,6.构巢曲霉的突变试验,构巢曲霉（As
27、pergillus nidulans）突变可通过菌落形态或营养要求的变化 无琉基黄嘌呤和含琉基黄嘌呤的培养基上，分别产生绿色菌落和黄色菌落。,7.SOS显色试验,检测理化因素所致细菌SOS修复的能力，来查明其是否具有致突变、致癌的特性。,8.重组缺陷型茵株试验,利用某些失去重组修复机能的菌株进行试验，其DNA受损后，由于不能重组修复而不能生长，,9.溶源性细菌试验,溶源性细菌（1ysogenic bacteria）含有温和噬菌体（或称溶源性噬菌体）的细菌。在一般条件下在寄主菌体内不进入生长状态，而以一种特殊结构形式潜伏在细菌的染色体组内，称为原噬菌体（prophage），当细菌细胞经受到某些诱变剂作用时，变成成熟的具感染性的噬菌体，使细菌发生裂解作用，最后使之解体而释出。噬菌体的裂解作用在固体培养基上以噬菌斑的形式表现出来，噬菌斑愈多，诱变力愈强。物质的致癌性与诱变性问存在正相关，这种溶源性细菌产生噬菌体诱导现象，可以作为致癌物的鉴定试验。,
