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1、专题一 微生物培养技术,微生物,非细胞生物：病毒,原核生物：细菌、放线菌、支原体、立克次氏体,真核生物：真菌（酵母菌、霉菌）,菌落,1、概念：单个或少数微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。,2、菌落是鉴定微生物的重要依据：不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落一般具有稳定的特征，如菌落的大小、形状、边缘特征、隆起程度、颜色等。,细菌菌落,细菌的菌落特征因种而异,如图是酵母菌电子显微镜下的形态结构,真菌：酵母菌和霉菌,青霉,一、微生物的分离和纯培养,（3项技术1个案例）,（一）培养基配制技术,（二）无菌技术,（三
2、）接种技术,案例：大肠杆菌的分离和纯培养,（一）无菌技术,1、概念：无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。,对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒；,将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌；,实验操作时，应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。,2、消毒,（1）定义：使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）,A、煮沸消毒法:100煮沸5-6min，日常生活常用B、巴氏消毒法：70-75 下煮30min或 80 下煮15min，适用于不耐高温的液体，如牛奶。C、化学药剂消毒法:用酒精进行皮肤消
3、毒;氯气消毒水源D、射线消毒法，如紫外线,（2）消毒的方法：,（1）定义：使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。,2、灭菌,（2）灭菌的方法：,A、灼烧灭菌,方法：直接在酒精灯火焰的充分燃烧层(温度最高)灼烧(迅速彻底),适用范围：接种环、接种针、金属用具(接种工具)；试管口或瓶口(在接种过程中易被污染的部位),C、湿热灭菌 方法：高压蒸汽灭菌P8 适用于培养基的灭菌,B、干热灭菌：方法：干热灭菌箱,160-170 下加热1-2h。,适用范围：吸管、培养皿(玻璃器皿)、金属用具(能耐高温的、需保持干燥的物品),1、培养基定义：（课本第9页）,2、营养构成：,环境条件：pH
4、、氧气、二氧化碳、渗透压等,（二）培养基配制技术,基本营养成分：水、无机盐、碳源、氮源等,特殊营养成分：维生素、生长因子等特殊的、能满足微生物不同需要的营养物质。,固体培养基用于菌种分离、鉴定菌落等半固体培养基可观察微生物的运动液体培养基常用于发酵工业。,（1）按物理状态分：,固体培养基和液体培养基、半固体培养基。,3.培养基的分类,固体培养基,平板培养基（课本第9页）,斜面培养基,固体培养基中需加入凝固剂，如琼脂,半固体培养基,无运动 有运动,半固体培养基中也需要加入凝固剂琼脂，但加入量少于固体培养基。,液体培养基,表面生长,均匀混浊生长,沉淀生长,选择培养基,（2）按功能分：选择培养基和鉴
5、别培养基,加入青霉素的培养基:抑制细菌和放线菌的生长，分离酵母菌、霉菌等真菌。,不加氮源的无氮培养基:分离固氮菌,定义（课本第18页）,举例：,加入高浓度食盐的培养基:分离金黄色葡萄球菌,鉴别培养基,根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品配制而成的，用以鉴别不同种类的微生物。,例如：在培养基中加入伊红和美蓝，可以用来 鉴别大肠杆菌。如果有大肠杆菌，其代谢产物就与伊红和美蓝 结合，使菌落呈蓝紫色，并带有金属光泽。(课本15页),用化学成分已知的化学物质配成的，因成分明确，常用于分类、鉴定等 合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。,合成培养基:
6、,天然培养基：,（3）按成分：合成培养基和天然培养基(P9,用化学成分不明确的天然物质配成的，如血清、组织提取液等,称量：准确地称取各种成分。牛肉膏比较黏稠，可以用玻棒挑取，放在称量纸上称量。牛 肉膏和蛋白胨都容易吸潮，称量时动作要 迅速，称后要及时盖上瓶盖。,4.培养基的配制步骤（第10页）,（1）.计算:根据牛肉膏蛋白胨培养基配方的 比例，计算配制100mL的培养基 时，各种成分的用量。,（以牛肉膏蛋白胨固体培养基为例）,（2）.溶化：加水加热熔化牛肉膏 将称好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯加入少量的 水，加热。当牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用玻棒 取出称量纸。加入蛋白胨和氯化钠，用玻棒搅
7、拌，使其溶解；加入琼脂；用蒸馏水定容到100mL。整个过程不断用玻棒搅拌，目的是防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。,（3）.调节pH,（4）.分装、包扎,（5）.灭菌,（6）搁置斜面P11或倒平板P13,搁置斜面-斜面培养基(P11),待试管冷却至50 左右，将试管口部枕在高约1cm的木条或其他合适高度的物体上，使其自然冷却，斜面长度不超过试管总长的1/2.,待培养基冷却到50 左右时，在酒精灯附近倒平板。,倒平板-平板培养基(P13),在火焰旁右手拿锥形瓶，左手拔出棉塞；右手拿锥形瓶，使锥形瓶的瓶口迅速通过火焰；左手将培养皿打开一条缝隙，右手将培养基倒入培 养皿，立刻盖上皿盖。待平板冷却凝固后，将
8、平板倒过来放置。,平板冷凝后倒置的原因：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。,倒平板技术,（三）接种技术,1.定义:在无菌条件下将微生物接入培养基的操作过程。,3.平板培养基上接种方法,平板划线法、稀释涂布平板法、稀释混合平板法,2.斜面培养基上接种方法,目的：菌种转移、扩大培养和保存纯净菌种,目的：用来培养、分离细菌等微生物,斜面培养基上接种方法,准备接种,点燃酒精灯、取斜面培养基、取菌种试管,灼烧多次，迅速彻底地灭菌,试管口通过火焰2-3次，杀灭试管口微生物,接种环冷却后
9、挑取菌种,不要将培养基的表面划破,37 下培养24h,平板培养基上接种方法,1、平板划线法,将混在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞。,准备接种,平板划线操作,平板划线要点,在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环的原因,A.操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；,B.每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。,在划线操作结束时，仍需灼烧接种
10、环的原因,划线结束后灼烧接种环能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。,在灼烧接种环之后，要等其冷却后再进行划线的原因,以免接种环温度太高，杀死菌种。,在做第二次以及其后的划线操作时，总是从上一次划线的末端开始划线 的原因,划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,2、稀释涂布平板法,将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。,在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个
11、的菌落,即为纯培养物。,系列稀释操作,70%的酒精,涂布平板操作步骤,取菌液滴加到培养基表面,1、微生物实验室培养的基本操作程序,（1）器具的灭菌（2）培养基的配制（3）培养基的灭菌（4）倒平板（5）微生物接种（6）恒温箱中培养（7）菌种的保存,（四）案例：大肠杆菌的分离和纯培养,（1）制备牛肉膏蛋白胨培养基,2、大肠杆菌的分离和纯培养步骤,（2)配制培养基：计算称量；熔化；调PH；分装；灭菌；倒平板（3）接种：平板划线法；稀释涂布平板法。（4）培养：倒置，37恒温箱，12和24h。（5）纯化培养：倒置，37恒温箱，24h。（6）菌种保藏：临时、长期保存法。,菌种的保存,1、临时保藏：接种到固
12、体斜面培养基，菌落长成后置于4冰箱保存。2、长期保存：甘油冷冻管藏法-20 冷冻箱保存,二、测定微生物的数量,（一）测定微生物数量的方法,1.直接计数法,最常用：显微镜直接计数法（方法、优点、缺点、适用条件）,一、基础知识,2、间接计数法：,最常用的是稀释平板计数法,稀释平板法,稀释涂布平板法,稀释混合平板法,1、土壤取样、制备土壤悬液,土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,2、配制选择性培养基：采用唯一氮源为尿素的培养基,尿素琼脂培养基,牛肉膏蛋白胨琼脂培养基,二、实践案例,3、样品稀释,细菌：一般选用104、105、106倍的稀释液进行培养,放线菌：一般选用103、104、105倍的稀释液,真
13、菌：一般选用102、103、104倍的稀释液,4、取样及平板接种（涂布平板或混合平板）,在以尿素为惟一氮源的培养基中加入酚红指示剂，指示剂变红，就可以准确的鉴定该种细菌能够分解尿素。,5、培养与观察：,细菌：30370C的温度下培养12d；放线菌：25280C的温度下培养57d；霉菌：25280C的温度下培养34d。,当菌落数目稳定时，选取菌落数在30300的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。,每克样品中的菌数(C/V)MC:代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数V:代表涂布平板时所用的稀释液的体积M：稀释
14、的倍数,6、细菌计数,菌落数的选择：一般选择菌落数在30300的平板上进行计数。当只有一个稀释倍数的平均菌落数符合此范围时，则 以该平均菌落乘以稀释的倍数；若有两个稀释倍的平均菌落数均在30300之 间，则按两者菌落总数之比值来决定：若比值小于2 应采取两者的平均数，若大于2，则取其中较小的菌 落总数。,注意事项,三、培养基对微生物的选择作用,（一）、基础知识,1、纤维素与纤维素酶,【案例】分解纤维素的微生物的分离,纤维素是一种多糖纤维素酶是一种复合酶,（二）、筛选,1、方法：,刚果红染色法,原理：刚果红（CR）可以与纤维素形成红 色复合物，当纤维素被纤维素酶分 解后，红色复合物无法形成，出现
15、 以纤维素分解菌为中心的透明圈，我们可以通过是否产生透明圈来筛 选纤维素分解菌。,常用的刚果红染色法有两种,方法一：在长出菌落的培养基上，覆盖1mg/mL的CR 溶液，1015min后，倒去CR溶液，加入 1mol/L的NaCl溶液，15min后倒掉NaCl溶液。,方法二：配制质量浓度为10mg/mL的CR溶液，灭菌 后，按照每200mL培养基加入1mL的比例加入 CR溶液，混匀后倒平板。,一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，另一种是在倒平板时就加入刚果红,（1）土壤取样（2）选择培养（可省略）（3）梯度稀释（4）涂布培养（5）挑选产生透明圈的菌落（6）微生物培养（纯培养）,（三）、实验流程,
