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1、第四章 微生物细胞的破碎,知识点：细胞壁的组成和结构，微生物细胞的破碎技术，破碎率的测定。重点：工业生产中常用的几种细胞破碎方法的原理，操作过程及常用设备，并能就实际生产情况予以合理的选择。难点：常用破碎方法的合理选用。,为了研究细胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解各种微生物细胞壁的组成和结构（表1）：,一、细胞壁的组成和结构,细菌破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，网状结构越致密，破碎的难度越大，革兰氏阴性细菌网状结构不及革兰氏阳性细菌的坚固；酵母细胞壁破碎的阻力也主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度；由于霉菌细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构，其强度比细菌和酵母菌的细胞壁有所提高
2、。不同种类的细胞结构差别很大，破碎的难易程度也不同，由难到易的大致排列顺序为：植物细胞真菌（如霉菌、酵母菌）革兰氏阳性细菌革兰氏阴性细菌动物细胞。,二、常用破碎方法,细胞破碎机理图,进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出从而实现连续操作。破碎中产生的热量一般采用夹套冷却的方式带走。,1.珠磨法（Bead mill）,原理：,高速珠磨机,实验室规模的细胞破碎设备有Mickle高速组织捣碎机、Braun匀浆器；中试规模的
3、细胞破碎可采用胶质磨处理；在工业规模中，可采用高速珠磨机（瑞士WAB公司和德国西门子机械公司制造）。,胶体磨,德国进口珠磨机,破碎作用方程,破碎作用是相对于时间的一级反应速度过程，符合下列公式：ln1/(1-R)=Kt 其中 R 破碎率；K一 一级反应速度常数；t一 时间。一级反应速度常数K与许多操作参数有关，如如搅拌转速、细胞悬浮液的浓度和循环速度、玻璃小珠的装量和珠体的直径，以及温度等。,操作条件的选择：,珠体大小根据细胞大小、浓度以及连续操作时不使珠体带出来选择。珠体装量装量少时，细胞不易破碎；装量大时，能量消耗大，研磨室热扩散性能降低，引起温度升高。温度温度高时细胞较易破碎，但要考虑目
4、的产物不受破坏。一般温度控制在540内时影响较小。,搅拌转速过高将使能量消耗大增，而破碎率上升不明显。能耗Rn,珠磨法的破碎率一般控制在80%以下：降低能耗减少大分子目的产物的失活减少由于高破碎率产生的细胞小碎片不易分离而给后续操作带来的困难。,采用高压匀浆器（由高压泵和匀浆阀组成，英国APV公司和美国 Microfluidics公司均有产品出售）。,2.高压匀浆法（High-pressure homogenization）大规模细胞破碎的常用方法,利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破碎，细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静
5、止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化，从而造成细胞破碎。,原理：,高压匀浆器,大、中、小型高压匀浆器,破碎的动力学方程为：ln1（lR）KNP 其中 R破碎率；K与温度有关的速度常数；P一操作压力；N一悬浮液通过匀浆器阀的次数。与微生物种类有关的常数；破碎酵母菌,值可取2.2。可见，影响破碎的主要因素是压力、温度和通过匀浆器阀的次数。,在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及高浓度的细胞，常采用多次循环的操作方法。一般说来，酵母菌较细菌难破碎，处于静止状态的细胞较处于快速生长状态的细胞难破碎，在复合培养基上培养的细胞比在简
6、单合成培养基上培养的细胞较难破碎。,易造成堵塞的团状或丝状真菌较小的革兰氏阳性菌含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀）,不宜采用高压匀浆法的细胞类型：,思考问题：比较高压匀浆法与珠磨法的异同点？,3.喷雾撞击破碎,细胞弹性体 刚性体,喷雾撞击破碎器结构简图,细胞悬浮液以喷雾状高速冻结（每分钟数千摄氏度），形成粒径小于5微米的微粒子。高速载气，氮气流速300m/s，将冻结的微粒子送入破碎室，高速冲向撞击板，得以破碎。,3.喷雾撞击破碎,喷雾撞击特点：（1）细胞破碎仅发生在与撞击板撞击的一瞬，细胞破碎度均匀，可避免细胞反复受力发生过度破碎现象。（2）细胞破碎程度可通过无极调节载气压力
7、（流速）控制，避免胞内结构的破坏，适用于细胞器（叶绿体、线粒体）的回收。,喷雾撞击破碎特点,喷雾撞击适用于微生物细胞和植物细胞的破碎，通常处理悬浮液质量控制浓度为100-200g/L。实验室规模的撞击破碎器间歇处理能力为50-500mL/h，而工业规模的处理能力为10L/h。与其他机械法一样，此种破碎方法也会造成操作系统的温度上升，破坏生物产品的生物活性，单程操作使温度大约上升10摄氏度。因此，操作系统中必须设有冷却系统，以保证生物产品的活性。,利用发射15-25kHz的超声波探头处理细胞悬浮液。一般认为超声波破碎的机理是：在超声波作用下液体发生空化作用，空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波
8、和剪切力，使细胞破碎。,3.超声破碎法（Ultrasonication）,一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破碎，对酵母菌的效果较差，该法在实验室小规模细胞破碎中常用（声能传递和散热）。超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活。,超声波破碎法,3.超声破碎法（Ultrasonication）,其破碎率的相关因素:,声频、声能；处理时间细胞浓度菌种类型,与破碎效率直接相关的参数,振幅，与声能有关，直接影响蛋白释放的比速率黏度，影响能耗，抑制空穴现象表面张力，添加表面活性剂或者从细胞中释放出蛋白质等活性物质，会显著影响超声破碎效率。起泡在气-液界面上会使蛋白质变性或清除空穴现象。
9、被处理悬浮液的体积。大体积需要高的声能引起强烈的涡流和大气泡的形成。,珠粒的体积和直径，对于刚性细胞的粉碎常添加细小的珠粒以产生辅助研磨效应。探头的形状和材质，一般是钛金属材料。细胞悬浮液的流速。由于其局限性，在工业上一般不采用，主要是用于实验室规模的细胞破碎。,与破碎效率直接相关的参数,影响超声对生物产品的回收有很多因素（1）温度 避免方法 预冷 冷凝循环水（2）游离基的生成等化学效应.应对方式 添加游离基的清除剂胱氨酸，谷胱甘肽或者利用氢 气顶吹细胞悬浮液来缓和,微波破碎,基于微波加热的瞬时性、选择性、和高效性，控制适宜的微波条件而实现。植物细胞不同部位的物质，对微波的吸收能力存在显著差异
10、。,机械破碎作用机制不同，有各自的适用范围和处理规模。适用范围：菌体细胞，目标产物。破碎大肠杆菌提取质粒DNA，珠磨法完整质粒收得率在90%,其他方法50%以下。因此针对目标产物性质（分子量、分子形态、稳定性等）选择细胞破碎法，并确定合适的操作条件非常重要。,机械破碎的缺点,需高能，并且产生高温和高的剪切力，容易使不稳定产品失活。破碎的有机体或者产物，非专一，产生碎片微粒尺寸的大范围细分布，大量的细微颗粒给后续分离造成困难。,4.酶溶法（Enzymatic Lysis）,（1）外加酶法,常用的溶酶,溶菌酶-1，3-葡聚糖酶-1，6-葡聚糖酶蛋白酶甘露糖酶糖苷酶肽键内切酶壳多糖酶等,溶菌酶主要用
11、于细菌类,细胞壁溶解酶是几种酶的复合物,如：对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入蛋白酶作用蛋白质-甘露聚糖结构，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层，最后只剩下原生质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破裂，释出胞内产物。,利用溶酶系统处理细胞时必须根据细胞壁的结构和化学组成选择适当的酶，并确定相应的次序。,酶溶法的优点：选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。,缺点：溶酶价格高，溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶），产物抑制的存在。如在溶酶系统中，甘露糖对蛋白酶有抑制作用，葡聚糖抑制葡聚糖酶。,诱发微生物产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞酶的活力，以达到细胞自溶的目的。影
12、响自溶过程的主要因素有温度、时间、pH值、激活剂和细胞代谢途径等。常用加热法和干燥法。缺点是：对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。,（2）自溶法（Autolysis）,某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。,5.化学渗透法（Chemical permeation）,该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。,如Triton X-100是一种非离子型清洁剂，对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双分子层，使某些胞内物质释
13、放出来。其他的表面活性剂，如牛黄胆酸钠、十二烷基磺酸钠等也可使细胞破碎。,（1）表面活性剂,可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞的破碎。,处理G-细菌，对细胞外层膜有破坏作用。G-细菌的外层膜结构通常靠二价阳离子Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂来填补，从而导致内层膜通透性的增强。,（2）EDTA螯合剂,能分解细胞壁中的类脂，使胞壁膜溶胀，细胞破裂，胞内物质被释放出来。甲苯、苯、氯仿、二甲苯及高级醇等。,（3）有机溶剂,*表示适用,各种试剂的不同作用机理，将几种试剂合理
14、地搭配使用能有效地提高胞内物质的释放率。,例：单独用0.1mol/L盐酸胍处理E.coli仅释放约1%的蛋白质,0.5%TritonX-100处理蛋白质释放率为4%二者合用，蛋白质释放率可达53%左右,通用性差；时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%；有些化学试剂有毒。,化学渗透法优点：,缺点：,对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内；细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。,将浓缩的菌体悬浮液冷却至-25形成冰晶体，利用500MPa以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。细胞破碎是由于
15、冰晶体的磨损，使包埋在冰中的微生物变形而引起的。此法主要用于实验室，适应范围广、破碎率高、细胞碎片粉碎程度低及活性保留率高等优点，但不适应于对冷冻敏感的生化物质。,6.其他方法,1.X-press法,X-press法,将细胞放在高渗透压的介质中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），达平衡后，转入到渗透压低的缓冲液或纯水中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞溶胀，甚至破裂。仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶处理或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。,2.渗透压法（Osmotic pressure）,渗透压法,细胞膜疏水键破裂胞内结冰细胞膨胀而破裂适
16、用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。,3.反复冻结-融化法,使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出来。气流干燥主要适用于酵母菌，一般在25-30的气流中吹干；真空干燥多用于细菌。冷冻干燥适用于较不稳定的生化物质如酶。,4.干燥法,三、破碎率的测定与破碎技术的研究方向,细胞破碎后，大量带电荷的内含物被释放到水相，使导电率上升。导电率随着破碎率的增加而呈线性增加。,1.破碎率的测定,直接测定法目的产物测定法导电率测定法,采用染色的方法把破碎的细胞与未破碎的细胞区别开来。如
17、采用革兰氏染色法染色酵母破碎液，完整的细胞呈紫色，而受损害的细胞呈亮红色。,将破碎后的细胞悬浮液离心分离细胞碎片，测定上清液中目的产物（如蛋白质或酶）的含量或活性，并与100%破碎率所获得的标准数值比较，计算其破碎率。,细胞破碎与固液分离紧密相关。,2.破碎技术的研究方向,多种破碎方法相结合与上游过程相结合与下游工程相结合,化学法、酶法、机械法相结合。如用溶解酶预处理面包酵母，然后高压匀浆，95MPa压力下匀浆4次，总破碎率接近100%。而单独采用高压匀浆法，同样条件下破碎率只有32%。,在发酵培养过程中，培养基、生长期、操作参数（如pH、温度、通气量、搅拌转速、稀释率等）等因素都对细胞壁膜的
18、结构与组成有一定的影响。细胞的破碎与上游培养过程有关。用基因工程的方法对菌种进行改造，以提高胞内物质的提取率也是非常重要的。在生长后期，加入某些能抑制或阻止细胞壁物质合成的抑制剂（如青霉素、环丝氨酸等），继续培养一段时间后，新分裂的细胞其细胞壁有缺陷，利于破碎；选择较易破碎的菌种作为寄主细胞，如革兰氏阴性细菌；在细胞内引进噬菌体基因，培养结束后，控制一定条件（如温度等），激活噬菌体基因，使细胞自内向外溶解，释放出内含物。耐高温产品的基因表达,作业:,1.常用细胞破碎方法(珠磨法、高压匀浆法、超声破碎法、酶溶法、化学渗透法)的原理、特点及适用性。2.举例说明采用多种破碎方法相结合提高破碎率的机理。3.试述破碎技术与上下游过程相结合提高破碎率的机理,
