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1、第二章 肿瘤分子生物学与细胞生物学,Figure 2.1a The Biology of Cancer(Garland Science 2007),Figure 11.7 The Biology of Cancer(Garland Science 2007),肿瘤分子生物学与细胞生物学,第一节 癌基因与细胞转化第二节 细胞遗传学与肿瘤形成第三节 细胞分化与肿瘤,第一节 癌基因与细胞转化,1.癌基因肿瘤来源于正常细胞肿瘤相关因素-致癌、促癌致癌物主要是作用于DNA而非酶和蛋白质 2.癌基因的活化方式,病毒和肿瘤的关系 1965年Fried分离到一个温度敏感的多瘤病毒1969年Vogt等分离到温度
2、敏感的突变型Rous肉瘤病毒。逆转录酶的发现,1.癌基因,oncogene不仅存在于肿瘤细胞中，也广泛存在于正常细胞，在正常细胞的生长、分化以及凋亡过程中具有重要的调节功能，当癌基因在其结构或表达水平或基因表达位置发生变化时，将会导致细胞的恶性转化。病毒癌基因，细胞癌基因,劳斯（Rous,Francis Peyton）美国内科医生,病毒癌基因,viral oncogene,v-onc 病毒基因组中存在诱发肿瘤的核酸片段特点病毒癌基因具有诱发细胞转化恶变的能力从进化观点看，病毒癌基因来源于细胞癌基因，故两者序列十分相似。形成的机制：病毒感染细胞过程中从细胞癌基因捕获而得的 DNA片段。,原癌基因
3、、细胞癌基因,proto-oncogene,p-onc or cellular oncogene,c-onc 动物和人体细胞内存在一类与病毒基因同源的基因，它们在正常细胞内起调控生长和分化的作用,细胞癌基因该基因位于细胞内，未被激活时无致癌作用。细胞原癌基因普遍存在于多种生物（包括人类）中，在进化上具有高度保守性。调节细胞的发育和分化：mos、myc、src、raf和 rel 调节细胞的生长和增殖：erb B、p21、raf、ras,细胞癌基因与病毒癌基因不同,基因组成：细胞癌基因基因组成完整，但病毒癌基因缺失调节转录的内含子序列，该部位为病毒序列所取代，能有效地转录病毒mRNA；转录控制：细
4、胞癌基因的转录由正常细胞调节转录序列控制，以低水平进行；病毒癌基因的转录由病毒的长末端重复序列（LTR）控制，在高水平上进行；结构功能：大多数病毒癌基因与同源的细胞癌基因比较，已发生改变（如点突变）而增强其转录能力；编码的蛋白：病毒癌蛋白常常缺失原癌蛋白的羧基端（C端），而具有转录活性。,2.癌基因的活化,（1）点突变 Point mutation（2）插入诱变 insertional mutagenesis（3）基因易位 translocation（4）基因扩增 amplification（5）癌基因缺失 gene deletion（6）基因甲基化 methylation,（1）点突变 Po
5、int mutation,是癌基因活化最常见的方式之一，常见形式有碱基替换、插入和缺失,化学致癌剂诱发点突变亚硝基甲环脲(NMU)诱发的鼠乳腺癌中，H-ras基因在NMU的作用下，第12 密码子的GGC突变为GAC,突变活化癌基因的机制突变发生在编码区，则造成该基因所编码的一级结构发生改变，并进而改变该蛋白质的生物学作用性质。突变发生于5-末端的非编码区，导致表达调控异常,（2）插入诱变,不携带病毒基因的慢性转化型病毒通过其前病毒（provirus）插入到细胞基因组而引起靶基因转录增强，称为插入诱变（insertional mutagenesis）禽类白细胞增生症病毒（ALV），本身无癌基因，
6、但其感染细胞后，前病毒两端LTR插入到细胞c-myc基因的近旁而使c-myc基因活化，使其表达比正常时高50100倍而致淋巴瘤,（3）基因易位,基因领域效应（gene territorial effect）真核细胞中，当两个位于同一DNA链上的基因之间的距离小于规定长度时，其中一个基因转录受抑制。易位后，消除了基因领域效应而增强了转录活性，造成易位基因的转录性激活。基因易位造成的另一种后果是产生融合基因，导致异常融合蛋白的表达。,Ph1 chromosome,Visual Evidence of Ph1 chromosome,This micrograph uses fluorescence
7、in situ hybridization(FISH)to reveal the ABL DNA(red)and the BCR DNA(green)in the interphase nuclei of the leukemic cells of a patient with CML.The red dot at left center reveals the location of ABL on the normal chromosome 9;the green dot(top center)shows BCR on the normal chromosome 22.The combine
8、d dots(red+green=yellow)at the lower right reveal the fused BCR-ABL gene on the Philadelphia chromosome.Micrograph courtesy of Douglas C.Tkachuk.,（4）基因扩增,是指细胞原癌基因在细胞基因组内拷贝数的增加及其表达水平的提高，由于基因的剂量效应，使细胞无控制地生长，并向异常的方向分化。基因扩增是癌基因活化的主要方式之一多拷贝的DNA以游离形式存在称之为双微体（double minute,DMs），也可再次整合入染色体形成均染区(homogeneousl
9、y staining region,HSRs)，,Myc基因扩增形成双微体（黄色）的核型 引自Molecular Biology of the Cell.4th ed.2002,Myc基因扩增形成均染区（黄色）的核型 引自Molecular Biology of the Cell.4th ed.2002,（5）基因甲基化,在DNA 甲基转移酶(DNA methyltransferase,DMT)的催化下,以s-腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体,将甲基转移到特定的碱基上的过程。在哺乳动物,DNA甲基化主要发生在5-CpG-3的C上.生成5-甲基胞嘧啶(5mC),肿瘤中普遍存在DNA甲基化状态的改
10、变。表现为总体的甲基化水平降低与局部的甲基化水平升高。抑癌基因与修复基因的高甲基化与反转录转座子、癌基因的去甲基化,CpG岛甲基化密度与癌症进展,DNA甲基化的检测方法,甲基化敏感性限制性内切酶 Hpa和Msp均能识别CCGG序列，CmCGG Msp I识别，Hpa不识别mCmCGG 都不识别利用Hpa-Msp 的这种属性处理DNA，随后进行Southern或PCR扩增分离产物，明确甲基化状态,甲基化特异性PCR(Methylmion Specific PCR，MSP)首先用亚硫酸氢钠修饰处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶都被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则不变。然后设计针对甲基化和非
11、甲基化序列的引物并进行PCR扩增，最后通过琼脂糖凝胶电泳分析，确定与引物互补的DNA序列的甲基化状态。,（6）癌基因缺失,肿瘤细胞中常发现有癌基因DNA片断的缺失，这种既可以是单个碱基对，也可以是一个片断，甚至为整个基因的丢失。癌基因内小的缺失，在正常情况下为抑癌蛋白活化的部分。在多形性神经胶质瘤，EGFR基因扩增是常见的晚期事件，但多数病例不仅有基因扩增，而且在扩增的基因内也有缺失现象出现，缺失常发生在27密码子，这样就产生了较短的EGFR蛋白，进一步使该蛋白活化。,常见原癌基因的激活方式和人类肿瘤,思考题,癌基因、病毒癌基因、原癌基因癌基因的活化方式基因领域效应肿瘤细胞中DNA甲基化的特点
12、,肿瘤分子生物学与细胞生物学,第一节 癌基因与细胞转化第二节 细胞遗传学与肿瘤形成第三节 细胞分化与肿瘤,第二节 细胞遗传学与肿瘤形成,1.遗传性恶性肿瘤2.遗传性癌前病变,肿瘤是一种体细胞遗传病。各种环境因素直接或间接作用于体细胞的遗传物质，引起染色体或DNA的改变，经过促进和进展等过程，才能形成各种恶性肿瘤。,1.遗传性恶性肿瘤（1）视网膜母细胞瘤(retinoblastoma),发生率约1/210001/10000，多在4岁以前发病早期为眼底灰白色肿块，多无自觉症状，肿瘤长入玻璃体，使瞳孔呈黄色光反射时，称为“猫眼”。可分遗传型和非遗传型两类 Rb基因,Knudson二次突变学说,（2）
13、Wilms瘤(肾母细胞瘤，WT),婴幼儿恶性胚胎肿瘤，发病率约为1/10000，3/4的肿瘤发生在4岁前，90在20岁内发生可分为遗传型和非遗传型 Wilms瘤基因(WT)是一种抑癌基因，其基因产物为一种有锌指结构的蛋白质,Role of WT1 during kidney development Formation of the kidneys is induced by the reciprocal interaction of the metanephric mesenchyme and the invading ureteric bud(A).WT1 is upregulated on
14、ce the mesenchyme begins to form epithelial condensates around the ureteric bud tips(B).In the absence of WT1 the mesenchyme becomes apoptotic and invasion of the ureteric bud does not occur,suggesting that WT1 acts as a survival factor for populations of embryonic kidney cells.During the later stag
15、es of renal development,WT1 may inhibit mesenchymal cell proliferation,thereby allowing the formation of S-shaped bodies(C),which will elongate and eventually connect to the branching collecting duct tree to give rise to the mature nephrons(D).,（3）神经母细胞瘤(NB),是一种儿童中常见的恶性胚胎肿瘤，起源于神经嵴，发病率约为1/10000 致病基因定
16、位于1p36.2p36.1,2遗传性癌前病变（1）家族性结肠息肉综合征(FPC),常染色体显性遗传，其特征为病变局限于结肠和直肠，息肉为腺瘤性，数目可多可少，40岁前多恶变为癌。本病的基因APC已定位于5q21q22，是一种抑癌基因，在APC基因有杂合性缺失的基础上，又经癌基因K-ras2、抑癌基因DCC、Tp53等的改变等多步变化，才形成结肠腺癌。,（2）神经纤维瘤（NF）,常染色体显性遗传；近年来，NF基因已定位于11q11.2，它是一种抑癌基因，其产物有特异地抑制ras癌基因的作用,（3）基底细胞痣综合症（BCNS）,常染色体显性遗传，已将BCNS基因定位于9q22.3q31,肿瘤分子生
17、物学与细胞生物学,第一节 癌基因与细胞转化第二节 细胞遗传学与肿瘤形成第三节 细胞分化与肿瘤,第三节 细胞分化与肿瘤,1.细胞周期的调控机制2.细胞周期调控异常与肿瘤,肿瘤之所以生长的一个原因是肿瘤细胞中处于G0期的细胞很少，它比正常组织有较多的细胞参加增殖周期；肿瘤细胞增殖的无限制性。肿瘤细胞复制的高保真性差，导致细胞遗传不稳定。,Cell Cycle,间期 Interphase:G1,S,G2有丝分裂期 Mitosis:前期prophase中期metaphase后期anaphase末期telophase,Leland H.Hartwell,R.Timothy(Tim)Hunt,Sir Pa
18、ul M.Nurse,2001年10月8日美国人LelandHartwell、英国人Paul Nurse、TimothyHunt因对细胞周期调控机理的研究而获诺贝尔生理医学奖。,1细胞周期调控机制,（1）CDK(cyclin-dependent kinase)（2）细胞周期蛋白（cyclin）（3）CAK（4）CKI,（1）CDK(cyclin-dependent kinase),是细胞周期调控网络的核心cyclin 对CDK 具有正性调控作用CAK对CDK具有正性调控作用CKI 对CDK 具有负性调控作用,（2）细胞周期蛋白（cyclin）,是根据其蛋白质水平在细胞周期内呈时相性起伏的特征。
19、所有的cyclin蛋白分子结构上，都有一个由100多个氨基酸组成的相对保守的区域，称为细胞周期盒。Cyclin box的主要功能是与CDK结合并激活之,各种cyclin 含量在细胞周期呈周期性变化,与CDK 结合形成复合物并激活其活性,对细胞内特定底物进行磷酸化后,通过泛素依赖性的蛋白酶水解途径降解失活,不同类型的CDK/cyclin复合体,CDK的Thr 161/160磷酸化可促进CDK-Cyclin的结合。对Thr 160/161磷酸化的蛋白激酶是CAK。CAK的两个重要亚单位是CDK7和CyclinH.,（3）CAK,CAK,CDK的激活机制,CDK Thr 160/161磷酸化 CDK
20、/Cyclin,cell cycle,Weel/CDC25对CDKThr14/Tyr15磷酸化和去磷酸化,CDK的激活和失活还与 Thr14/Tyr15 的磷酸化和去磷酸化有关。Thr14/Tyr15的去磷酸化导致CDK的激活 使CDK上Thr14/Tyr15磷酸化的蛋白激酶是weel,使其去磷酸化的磷酸酶是CDC25。,（4）CKI对CDK的抑制,CKI有两大类蛋白组成Ink4家族：P16INK4a、P15INK4b、P18INK4c和P19INK4d，抑制CDK4、CDK6。Cip/Kip家族：p21Cipl、P27Kip1和P57Kip1，抑制CDK2、CDK4、CDK6等。,2.细胞周
21、期调控异常与肿瘤,（1）细胞周期的驱动机制（2）细胞周期的监控机制（3）细胞周期在肿瘤中的含义,（1）驱动机制G1-S期,DNA的复制及蛋白质的合成做准备，产生了cGMP、cAMP、RNA、多胺、胸苷激酶及脱氧核苷酸等物质。G1期限制点（restriction point，R点）哺乳动物细胞体外培养时，需要添加多肽生长因子促进细胞的分裂。如果缺少生长因子,就会被阻止在G0阶段,一旦在培养基中添加了生长因子,这些细胞在1416小时后通过细胞周期限制点,再过68小时,细胞进入S期,并完成余下的细胞周期过程。若将通过限制点的细胞从含有生长因子的培养基转移到没有生长因子的培养基上,这些细胞不能进入S期
22、。但是,细胞一旦通过了G1期的限制点,这些细胞就能够进入S期并完成其后的细胞周期过程。由此推测,哺乳动物细胞周期的限制点相当于酵母的START点。,G1-S transition：Rb protein,G2-M期,cyclinA、cyclinB与CDK1结合，CDK1使底物蛋白磷酸化：如将组蛋白H1磷酸化导致染色体凝缩，核纤层蛋白磷酸化使核膜解体等下游细胞周期事件。,（2）细胞周期检查点（checkpoint）,G1/S检验点:在酵母中称start点，在哺乳动物中称R点(restriction point)，控制细胞由静止状态的G1进入DNA合成期，相关的事件包括：DNA是否损伤？细胞外环境是
23、否适宜？细胞体积是否足够大？S期检验点：DNA复制是否完成？G2/M检验点：是决定细胞一分为二的控制点，相关的事件包括：DNA是否损伤？细胞体积是否足够大？中-后期检验点（纺锤体组装检验点）：任何一个着丝点没有正确连接到纺锤体上，都会抑制APC的活性，引起细胞周期中断。,Cell cycle checkpoint,ATM/ATR（共济失调毛细血管扩张中的突变）最早发现于毛细血管扩张性共济失调症患者，人类中大约有1%的人是ATM缺失的杂合子，表现出对电离辐射敏感和易患癌症。ATM编码一个蛋白激酶，结合在损伤的DNA上,（3）细胞周期在肿瘤中的含义,癌细胞的一个特征性表型异常是细胞周期调控失调 正
24、常细胞转化为肿瘤细胞有赖于控制正常细胞周期进程的基因突变，从而导致调节细胞生长信号的失控 驱动机制破坏监控机制破坏,细胞周期驱动机制的破坏,人们把细胞周期驱动机制比作一辆汽车或引擎，驱使其运行的因素好比“油门”；制动器运行的机制犹如“刹车”。持续地踏住“油门”或“刹车”失灵，终将失控。细胞进入失控性生长,细胞周期监控机制的破坏,每一完整检测点的四部分中的任何一部分出了问题，都将造成细胞遗传的不稳定性，如不能发现DNA损伤(ATM基因突变)细胞周期不能阻滞(p53突变)DNA修复错误(MLH1突变)决定错误(如Bcl-2突变),DNA监控机制的破坏将导致染色体重排基因缺失扩增易位纺锤体监控机制的破坏导致有丝分裂过程中染色体不能分开子代细胞中染色体丢失或增加（异倍体）,思考题,细胞周期的调控机制细胞周期的监控机制肿瘤细胞中细胞周期调控的异常,
