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1、1,干细胞及其应用前景,Stem Cells and Promise,2,干细胞的研究史,1996年7月5日，苏格兰爱丁堡市郊的罗斯林研究所应用细胞核转移技术克隆了一头大个儿羊羔，伊恩威尔默特以著名乡村歌手多利帕顿的名字命名这头羊。,3,细胞核转移技术试管婴儿,4,干细胞研究的意义何在？,干细胞之所以引起世人瞩目，主要是因为单性繁殖和克隆技术被过度宣传，但这绝不是干细胞研究的主要方向，目前的技术也根本达不到这个水平。并涉及伦理道德问题。,5,再生医学的必然性,再生医学是生命科学发展史上的一个必然的过程，年的生命科学发展在医学上造就了一个左手拿刀，右手拿毒药，以对抗生命的物质、对抗疾病的方法来保
2、障生命安全，其实这是非常矛盾的。这种方法本身不符合生命哲学的理论，也不符合生命规律，是违背生命规律的。,6,再生医学的概念,广义上讲，研究如何促进创伤与组织器官缺损生理性修复以及如何进行组织器官再生与功能重建。可以理解为通过研究机体的正常组织特征与功能、创伤修复与再生机制及干细胞分化机理，寻找有效的生物治疗方法，促进机体自我修复与再生，或构建新的组织与器官以维持、修复、再生或改善损伤组织和器官功能。狭义上讲，是指利用生命科学、材料科学、计算机科学和工程学等学科的原理与方法，研究和开发用于替代、修复、改善或再生人体各种组织器官的定义和信息技术，其技术和产品可用于因疾病、创伤、衰老或遗传因素所造成
3、的组织器官缺损或功能障碍的再生治疗。,7,干细胞分化,生理意义：每天人的细胞都在活动，器官也在活动，每一天都有凋亡、损伤和坏死，但是每一天都有细胞再生来及时补充。这个过程有一些是很明显的，像皮肤、粘膜、口腔等等每天都在变化，当然这个变化包括毛发也是一样，是一个动态过程。病理意义：现在已经发现，癌症、糖尿病、帕金森综合症等一系列免疫系统、神经系统疾病都可能是干细胞变异引起的。,8,干细胞的概念,所谓干细胞（Stem Cell，SCs）是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。它包括胚胎干细胞和成体干细胞。它能产生特异的细胞类型，形成人体的组织和器官。干细胞的发育受多种内在机制和微环境因素的影响。,9,
4、干细胞,概念、分类、特点人胚胎干细胞间充质干细胞成体干细胞,10,全能干细胞（Totipotent SCs）,从探讨受精卵的发育开始，受精卵既然可以变成一个个体，也就是变成人类所有的细胞，所以我们称受精卵具有全能性。实际上孪生双胞胎，就是受精卵在一分为二的时候，失去彼此间的联系，然后各自又发展出完整的个体，所以孪生双胞胎会长得一模一样。事实上，受精卵由一变为二，二变为四，四变为八的过程中，这八个最初的细胞都还具有全能性。,11,受精卵具有全能性,12,全能干细胞,多能干细胞,单能干细胞,13,多能干细胞,14,全能干细胞,多能干细胞,15,多能干细胞,一九九五年，美国禁止政府以经费资助人类胚胎
5、的研究和应用，不过私人的生技公司仍持续投入经费，一九九八年十一月多能干细胞在实验室中存活：汤姆森（James Thomson）博士从人工受精诊所得到胚胎，这些胚胎原本是不孕症父母预备用来繁殖后代的，由于准备得较多，手术后有剩余，本来将被销毁。但在得到捐赠者的同意之后，研究人员由这些胚胎内部的十六个细胞中，得到了多功能的干细胞。科学1998 吉尔哈特（J.Gearhart）博士则是从医院得到合法堕胎的胚胎，他从原本会发育成睪丸或卵巢的区域取得原始生殖细胞，也具有多功能干细胞的特性。美国国家科学院院报(PNAS)1998,16,多能干细胞,17,多能干细胞,一直到变为三十二个细胞的时候，其中十六个
6、细胞在外围，十六个细胞在内部，在外围的细胞会发展成胎盘等，在内部的十六个细胞虽然没有办法变成完整的个体，也就是失去了全能性，但是他们还是可以变成大部分的组织或器官。像这样功能很多的细胞，我们称为多功能干细胞。,胚胎干细胞 来自4-5d胚泡中的内细胞群（inner cell mass，ICM）胚胎生殖细胞 从5-10周胎儿生殖嵴的原生殖细胞中分离出伦理道德的困惑！,18,诱导多功能干细胞（induced pluripotent stem cell，又称iPS细胞）,2007年11月，美国和日本的两个研究小组几乎同时宣布成功将人体皮肤细胞改造成了几乎可以和胚胎干细胞相媲美的多功能干细胞-“iPS细
7、胞”，由于绕开了胚胎干细胞研究一直面临的伦理和法律等诸多障碍，科学界对这种细胞表现出强烈的兴趣，纷纷制订相关的研究计划。这项技术的出现，可以对人类发育的研究不用再经过受精卵而进行，避免了伦理问题，同时，在对新药的试验上，也可以直接用人体干细胞进行试验，不用再通过动物实验的环节，毕竟人体和动物在代谢上有很大不同，大约80%至90%在动物实验中通过的药品，会在人体试验中被淘汰。,19,20,iPS治疗镰状红细胞贫血,干细胞多能性维持机制,2010年4月10日生物化学期刊(JBC)，中国科学院动物研究所和遗传发育研究所的研究小组在国际上首次发现并明确证实决定小鼠（哺乳动物）干细胞多能性的关键基因决定
8、簇位于小鼠12号染色体的一个印记区域内，包含数个蛋白编码基因和一个非常保守的microRNA聚集区。第一次明确提出了鉴定多能性细胞的有效标志，此项成果将革命性地改变干细胞和iPS细胞技术，解决了由于不能进行嵌合体实验而无法确定人类胚胎干细胞及iPS细胞多能性的问题，改变国际干细胞研究格局，大大加速干细胞研究的进程，提高中国在国际干细胞研究领域的战略地位。,21,22,23,这些多能干细胞再继续发展、分裂，就形成血液干细胞以及皮肤干细胞等等，而这些干细胞再进一步分化成各式各样的体细胞、组织以及器官。从这个角度来看的话，如果我们能得到全能细胞或是多功能干细胞，然后做进一步的研究，就有可能发现如何从
9、一个细胞发展成一个器官。,单能干细胞,24,干细胞的分类,按分化潜能分:全能干细胞多能干细胞（诱导多能干细胞,iPS）单能干细胞,25,全能干细胞,可有序分化成来自内、中、外三个胚层的各种细胞,26,干细胞的分类,按分化潜能分:全能干细胞多能干细胞（诱导多能干细胞,iPS）单能干细胞按供体组织所处发育时期胚胎期干细胞成体干细胞,27,成体干细胞（adult stem cell，ASC）,1.成体干细胞可分化成某一组织或器官的所有类型的终末分化细胞.,2.成体干细胞来源:骨髓、血液、角膜、视网膜、脑、骨骼肌、牙髓、肝脏、皮肤、胃肠道上皮、胰腺和脂肪,3.可塑性（plasticity）：一种成体干
10、细胞生成另一种组织细胞的能力。例如骨髓源性的成体干细胞分化为类似神经细胞的细胞。,28,干细胞的特点,多向分化自我更新可塑性,成体干细胞的可塑性,29,根据其来源组织分：,血液干细胞（来源于血液）,胰腺干细胞（来源于胰腺组织）,神经干细胞（来源于神经组织）,多属于成体干细胞,如:,30,生命科学,新药试验,疾病研究,31,第三节 间充质干细胞,32,（一）分离培养特性,（二）表型特征,（三）自我更新及可塑性,一MSC的生物学特性,33,（一）分离培养特性,20世纪70年代,Fredenstein 等首先成功地从骨髓中分离出MSC,全骨髓标本,分离方法：,培养,约2h后,未黏附细胞：造血干细胞、
11、造血后代细胞,黏附细胞：即为MSC呈纺锤形,间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）是中胚层发育的早期细胞,脂肪、皮肤,34,（二）鉴定,形态表型中胚层分化,35,二 分化潜能,（一）MSC的成骨分化,（二）MSC的软骨分化,（三）MSC的成脂分化,（四）MSC的成肌分化（用5-氮胞苷诱导）,（五）MSC的成肝分化,（六）MSC的神经分化,36,（一）MSC的成骨分化,1994 年，Richard等：,10-8M地塞米松重组BMP-2,成骨细胞,MSC,1997年Jaiswal 等优化了成骨诱导体系，发现在DMEM中加入 100mM地塞米松 0.05 mM抗坏血酸-2
12、-磷酸盐 10mM-磷酸甘油 效果最好,37,（二）MSC的软骨分化,体外诱导：体内实验：自体MSC 促进半月板等软骨中的缺陷修复,38,（三）MSC的成脂分化,地塞米松体外诱导 MSC成脂肪细胞；,1,25(OH)2 D 3抑制地塞米松对MSC的该分化作用,临床上大剂量激素治疗后，股骨骨髓内脂肪组织增多，骨内压增高，骨循环障碍 同时骨修复过程缓慢 可能是大剂量激素治疗后股骨头缺血性坏死的原因,39,（四）MSC的成肌分化(用5-氮胞苷诱导),（五）MSC的成肝分化,雌性受者鼠肝受损，接受雄性供者鼠的MSC移植，移植后第13 天，在受者鼠中间检测到供者来源的肝细胞和肝卵圆细胞,40,（六）MS
13、C的神经分化,体内实验：1999年，Azizi 等直接将人骨髓基质细胞注射入鼠纹状体白质中，发现MSC在局部微环境的诱导下分化为星形细胞 少突胶质细胞 神经元,41,Brazelton从转基因鼠（表达绿色荧光蛋白，GFP）中获得成年骨髓细胞，通过尾静脉注射入受到致死剂量照射的同基因小鼠中，发现各类脑细胞中都含有GFP 阳性的细胞，且多数GFP 阳性的细胞显示出神经特异性标志,体外实验：2000年Woodbury等首次：人和大鼠 MSC 2-巯基乙醇和BHA体外诱导 神经细胞,42,（一）研究细胞增殖与分化机理的模型,MSC的应用,利用MSC在体外可以分化为成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞和脂肪细胞
14、等模型,可以研究在分化过程中信号转导系统、基因表达的差异等，为进一步阐明其中的分化机理奠定基础.,43,44,（二）组织工程的种子细胞,组织工程是在体外构建有生物活性的组织用于损伤组织或器官的修复。寻找满意的种子细胞是组织工程的关键环节,MSC 分离方便 扩增迅速 具多向分化潜能 适合自体移植,因此是一种合适的种子细胞,种子细胞+生物可降解材料,45,46,（三）MSC细胞替代治疗,1 MSC具有支持造血的功能，,2 可用MSC治疗心肌损伤或坏死 3 可用MSC治疗神经退行性疾病 4 可用MSC治疗软骨损伤,因此将体外扩增的MSC与造血干细胞 联合输注 可提高造血干细胞移植的成功率,47,48
15、,（四）基因治疗,例如骨形成缺陷是一种I 型胶原基因变异病,改造过的MSC分化的成骨细胞形成正常的类骨质,用基因转染的MSC治疗遗传缺陷性疾病（MSC易于外源基因的导入）,将携带正常I 型胶原基因的载体,转入自体的MSC,扩增,回输到病人骨髓中,49,成骨缺损 获得性骨疾病遗传性骨疾病,的基因治疗,血友病的基因治疗,神经系统疾病（如帕金森氏病）,的 基因治疗,50,第四节 成体干细胞及其应用前景,一 造血干细胞：造血干/祖细胞移植（重建造血）,二 神经干细胞,在成年动物脑室下区 在成年小鼠脊髓内 在成年大鼠海马,神经干细胞的存在部位：,上海华山医院朱剑虹教授 将从八名脑部受损的病人体内提取的中
16、间干细胞重新植入病人脑部,51,（一）内皮祖细胞,骨髓中存在内皮干细胞：,骨髓来源的细胞能够进入大鼠小鼠缺血的心肌区域，生成血管和心肌细胞,从外周血中分离到内皮祖细胞 自体移植入缺血一侧肢体 促进新血管的形成,外周血中存在内皮祖细胞：,三 其他组织的成体干细胞,52,（二）骨骼肌干细胞,（三）皮肤上皮祖细胞,（四）胰腺和肝脏的干细胞,53,脐血干细胞,54,第二节 人胚胎干细胞及其应用前景,一人ES细胞,（一）人ES细胞研究概况,（二）人ES细胞系的特征,（三）人ES细胞的鉴定方法,55,（一）人ES细胞研究概况,1989年 Prea 等从人畸胎瘤分离ES细胞,1994年Bonyno等在胚胎发
17、育至囊胚后添加白血病抑制因子(LIF)，获得类人ES细胞克隆,1995年 Thomson 等从恒河猴的囊胚中分离建立恒河猴ES细胞系（第一个建株的灵长类动物的ES细胞）,56,1998 年月李树浓等从体外受精胚胎分离到人的类ES细胞，开创了人类ES细胞分离克隆的先河,1998 年11月 Thomson 等从体外受精胚胎发育至囊胚期的个内细胞团分离克隆出个人ES细胞系,1998年 Gearhart等从受精后周流产胎儿的生殖嵴和肠系膜中分离克隆出个多能干细胞系,57,（二）人ES细胞系的特征,形态特征：胞体体积小，核大，有一个或多个核仁,生长特性：ES细胞系集落中，ES细胞紧密堆积，无明显细胞界限
18、，形似鸟巢,核型：具有稳定的整倍体核型具有正常XY核型 XX核型,58,细胞冻存、解冻,经适宜的冷冻、解冻后不丧失生长增殖等特性,细胞表面抗原,人ES细胞表达早期胚胎阶段特异性抗原（SSEA-3,SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1-81）和碱性磷酸酶（注：SSEA：特化时期胚胎抗原，TRA：肿瘤抵抗抗原）,端粒酶活性：人ES细胞高度表达端粒酶活性（而人二倍体细胞缺乏端粒酶活性）,59,7 碱性磷酸酶(AKP)的表达,8 人ES细胞的分化潜能,AKP常用来作为鉴定ES细胞分化与否的标志之一ES分化之前：AKP（）ES已分化的：AKP弱阳性或阴性）,（）体内分化潜能,（）体外分化潜能,（3
19、）嵌合体试验,60,（）体内分化潜能：人ES细胞在体内可向三个胚层分化,（）体外分化潜能：体外常用滋养层或白血病抑制因子 来抑制人ES细胞分化，同时保证其增殖。,当去除这些因素或加入某些分化诱导剂时，ES细胞会进行定向分化。,体外培养条件下，ES细胞通常可分化为 造血细胞神经细胞心肌细胞骨骼肌细胞上皮细胞,61,（3）嵌合体试验：,是传统验证ES细胞全能性的重要实验，即ES细胞与正常胚胎嵌合，如能产生各个组织器官的嵌合体而且能产生功能性配子的嵌合体，即可证实分离到全能性的ES细胞系。,62,63,（四）人ES细胞的鉴定方法,ES细胞形态学鉴定：形态结构和生长特性,2 核型分析：具有正常二倍体核
20、型,3 碱性磷酸酶染色,4 SSEA免疫荧光标记,5 分化能力检测,64,（1）体外分化试验,（2）体内分化试验,（3）嵌合体形成,5 分化能力检测,65,（1）体外分化试验,将所得细胞系制成悬液培养，若为ES细胞，则部分细胞贴壁，分化为神经肌肉软骨等不同组织细胞，部分细胞悬浮生长，形成简单类胚体和囊状胚体,66,将获得的一定量的细胞 注射到同源动物的皮下，若该细胞为ES细胞，则经过一段时间后，动物皮下注射处有组织瘤生成，取瘤切片可见代表三个胚层的不同组织细胞,（2）体内分化试验,67,（3）嵌合体形成,将ES细胞注射或聚合至受体胚胎，再将该胚胎植入同期化受体,68,二 人ES细胞的应用前景与
21、展望,（一）临床医学,（二）发育基础研究,（三）药物测试,69,（一）临床医学,全能性的ES细胞是细胞、组织甚至器官移植供体的理想来源,血液系统疾病,2 神经系统疾病,3 肝脏疾病,70,1 血液系统疾病,ES细胞,体外诱导,造血干细胞,各种血细胞,T细胞 B细胞,（造血功能重建）,（免疫重建）,71,2 神经系统疾病,ES细胞,体外诱导,神经胶质前体细胞,神经前体细胞,成熟神经元,（移植治疗髓鞘缺陷大鼠）,（治疗神经系统退行性疾病）,72,3 肝脏疾病,将ES细胞植入肝功能不全 或肝硬化患者体内,73,（二）发育基础研究,对胚胎干细胞进行基因打靶，评估体外分化能力，直接探查基因功能（ES细胞
22、系的体外可操作性且不会引起与胎儿试验相关联的伦理问题）,74,（三）药物测试,ES细胞具有组织、细胞的广谱性，它发展为胚体后生物系统，可模拟体内细胞与组织间复杂的相互作用，可作为评价新药及化学产品毒性及效能的检测系统，可减少动物检测，降低成本，具有重要的商业价值。,75,三ES细胞研究尚需解决的问题,（一）定向诱导分化ES细胞为特定类型的功能细胞,（二）定向诱导分化ES细胞为由功能的器官,2 离体器官的保存问题,（三）定向诱导分化的可调性（即ES细胞移植后的成瘤性问题）,（四）组织相容性问题（即移植排斥反应问题）,（五）ES细胞的遗传学稳定性问题（即DNA复制过程中的基因突变问题）,1 分化成器官的技术问题,76,复习题,试述间充质干细胞的生物学特性及应用前景.,
