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1、本课内容,蛋白质的产率问题蛋白质工程概要蛋白质工程的应用实例,蛋白质的产率问题,在基因工程菌株中，影响外源蛋白质产率的因素包括载体相关因素和宿主相关的因素。与载体有关的因素主要有：表达载体拷贝数的调控启动子的强弱与转录调控转录终止子的效应密码子的使用频率信号肽的特征与分泌调控影响产率的宿主因素主要有二：mRNA的稳定性；宿主的蛋白质降解系统。,载体拷贝数,通过调控基因拷贝数来提高外源基因表达产量被称作基因的剂量效应，是一个对生产过程产生较大影响的因素。在多数情况下可以理解为质粒拷贝数的多少，与ori有关。在克隆实验中常使用拷贝数100的多拷贝质粒。在以E.coli为宿主的生产中，常使用可以根据
2、培养温度调整拷贝数的runaway质粒（如pCP3），42 时拷贝数最高可达几千个。,启动子的强度,启动子的强度是指一个启动子能够多大程度地结合RNA聚合酶并引发转录过程。原核基因的启动子主要包括-35和-10区，真核基因启动子则主要是TATA盒与一些上游转录活化序列UAS。这些序列被称作顺式作用元件（cis序列）。一般认为启动子的强度与cis序列的最佳配置相关，在人工构建强启动子时主要是尝试把不同基因的启动子的cis序列进行重组。,启动子,根据表达的方式可以把启动子分为两类：构成性表达启动子：持续表达诱导性表达启动子：只在诱导条件下表达。,诱导性表达,强力启动子的优点是表达的蛋白质多，但是随
3、着mRNA和蛋白质的大量合成与积累，反而会阻碍细胞的生长，或激活宿主的蛋白质降解系统。这都会造成目的蛋白产量的下降。如果目的蛋白对宿主细胞有毒性的话就更是如此。因此在实际生产中，更多使用的是那些仅在需要时才进行强力表达的诱导性启动子。E.coli的诱导表达系统几乎全部是利用E.coli 来源的各种操纵子中的启动子，如lac启动子。,E.coli 的乳糖操纵子lac operon,乳糖操纵子包含启动子Plac、操纵基因O和3个结构基因lacZ：-半乳糖苷酶lacY：-半乳糖苷透性酶lacA：-半乳糖苷转乙酰酶操纵子上游的lac I 编码阻遏蛋白。,异乳糖与阻遏蛋白结合，导致其构象变化，和DNA的
4、亲和性降低，不能与操纵基因O结合，对Plac的阻遏被解除，lac Z等基因的转录得以进行。IPTG：异乳糖的类似物，可作为lac启动子的诱导物，其好处是不会被降解，使启动子一直被诱导。,阻遏蛋白,乳糖,Lactose,转录,IPTG,异乳糖,转录终止子,从生产角度来说，不必要的长序列转录产物的生产会额外地耗费能量。当对特定基因进行强力表达时，转录可能会波及该基因的下游区域，既会给宿主带来额外负担，也会使质粒的稳定性下降。因此为了提高生产性能，往往会在目的基因下游添加终止子序列。如E.coli中的rRNA基因rrnB的终止子、T7噬菌体的终止子等。,密码子使用频率,不同物种对各种密码子的使用频率
5、不同，原因之一是细胞中各种tRNA分子所占的比例不同。在工业水平的生产中，密码子的选择会明显地影响蛋白质的纯度和产量。基因中如果高频率出现对应于少量tRNA的密码子，蛋白产量会明显降低。因此一条重要的基因设计原则就是要选择最适密码子：对应于最多tRNA分子的密码子。,信号肽与分泌生产,外源蛋白质在宿主菌中表达时可能会遇到细胞毒性问题，另一些蛋白则可能因过剩表达而形成不溶性的包涵体。采用细胞外分泌的方法生产是避免上述情况发生的有效手段。分泌至细胞外的目的蛋白不仅可以正确折叠，而且表达量较高，并有利于分离与精制。,乳酸克鲁维酵母,信号肽,信号肽位于分泌蛋白质的N-末端，由1530aa组成，末端还存
6、在一段可被信号肽酶切断的序列。如：酵母蔗糖酶信号肽：信号肽的重要性就在于它是蛋白质向细胞外分泌的充分必要条件，因此研究人员开发了一系列利用信号肽进行蛋白分泌表达的载体。细菌中B.subtilis 是理想的蛋白质分泌生产宿主，酵母S.cerevisiae、P.pastoris和曲霉属的霉菌则是比较适合作分泌蛋白生产的真核生物宿主。,宿主的蛋白降解系统,影响蛋白质表达量的一个重要的宿主因素是宿主本身的蛋白酶的作用，应对的策略之一是寻找相应蛋白酶缺陷的突变株。如E.coli BL21（DE3）是基因表达实验中最常与pET系列质粒配合使用的宿主菌，B株系天然缺失lon蛋白酶（K12有）。研究人员又向其
7、引入了蛋白酶OmpT的缺失突变，有利于提高蛋白产量。另一种策略是将目的蛋白与其它已知蛋白（如GST，谷胱甘肽硫转移酶）通过基因融合的方法进行融合表达，也能适度避免目的蛋白质的降解。,融合蛋白表达,蛋白质的在结构与功能上都具有模块化的特点，其结构域往往在结构和功能上都有相当的独立性。这就使通过DNA重组技术产生融合蛋白质成为可能。这种技术在实验室中也常被用于目的蛋白的亲和层析纯化（例如：与GST、His标签、GFP等蛋白融合）。,ampr,ori,GST,目的蛋白,SD,pT7,T7终止子,plac,T7 RNA聚合酶,IPTG,宿主E.coli BL21(DE3)染色体,表达载体,T7 RNA
8、聚合酶,以融合蛋白形式进行表达的额外的好处是可以对目标蛋白进行亲和层析纯化，能大大简化蛋白的纯化过程。,融合蛋白的亲和层析法纯化,结合,洗脱,蛋白酶,蛋白质工程,随着科学家对蛋白质的结构与功能之间关系的认识更加深刻，到1980年前后科学家们已经可以根据不同的目的来设计和创造突变蛋白质分子。这种能够改变蛋白质的功能，或者设计和创造具有某种功能的新蛋白的技术被称为蛋白质工程。蛋白质工程的终极目标：根据氨基酸序列正确预测蛋白质的结构与功能;使用天然或非天然氨基酸甚至化学合成的分子自由地创造具有期望结构和功能蛋白质。,蛋白质工程,从实际应用来看，酶、抗体、受体、运输蛋白、信号转导蛋白、转录因子等均可以
9、成为蛋白质工程的改造对象。在目前，从头设计具有全新的结构和生物功能的蛋白质分子相当困难，更多的工作是对现有蛋白质的改造。蛋白质改造的技术主要有：随机突变法定点突变法DNA shuffling非天然氨基酸导入基因融合,蛋白质改造技术,随机突变法是创造在基因水平上的多样性的重要技术，包括：采用羟胺等化学试剂处理或UV照射细胞进行人工诱变，然后选择表现型；利用DNA修复酶缺陷株；利用DNA聚合酶反应的底物特异性下降现象；全基因水平的人工合成将突变导入目的基因。易错PCR（Error-prone PCR）：PCR中使用的Taq DNA聚合酶本来就是一种错误率较高的聚合酶，如果在体系中存在Mn2+或Mg
10、2+浓度异常，以及A、G、C、T中有一种的浓度仅为通常的1/10，反应就更容易出错。,蛋白质改造技术,定点突变法：针对编码某个蛋白质的基因，在特定位点引入突变的方法。操作过程如下：人工合成带有需引入的突变序列的寡核苷酸（突变引物，如：ValArg）制备目标基因的单链DNA模板使突变引物与DNA模板退火使用DNA聚合酶、连接酶一起合成全长基因，引入突变转化至E.coli中，通过DNA测序确认突变是否成功。,定点突变法 site-directed mutagenesis,制作ssDNA,质粒,人工合成突变引物,DNA聚合酶合成互补链,转化E.coli，挑选克隆提取质粒DNA，测序,PCR定点突变法
11、,第一轮PCR,混合两个PCR产物，变性，退火,聚合酶合成,连接到克隆载体中，转化E.coli，挑选克隆，提取质粒，测序,第一轮PCR,PCR进一步扩增,蛋白质改造技术,DNA shuffling：由Stemmer等人所建立，作为一种基因重排的方法，主要步骤：针对某个蛋白质构建数个经过功能改良的突变基因用DNase I将这些DNA随机切断，获得长度在2050bp的片段将这些片段混合，进行无引物PCR加入DNA连接酶，使DNA小片段重新连接，可能获得有价值的新组合通过合适的表型筛选系统进行选择这种方法甚至能够改变酶分子的底物特异性，还可以实现酶的稳定性及催化活性的改良。,DNase I 随机切割
12、,混合这些片段，热变性，退火（shuffle）,嵌合体文库,DNA聚合酶，连接酶,表型筛选,一组相关的基因,Reshuffle,DNA shuffling,蛋白质改造技术,非天然氨基酸导入：将20种氨基酸之外的氨基酸（如硝基苯丙氨酸）导入蛋白质分子中，可以赋予蛋白质全新的功能。首先必须使一些遗传密码子对应于非天然氨基酸，通常需要对常规的三联体密码子进行扩展，产生四联体密码子，如CGGG。先将该序列导入目标基因中想要导入该氨基酸的位置，同时用化学酰胺化的方法得到该氨基酸的氨酰tRNA，使携带识别CGGG的反密码子的tRNA与非天然氨基酸结合。,UCG,AGC AGC ACC,Ser,mRNA,t
13、RNA,在体外无细胞翻译体系中进行蛋白质合成,蛋白质改造技术,将上述氨酰tRNA与目标基因的mRNA分子共同添加到无细胞翻译体系中，就可以获得想要的蛋白质。使用多种四联体密码子，可将2种以上的非天然氨基酸分别导入蛋白质分子中特定的位点。这种技术存在的问题主要有：因为使用无细胞翻译系统，所以蛋白产量低氨酰基tRNA的制备过程复杂导入非天然氨基酸后的蛋白质发生变性、失活等,洗涤剂用酶,洗涤剂用酶是洗涤剂中不可或缺的成分，常添加的酶包括蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等。其市场需求量在不断增加。在各种酶制剂联合使用以提高洗涤效果的同时，科研人员也致力于通过蛋白质工程手段改善每种酶的功能。蛋白酶：蛋白酶是洗涤剂
14、中最重要、使用量最大的酶制剂。,洗涤剂用酶,在长期保存的过程中，洗涤剂中的漂白成分会引起酶的失活，可能是由于位于活性中心附近的Met被氧化所引起。如果把该Met替换为其他氨基酸，可以提高酶分子的抗氧化性能。例如：来源于芽孢杆菌的一种碱性蛋白酶，将其Met222替换为Ala后，经100mM H2O2处理15min后残余活力由野生型的30%提高到70%。（诺维信Novozymes的产品Esperase。）,洗涤剂用酶,低温蛋白酶的开发：对B.clausii 来源的蛋白酶savinase的基因进行定点或随机突变，构建在芽孢杆菌中的基因表达文库。筛选：将菌体溶液移入96孔板，进行低温条件下的酶促反应。
15、获得的突变型酶在15时的洗涤效果有显著提高（Kannase，Novozymes，1997）。淀粉酶：大量用于餐具的自动化清洗。来源于B.licheniformis 的-淀粉酶性能优良，但是不抗氧化剂。突变Met197Ala使其抗氧化性能显著增强，在加漂白剂的洗涤剂中五星期后仍保持90%以上的活力。（Purastar，Genencor Inc）,Novozyme诺维信公司,诺维信是一家丹麦的生物技术公司，主要进行酶制剂、微生物制剂和生物医药成分的研发与生产。2013年占据全球酶制剂市场的48%，是最大的工业用酶制剂的生产商。目前有700多种产品，遍及全球130个国家。诺维信1992年开始进入中国
16、，目前投资总额超过5亿美元。机构包括4 家工厂，2 家分公司，1 家创新与发展中心，员工总数超过1000名。,工业生产用酶,核酸类化合物5-IMP和5-GMP是制作鲜味调味品的原料，工业规模化生产这些核苷酸的方法之一就是用酶法对发酵产生的核苷进行磷酸化。许多微生物可以利用无机磷酸对核苷进行磷酸化，化学反应如下：具有调味作用的只有5-核苷酸，所以先筛选能以焦磷酸为磷酸供体，特异性地对核苷的5OH进行磷酸化的菌株，成功找到了数个属于肠细菌科的菌株。,核苷+PPi 5-核苷酸+Pi,工业生产用酶,然后选择5-核苷酸产量最高的菌株Morganella morgnii，克隆了其核苷磷酸化酶基因，并进行了
17、酶学研究，发现其有两种活性：核苷磷酸化酶活性：磷酸酶活性：要想使其适于核苷酸的工业生产，必须提高其磷酸化酶活性，同时抑制其磷酸酶活性。改造步骤：PCR法引入随机突变，从表达突变酶的重组菌中筛选5-核苷酸合成能力高的菌株,次黄苷+PPi 5-IMP+Pi,5-IMP+H2O 次黄苷+Pi,工业生产用酶,在两轮随机突变后科研人员获得了生产性能有大幅提高的菌株，其中的酶发生了Gly92Asp和Ile171Thr的突变；突变型酶与野生型相比，与次黄嘌呤核苷的亲和性明显加强，5-IMP的生产性能大幅提高，而且IMP的水解也受到抑制。生成的核苷酸只有5-核苷酸，没有2-、3-核苷酸副产物。此外，该酶的底物
18、特异性广泛，适用于各种5-核苷酸的生产。,工业生产用酶,进一步，研究人员对Escherichia blattae 来源的这种酶进行了结晶和结构解析。根据结构信息，对一些位点进行了定点突变，如Ser90Phe的突变，使酶对次黄苷的Km下降60%，大幅提高了酶的反应能力。经过一系列的研究之后，最终确立了新型的酶法核酸鲜味调味品的工业生产技术，并于2003年开始投入生产（味之素株式会社）。,1D2T,味之素,日本味之素公司是拥有百年历史的全球十大食品企业之一，是世界上最大的氨基酸供应商之一。产品涉及食品、药品等多个领域。味之素不但生产赖氨酸，而且苏氨酸、色氨酸的生产量在世界上都是最大的。在氨基酸领域
19、处于领导者地位的味之素集团，运用最先进的独创技术，广泛地开发了氨基酸的用途。味之素已在中国建立18家公司，业务涉及调味品、加工食品、医药/工业用/饲料氨基酸等。当前味之素在中国的核心业务围绕调味品及加工食品展开。,临床诊断用酶,在现代医学中，医生要作出准确的诊断，往往需要检测病人的各种代谢物在体液中的水平（血液、尿液）。酶是一种十分理想的诊断试剂，利用酶试剂构建的检测系统能充分发挥酶促反应特异性强、反应时间短的优势，简便、快速、准确。现在的诊断试剂从便捷角度出发多以液体试剂盒为主，这对酶的性能要求甚为严格。酶的高纯度精制是必须的，并且在液体试剂中长期保存的稳定性也十分重要。,临床诊断用酶,胆固醇氧化酶ChoA：链霉菌Streptomyces来源的ChoA的底物亲和性优异（Km=13M），非常适合于胆固醇的检测。但是该酶的稳定性不高，且在弱碱环境下活性较低。科学家通过对其立体结构的模拟，有目的地构建了其突变体文库，并筛选热稳定性提高的突变体。最终选定了一种双突变体：V145E，S103T，其热稳定性和在弱碱性环境中的活性都有明显改善。其工业生产已经获得成功，被广泛用于各种胆固醇诊断试剂。,
