国家自然科学基金申请书.docx

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1、填报说明一、填写申请书前，请先查阅国家自然科学基金有关项目申请 办法及规定。申请书各项内容，要实事求是，逐条认真填写。表达 要明确、严谨，字迹要清晰易辨。外来语要同时用原文和中文表达。 第一次出现的缩写词，须注出全称。二、申请书为十六开本，复印时用B5复印纸，于左侧装订成册。 第三页起各栏空格不够时，请自行加页。一式六份（至少一份为原 件），由所在单位审查签署意见后，按申报学科投送国家自然科学基 金委员会对口科学部。地区科学基金项目，申请书另报送省（自治 区）科委一份原件。三、封面右上角“科学部编号”由对口科学部填写，项目类别 和申报学科代码1由申请者填写。四、下列人员不得作为申请项目的负责人

2、提出申请，但可作为 项目组成员参加研究：在读（含在职）研究生已离退休的科研人员申请单位的兼职科研人员五、申请者和项目组中具有高级专业技术职务的主要成员申请 （含参加）的项目数，连同在研的国家自然科学基金项目数（不含 重点项目、重大项目），不得超过两项。六、同一项目组研究内容相近的项目，只允许报送一个学科。七、申请者可因同类项目竞争等原因，提出不宜评议本项目的 专家名单（姓名与单位，3人以内），密封于信封中，钉在申请书原 件封面，或另专函相关学科，供科学部选择同行评议人时参考。科 学部将对此信息保密。八、国家自然科学基金委员会地址：北京市海淀区双清路83号, 通讯地址：北京8610信箱。邮政编码

3、：IOOO85一、简表研名称中文A型禽流感惊致病和免疫发病机理的研究英文Studies of pathogenesis and immunity mechanism of avian inuenza virus type A项目类别A.自由申请B.高技术探索 C青年 D.地区E.重大F.重点H.专项F高技术探索项目主题号申报学科名称1畜禽病理学名称2A.亮础研究代码1C02030606代码2B.应用基础B申请金额1 60.005元K3止年月2003年1月至2006年12月所用实验室A.国家重点B.部门开放1. Ia实验室编号申请姓名中SC 郑世民 t主A.男出生年月1959年9月民族名称汉拼书

4、r Zheng shimin 夕心女A身份证号2307代码OI专业技术名称教授& A.博士Fa博士学位授予国别国（地区）名中国A.院士代码011 t B.硕士代码156B.博士生导师所名称东北农业大学系（所）动物医学院单位代码性质X.高等院校邮政编码150030隶属关系名称黑龙江省3.不醐机构A申请者电话(0451)5390405代码923所在地省（自治区、直辖市）市（县）区街（路）号项目组总人数高级中级初级博士博士生硕士生参加单位数10732主要 成员(不含申请者)姓名身份证号专业技术明冬所在单位名称及代码项的目中分T签字孔宪刚2395研究员、博与哈尔滨兽医研究所副主持王君伟2307教授、博

5、导东北农业大学（15003001）部分实验刘忠贵2341教授、博导东北农业大学（15003001）技术顾问刘胜旺6207副研究员哈尔滨兽医研究所部分实脸贾永清副教授东北农业大学（15003001）部分实验高雪丽讲师东北农业大学（15003001）部分实验葛铭237O41x讲师东北农业大学（15003001）部分实验姜永厚2301讲师东北农业大学（15003001）部分实验杨丽萍2314高级实脸师东北农业大学（15003001）部分实验-I-研 究 内 容 和 意 义摘要应用免疫学和病理学新理论与新技述通过对A1.V感染雏鸡血液、免疫器官局部粘膜免疫组织的细胞免疫体液免疫检测及组织病理学、超微病

6、理学细胞因子的检查全面系统地研究A1.V感染导致鸡群严重死亡的机理及感染鸡体全身免疫、粘膜免疫和细胞国子免疫调节的变化9为禽流感的防制提供科学依据9填补该领域研究的国内外空白O主题词1.主题词数量不刍方于三个；2.主题词之间空-格（英文用/分隔）。中文A型禽流感病毒致病机理免疫机理英文Avian inf1.uenza virus type AZpathogenesis mechamism/immunity mechamism简表填写要求一、简表内容将输入计算机，必须逐项认真填写，采用国家公布的标准简化汉字。简表中所有代码以最 新发布的国家自然科学基金申请项目分类目录及代码为准填写。高技术探索课

7、题主题号按高 技术新概念新构思探索课题项目指南中主题号填写，申请其重点项目时项目类别也填写B,并在 申请书封面右上角加注“高技术探索课题重点项目”。二、凡选择性栏目，将相应提示符A、B等之一填入该栏的右下角。三、部分栏目填写要求：项目名称应确切反映研究内容和范围，最多不超过25个汉字（包括标点符号基础研究指以认识自然现象、探索自然规律为目的，不直接考虑应用目标的研究活动。应用基础研究指有广泛应用前景，但以获取新原理、新技术、新方法为主要目的的研究。申报学科申请项目所属的最基础学科。如涉及多学科可填写两个，先填为主学科。申请金额以万元为单位，用阿拉伯数字表示，注意小数点。起止年月起始时间从中清的

8、次年1月算起。终止时间为完成年度的12月。所用实验室系指研究项目将利用的实验室，仅填写国家计委批准的国家重点实验室或部门批准 的开放实验室。所在单位名称及代码按单位公章填写全称。例如“中国科学院西安光学精密机械研究所”不得填“中科院西安光机所”或“西安光机所二全称中的数字，一律写中文, 例如：中国航天工业总公司第七O一所。首次申请国家自然科学基金的单位，尚未编入单位代码，其代码暂不填写。参加单位数一指研究项目组主要成员所在单位数，包括主持单位和合作单位（合作者所在单位），以 阿拉伯数字表示。项目组主要成员一指在项目组内对学术思想、技术路线的制订与理论分析及对项目的完成起重要作 用的人员，本人应

9、在申请书上亲自签名。本栏双线右侧内容不输入计算机。研窕内容和意义摘要与主题词均录入软盘。-2-二、立论依据（包括项目的研究意义、国内外研究现状分析，并附主要参考文献及出处）对基础研究，着重结合国际科学发展趋势，论述项目的科学意义； 对应用基础研究，着重结合学科前沿、围绕国民经济和社会发展中的重要科技问题，论述 其应用情景。流感病毒(inf1.uenza virus)在病毒分类上被列为正粘病毒属(orthomyxovirus),属 RNA病毒，可根据核蛋白的抗原特异性划分为A、B、C三型，而在动物中能引起发病者, 仅限于A型流感病毒。禽流感(AVian1.nfIUenza , AI)是由 A 型

10、禽流感病毒(AVian1.nfIUenZaVirUSTyPeA) 引起的多种禽类和野生鸟类的一种急性、高度致死性传染病。1878年PerronCi1.O首次报道 了意大利鸡群爆发该病，被称为“鸡瘟”(FoW1.PeSt或FOW1.PIagUe),也叫真性鸡瘟。该 病被国际兽医局动物流行病组织(O1.E)确定为I类烈性传染病。19世纪末至20世纪初， 本病主要发生于欧洲许多国家和地区，故又叫做欧洲鸡瘟。目前，世界许多养禽国家均有 该病发生或流行的报道。我国自1994年由陈伯伦等首次从广东省发病的鸡群中分离到Hg 亚型的A型禽流感病毒以来，四川、宁夏、新疆等地区也分离到该病病毒。从该病发生 的世界

11、历史上看，本病属于一种毁灭性的疾病，每次严重爆发都给养禽业带来重大的经济 损失，例如1983-1984年，美国为了扑灭宾州发生的禽流感，曾花费了 6000万美元；1997 年底，香港政府为扑灭该病，将境内140多万只鸡全部扑灭；巴基斯坦1998年7月以来 的半年内，仅禽流感一项损失了 90亿巴基斯坦卢比。目前，低致病力和中等毒力的AI 已在我国十几个省或地区发生和流行，且有逐渐扩大的趋势，并潜伏着高致病力A1.爆发 和流行的可能威胁，禽流感警钟已鸣，亟待防范。一、禽流感病毒及其生物学特性国内外研究进展禽流感病毒(AVian1.nfIUenZaVirUS , AIV)属正粘病毒科(Othomy-

12、Xoviridase)流感病 毒属的A型流感病毒，其基因组为单股负链分节段RNA,核衣壳呈螺旋对称，外包囊膜, 其上有纤突。该病毒根据其表面抗原即血凝素(Hemaggh1.timn , HA)和神经氨酸酶 (Neuraminidare , NA)的抗原特性分为不同的亚型，迄今为止，已发现HA至少有15种， 分别以H 5命名，NA至少有9种，分别以N.9命名。其中高致病性禽流感(High1.y Pathogenio Avian Inf1.uenza ,HPAI)都是由 H5 和 A7 亚型引起。1食湍感病毒的分子生物学特性变；基因组的缺乏、插入或重排导致抗原改变，造成较大范围抗原性的改变，产生新

13、型毒 株或其毒株毒力明显改变。2.禽流感病毒基因组结构及其功能A型禽流感病毒有8个基因组片段，分别以片段1、片段2片段8分别编码基质蛋白 M1.、M2和非结构蛋白NS1.、NS2o该病毒基因组的特点是，其8个基因片段的3,和5, 末端具有高度保守性，即核甘酸序列相同。同时，在5,末端的13个核昔酸序列和3,末端 的12个核甘酸序列中有些可反向互补。遗传学和生物化学实验证实，3,和5,末端保守的 核甘酸序列是病毒转录的重要识别部位，其该区域的反向互补序列，与病毒的复制有关。 8个基因片段中，片段1一3分别编码病毒多聚酶PB1. PB2和PA；片段4和6分别编码 血凝素（HA）和神经氨酸防（NA）

14、,而且这两个片段的变异比较高，不同的血清亚型其 序列差异比较大，既使同一亚型其序列也不尽相同；片段5编码核蛋白（NP）,为病毒的 核衣壳蛋白，片段7编码基质蛋白M1.和M2；片段8编码NS1.和NS2两个非结构蛋白。 3.病毒基因编码蛋白的结构与功能蛋白质是流感病毒粒子的主要组成成分（70%75%）,具有重要的功能，如病毒基因 复制所需酶，感染细胞时与受体结合的纤突以及维持病毒形态的基质膜都是由蛋白质组成 的。随着生物技术的不断发展，对蛋白质结构和功能的研究不断深入，目前对流感病毒 HA和NA的三维结构研究最多，了解的也最清楚，其受体结合位点及抗原决定簇的结构 与位置也已掌握。这些成绩，要归功

15、于定点突变技术、X线晶体衍射技术和反向基因遗传 技术的广泛应用。现在对大多数禽流感病毒蛋白质的功能已经掌握。我们确信，随着研究 的不断深入与技术手段的不断改进和提高，流感病毒蛋白质的其它功能将会不断确定。 4.A型流感病毒的分子生物学动物的种类不同，其感染A型流感病毒后临床表现各异，即使来自于不同A型流感病 毒分离株的同一亚型，对同一动物的致病性也存在很大差异。一般来说，哺乳类动物感染 A型流感病毒后，病毒主要在呼吸道上皮细胞增殖，故临床表现主要以局部呼吸道症状为 主；而禽类感染A型流感病毒后，其临床症状与病毒毒力密切相关，如非致病力毒株或低 致病力毒株，病毒只在局部粘膜（如消化道、呼吸道）上

16、皮细胞内增殖，故不表现或只表 现轻微的临床症状；如果感染高致病力毒株，病毒常常侵入全身各器官组织，引起严重的 临床症状，甚至造成大批死亡。A型流感病毒感染动物有机体后，首先依赖HA吸附于宿主细胞膜表面的受体上，然 后经过蛋白酶的作用，将HA切割为HA1.和HA2,从而完成病毒的脱壳过程。HA对蛋 基酸碱基的插入；位于HA1.酶切位点上游的脯氨酸(P)其活性非常重要，如被置换，HA 的可裂解性下降，病毒活力减弱，HA1.末端的精氨酸是蛋白内切酹识别特异氨基酸部位， 如该氨基酸发生置换，HA则不能裂解。HOrimO1.。等对A1.V血凝素裂解活性与病毒毒力的 相关性研究发现，裂解位点碱性氨基酸的缺

17、失或被非碱性氨基酸置换，可降低病毒毒力和 在MDCK细胞上的蚀斑形成能力。同时还证明具有HA裂解活性的蛋白内切酶能增强AIV 感染细胞的能力，提高细胞和动物有机体对AIV的易感性。另外，一些外源性(如胰蛋 白酶、纤维蛋白酶等)的识别精氨酸残基的蛋白内切酶也将HA裂解为HA1.和HA2,从 而使低致病力AIV的感染性增强,金黄色葡萄球菌也能分泌一种可裂解流感病毒HA的蛋 白酶。小鼠实验证实，当流感病毒与金黄色葡萄球菌混合感染时可导致肺脏大面积病变， 提示禽类即使感染低致病力AIV时，如并发其它细菌混合感染，有可能使A1.V的致病性 增强。总之，HA基因及其产物是流感病毒致病力的主要决定因素，而N

18、A、M、PA、PB1、 PB2、NP以及NS等对维持病毒毒力起一定作用。5. A型流感病毒对宿主的特异性自然条件下流感病毒对感染宿主有一定的特异性，依此可将病毒分为不同的群，如人 流感病毒、禽流感病毒、猪流感病毒等。但流感病毒的种属特异性并不十分严格，已发现 流感病毒在不同种属动物间可传播，如禽流感病毒HIN1.亚型和人流感病毒H3N2亚型毒 株均可从猪体分离到；H1.N1.亚型流感病毒也可感染人。郭元吉对人甲型流感病毒在我国 动物中的分布进行了调查研究，结果从北京的鸡血清中检测到HIN1.抗体；从丹东的鸭中 检测到Hsw1.N1.和H1.N1.以及H2N2抗体；从上海的鸭中分离到H6N4亚型

19、AIV；从广西 的鸭中分离出H6N8、H2N3亚型病毒，从野鸟中分离到H1.ON9、H6N5等11个亚型病毒。 后来又从吉林患呼吸道疾病的马中分离到与AIV相似的H3N8亚型流感病毒；1997年香 港禽流感H5N1亚型从感染禽开始，随后波及到人，先后有18人感染发病并致6人死亡, 引起全世界恐慌。BankS等(1998)报道，从一患结膜炎的妇女体内分离到一株与A1.V同 源性很高的H7N7亚型流感病毒，郭元吉等(1999)从香港人体内首次分离到H9N2亚型 AIVo流感病毒对宿主的特异性受多种因素的影响，每个基因片段的产物都可能起一定的作 用。但HA是宿主特异性的主要决定因素。目前已知的15个

20、HA亚型都可以从禽类中分 离到，以前从人体分离到的主要是H1.、H2和H3,最近几年来才从人体内分离到H5、H7 和H9流感病毒。猪体内分离到的主要是H1.和H3,马流感病毒常见的是H3和H7亚型。 为什么会出现这种情况，其根本原因还不清楚。在美国和墨西哥AI大暴发后防止疫情扩散和蔓延中发挥了一定的作用。但高效、安全、 实用的禽流感疫苗的研制仍然是世界养禽业关注的焦点。下面就几种主要禽流感疫苗的优 缺点作一简介。1 .灭活全病毒疫苗灭活全病毒疫苗一般是用甲醛灭活禽流感病毒鸡胚增殖的尿囊液，再辅以佐剂而成。其 特点是安全性好，抗原组分齐全，免疫原性较强，不出现毒力返强和变异危险，能够经受 同亚型

21、A1.V的攻击。缺点是：抗原量由注射剂量决定，因此必须注射比活疫苗高出数倍的 毒量，另外还需要佐剂，增加了其成本；其次，灭活疫苗必须每个动物免疫接种，需要大 量人力，并且禽易产生应激反应，从而造成生产性能降低，同时由于防疫人员的流动和对 禽的直接接触，易造成疫病扩散；第三，灭活全病毒疫苗接种动物A1.血清学检测呈阳性， 不能与自然感染相区别，影响AI疫情监测和防制措施的制定。我国已研制出针对HPN2亚型的AIV灭活油乳剂疫苗并投入商品化生产，已在许多省 (市)推广使用。2 .亚单位疫苗亚单位疫苗是由提取AIV具有免疫原性的HA蛋白，辅以佐剂而成。特点是：安全性好， 能刺激机体产生足够的免疫力。

22、缺点是：免疫保护持续时间短，且成本高。3 .重组活载体疫苗重组活载体疫苗是利用对禽类致病性很弱的疫苗病毒或禽痘病毒作载体，构建表达HA 的重组病毒，因此重组病毒作为疫苗，它可在动物体内复制并不断表达出HA蛋白，从而 诱导禽类产生针对A1.V的免疫保护力。是一种很有发展前途的疫苗。4 .核酸疫苗核酸疫苗(NUC1.eiC acid vaccine),又称基因疫苗(Gene vaccine)或 DNA 疫苗(DNA vaccine),是利用病原的保护性抗原基因构建真核表达质粒，再将质粒DNA用肌肉注射或 基因枪直接导入机体细胞，使外源基因通过机体内源性表达系统表达并提呈给免疫系统， 从而诱发产生特

23、异性的免疫应答。核酸疫苗是近年来新兴的一种疫苗，目前正处于试验研 究阶段，因其免疫保护效率低及其他一些尚未克服的困难存在，其实际应用尚需时日。5 .存在的问题禽流感的预防主要仍赖于疫苗，综合国内外的研究，从目前来看，无论是灭活疫苗还是 活疫苗均存在以下几点问题；首先，AIV的15种HA亚型均可造成禽流感暴发。虽然历史上造成严重损失的都是H5由此可见，禽流感既可水平传播，也可经卵垂直传播。A1.V感染禽体后，可引起呼吸、 消化、生殖和神经等多种系统的结构、机能破坏，母鸡产蛋量明显下降、肉鸡生长发育迟 缓，该病潜伏期一般3-5天，常突然爆发，流行初期的急性病例，可不出现任何明显症 状，鸡只突然死亡

24、，严重时死亡率可高达100%。综合目前国内外对该病的研究，主要集中在流行病学调查、病原的分离鉴定、特异性诊 断、病原的分子生物学以及疫苗的研制等，特别是在病原的分子生物学和疫苗的研制方面 做了大量的工作，并取得了一定的成绩。但对AIV的致病机理和免疫发病机理，迄今未 见研究报道，例如，对AI的临床症状和病理学变化只是处于一种简单的描述，尚缺乏深 入系统的研究，对其免疫病理学的研究认为，局部IgA可起作用，在感染病毒的恢复中， 体液与细胞免疫均起作用，但体液和细胞免疫在AIV感染中到底发挥什么作用、怎么发 挥作用均不清楚。另外，研究最活跃的是细胞毒性T淋巴细胞（CT1.）,认为CT1.在活病 毒

25、感染中发挥作用，对灭活的流感病毒CT1.无作用，究其机理，目前仍不明了。根据A1. 的发病特点（起病急、流行快、死亡率高等）及造成的严重损失，对AIV的致病机理和 免疫发病机理进行全面、深入细致的研究是十分必要的。因此，本项研究以SPF鸡为实验 动物，应用病理学和免疫学新理论及新技术，全面、系统、深入地研究A型禽流感的致病 机理，免疫发病机理以及细胞因子的相互作用、调节和变化，为禽流感的有效防制提供重 要的科学依据。主要参考文献:1.郭元吉等 甲型流感病毒在我国动物中分布的初步调查 微生物学报，1981, 21(3)：3793842.毕英佐等广东禽流感的血清学调查中国兽医杂志，1994, 20

26、 (7)： 893.陈伯伦等 禽流感研究I鸡A型禽流感病毒的分离和血清学初步鉴定 中国兽医杂志，1994, 20 (10)： 354.陈伯伦等禽流感研究II禽流感的发生和血清学调查中国兽医杂志，1994, 20(10)： 675.程安春等鸡A型流感病毒的分离及初步鉴定四川畜牧兽医，1995, 4： 5-66.甘孟侯 禽流感 北京农业大学出版社，1995, 1127.孙颖杰 禽流感研究进展 畜禽传染病，1998, 18 (1)： 19228.于康震等97香港禽流感 中国畜禽传染病，1998, 20 (3)： 1871919.唐秀英等 中国禽流感流行株的鉴定 中国畜禽传染病，1998, 20 (1

27、)： 1510.陈化兰等DNA免疫诱导鸡对禽流感病毒的免疫保护反应 中国农业科学，1998,31 (5)： 636811.陈伯伦等 关于禽流感几个问题的看法 中国畜禽传染病，1998, 20增刊：23023112.陈伯伦等 当前防制禽流感的建议 中国畜禽传染病，1998, 20增刊：23123313.陈化兰等禽流感病毒及其分子生物学研究进展畜禽重大疫病生物技术防制研究 (白新盛、卢景良主编中国农业科技出版社1998, 5) P： 31332014.崔尚金等流感病毒的分子遗传学畜禽重大疫病生物技术防制研究(白新盛、卢景 良主编 中国农业科技出版社1998, 5) P： 32132415.郭元吉等

28、中华实验和临床病毒杂志，1998, 12 (4)： 32232516.陈化兰等一株鹅源高致病力禽流感病毒分离株血凝素基因的分析中国农业科 学，1999, 32 (2)： 879217.田国斌等 鸭源禽流感病毒的分类和鉴定中国预防兽医学报，1999, 21 (1)： 1318.邓国华等禽流感病毒核蛋白基因在杆状病毒中的表达中国预防兽医学报，1999,21 (2)： 818319.贾永清等 禽流感病毒分离株AGooseGuangdong396(H5N 1 )NA基因序列分析 中国预防兽医学报，2000, 22 (1)： 2530三、研究方案1 .研究目标、研究内容和拟解决的关键问题（1） 研究目标

29、应用组织细胞培养、免疫细胞化学和免疫酶及电子显微镜技术等现代免疫学和病理 学新手段，研究不同亚型A型禽流感病毒感染鸡的致病机理和免疫发病机理，全面系 统地探索AIV导致鸡大批死亡的致病机理以及感染AIV鸡全身和局部的细胞免疫和体 液免疫以及细胞因子的免疫调节变化及其相互关系，从细胞、亚细胞、分子水平揭示 AIV的致病机理和AI的免疫发病机理，为AI的防制提供重要的科学依据，填补该项 研究的国内外空白。（2） 研究内容病毒的体内分布：研究不同A1.V亚型在感染鸡体内的分布及其含量，揭示AIV的靶 组织或靶细胞。组织病理学：研究不同A1.V亚型对感染鸡全身组织器官（包括心、肝、脾、肺、肾、 脑、肠

30、、淋巴组织等）的损伤变化，为阐述AIV致病机理提供组织病理学基础。超微病理学：应用电镜技术研究A1.V感染鸡主要组织器官（包括心、肝、脾、肺、 肾、脑及免疫器官等）的超微结构变化，从亚细胞水平揭示AIV的致病机理。细胞因子的免疫调节：应用组织细胞培养技术，研究免疫器官组织中白介素一2 （I1. 2）、肿瘤坏死因子（TNF）、干扰素（IFN）等细胞因子活性的变化，揭示细胞因子在 A1.V感染中的免疫调节作用。外周血液免疫学变化：包括细胞免疫和体液免疫的检测，揭示A1.V感染时，鸡外周血 液免疫学变化的规律以及与细胞因子调节的相互关系。免疫器官免疫学变化：包括免疫器官的细胞免疫和体液免疫指标的检测

31、，揭示AIV感 染时，鸡免疫器官的免疫学变化规律及其与外周血液免疫学变化的关系。粘膜免疫：包括消化道、呼吸道局部粘膜的细胞和体液免疫指标的检测，揭示AIV感 染时，鸡粘膜免疫的变化规律及其与全身免疫的关系。（3） 拟解决的关键问题本研究的关键在于全面深入地揭示A型禽流感病毒不同亚型的致病特点以及机体免疫2 .拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析本项研究拟选用中国农业科学院哈尔滨兽医研究所SPF实验动物中心的SPF雏鸡为 实验动物。实验共分7日龄和21日龄两个大组，每个大组又分为感染禽流感Hs （鹅体分 离株）亚型病毒组（简称11组）、感染禽流感H?亚型病毒组（简称12组）和未感染

32、病毒的对照组（简称C组）。其中，11和12组雏鸡分别于7和21日龄时，经静脉接 种Hs或H?亚型流感病毒尿囊液（1： 10稀释）0.2m1.只；C组雏鸡未感染病毒为空白对 照组。每组雏鸡分别饲养于负压隔离器内，按SPF雏鸡要求严格隔离饲养。并分别与感 染后7、14、21、28、35、42、49和63天，每组随机抽取相同数量鸡只迫杀或发病死亡 前剖杀取材，做相应处理，检测以下指标：1）病毒的体内分布检测：取心、肝、脾、肺、肾、胸腺、法氏囊等组织器官，采用冰冻切片和酶标（或荧光）抗体 法检测病毒在体内的分布及其含量。2）组织病理学检查：取心、肝、脾、肺、肾、肠及淋巴器官等石蜡包埋，常规H-E染色，

33、检查各组织器官的 病理学变化。3）超微病理学检查：用透射电镜技术对主要组织器官（心、肝、脾、肺、肾、脑、胸腺、法氏囊等）的超微结 构变化以及病毒在感染细胞中的分布等进行全面检测。4）细胞因子的检测 胸腺、脾脏的I1.2活性测定一一细胞培养及MTT法肿瘤坏死因子（TNF）测定一一微量细胞病变法干扰素（IFN）测定微量细胞病变法5）外周血液免疫学变化检测：细胞免疫指标测定T、B细胞数量免疫SPA菌体花环法T、B细胞功能一一淋巴细胞转化试验体液免疫指标测定血清IgG、IgM、IgA含量间接E1.1.SA法6）免疫器官免疫学变化检测：细胞免疫指标测定CD4+和CD8+T细胞数量冰冻切片及免疫酶标间接法

34、T细胞（胸腺、脾脏）增殖功能MTT法体液免疫指标测定B细胞（法氏囊、脾脏）增殖功能一一MTT法IgA、IgG、IgM抗体生成细胞数量彩色免疫金银（CIGSS）法或酶标抗体间接法7）粘膜免疫的检测消化道（盲肠扁桃体、丕氏斑）、呼吸道（哈德尔腺）局部粘膜免疫组织的免疫指标测定：CD4+和CD/T细胞数量一一组织切片及免疫酶标间接法IgA、IgG、IgM抗体生成细胞数量C1.GSS法或酶标抗体间接法局部体液（泪液、气管液、肠液、胆汁）的体液免疫测定IgA、IgG、IgM含量间接E1.1.SA法本试验采用现代免疫学和免疫病理学的新技术、新理论，其研究方法均为申请者 十几年来在实验中不断完善和使用，其条

35、件及技术环节上都是可行的。就项目本身而 言，是自1986年以来，本研究室连续承担完成鸡传染性法氏囊病免疫抑制机理、 鸡传染性贫血病发病机理的研究等四项国家自然基金项目，并取得了有意义的创 新性研究成果的基础上，结合当前国内外对“禽流感”研究中亟待解决和需要阐明的 实际问题及其发展动向提出的，试验条件较为优越，按研究方案实施，定能取得有重 要实际意义的研究成果,3 .本项目的创新之处（1）选题上：本项研究是综合当前国内外禽病的研究动态和生产中急待解决的实际 问题提出的。禽流感是严重危害现代化养禽业大发展的世界性I类烈性传染病，阐明 AIV的致病机理和A1.免疫发病机理，是国内外广大兽医工作者多年

36、的共同心愿，特 别是禽病免疫病理的研究一直是动物医学界所关注的热门话题。综合目前已有的资料, 对AIV的致病机理及其免疫发病机理目前均缺乏全面系统的研究。因此，本项目拟对 AIV的致病机理及其全身和粘膜免疫系统在AI的发生中的作用进行全面深入细致的 研究，不仅可填补该项研究的国内外空白，更为重要的是为该病的免疫防治提供可靠 的科学依据。（2）研究内容和技术路线上，应用免疫学的新理论和新技术，结合病理学的特点和 电镜技术，从细胞、亚细胞及分子水平综合研究A1.V的致病机制以及通过细胞因子、 外周血液和全身免疫器官及局部粘膜的细胞免疫和体液免疫变化的测定，揭示机体免 疫机能，特别是细胞因子在禽流感

37、免疫发病中的作用及免疫调节中的作用，在国内外 该项目的研究中尚未见报道，独具特色，具有综合研究优势。（3）本项目申请者自1986年以来，作为主要参加者，在完成刘忠贵教授连续主持的 鸡传染性法氏囊病免疫抑制机理、鸡传染性贫血病发病机制的研究等四个国家 自然基金项目的基础上，综合目前禽流感研究的动态及生产实际需要提出的，是继禽 类免疫抑制病研究之后，又一新的研究领域，具有对禽类疾病免疫研究的连贯性和系 列化特点。4 .年度研究计划及预测进展2003.12003.12实脸准备及进一步完善检脸手段：7日龄动物感染发病实验及被检材料采取；外周血液T、B细胞功能的检测；细胞因子I1.2、TNF、IFN的检

38、测；病毒在体内的分布检测。2004.12004.1221日龄动物感染发病实验及被检材料采取：外周血液T、B细胞功能的检测；细胞因子I1.2、TNF、IFN的检测：病毒在体内的分布检测。外周血液T、B细胞数量的检测；2005.12005.12局部免疫组织的细胞免疫和体液免疫指标检测；局部体液（肠液、胆汁、泪液、气管液）的体液免疫指标检测；5 .预期研究成果本研究应用免疫学和病理学新理论、新技术，通过对不同亚型AIV感染雏鸡的病毒在 体内的分布、组织病理学、主要组织器官超微结构以及细胞因子、外周血液和全身免疫 器官组织的免疫学变化的全面系统研究：（1）从细胞、亚细胞水平，全面系统地揭示A1.V 的

39、致病性及其机理；（2）阐明细胞因子在A1.发病中的免疫调节作用及其规律；（3）揭示 消化道和呼吸道局部粘膜免疫在AI发生中的作用及其变化规律；（4）揭示感染AIV雏鸡 全身细胞免疫和体液免疫在抗AIV中的作用及其规律，为AIV的有效防制提供重要的科 学依据。利用该项目培养56名研究生，在国内外相关专业性刊物上发表34篇高水 平的论文。四、研究基础1 .与本项目有关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩本课题组主持单位是多年来以禽病免疫病理为主攻研究方向的兽医病理学博士点， 从七十年代末以来一直从事禽病免疫应用基础研窕工作，曾先后连续承担了四个国家自 然基金资助项目和二个黑龙江省科委课题及三个黑龙

40、江教委项目，均取得了创新性研究 成果，其中部分研究项目通过专家鉴定达到国际先进水平，并分获黑龙江省教委和省政 府科技进步一、二、三等奖七项。本课题组积累有研究禽病免疫病理的丰富经验，收集 有较全的有关国内外文献资料，具有检测禽类细胞因子，IgG. IgM. IgA抗体生成细胞、 T、B淋巴细胞数量与功能、免疫球蛋白IgG、IgM、IgA含量等各种免疫指标的技术手 段。该项目的合作单位中国农科院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室是以 动物重要传染病病原分离、鉴定、诊断及疫苗研制为主攻方向的兽医博士后流动站。特 别是承担完成禽流感病毒分子遗传演化关系的研究和NDV、A型禽流感病毒和猪 繁殖

41、与呼吸系统综合征病毒致病基因及其编码蛋白结构与功能研究两个“973”项目， 为本项研究奠定了病原学的前期准备工作。另外，该国家重点实验室具有国内一流的仪 器和设备以及一支技术过硬的科技队伍。综上所述，具备完成申请项目的研究基础和技 术条件。项目申请人自1983年以来一直从事禽病免疫病理研究工作，先后在国内外学术刊 物上己公开发表有关禽病免疫病理方面的科研论文50余篇。其中部分论文分别在中国 病理生理学会和中国畜牧兽医学会病理学分会学术讨论会上交流，并获优秀论文奖。2 .已具备的实验条件，尚缺少的实验条件和拟解决的途径（包括利用国家重点实验室和 部门开放实验室的计划与落实情况）本课题组有设备比较

42、齐全的免疫病理研究室和实验条件,备有细胞培养、细胞免疫、 体液免疫、细胞因子等各种指标检测的仪器设备，如CO2培养箱、倒置显微镜、荷兰 全自动免疫酶标检测仪、美国BeCkam全自动紫外蛋白分析仪、瑞典多用电泳仪、超速 离心机、衡温超薄冰柜切片机、万能显微镜、计算机等大型仪器；本校中心实验室的各 种仪器设备如扫描电镜、透射电镜、色谱仪、氨基酸分析仪、PCR检测仪等。另外，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所的兽医生物技术国家重点开放实验室具有-8-3 .申请者和项目组主要成员的学历和研究工作简历，近期已发表与本项目有关的主要 论著目录*和获得学术奖励情况及在本项目中承担的任务；青年科学基金申请者还 应

43、注明学位论文名称及导师姓名与工作单位申请人郑世民，教授，博士，兽医病理学硕士研究生导师。现任中国病理生理学会 常务理事，全国动物病理生理专业委员会主任委员，中国畜牧兽医学会兽医病理学分 会副理事长等。自1983年至今一直从事禽病免疫病理研究工作，先后对鸡和火鸡法氏 囊病、马立克氏病、新城疫、鸡传染性贫血病的免疫发生机理和疫苗免疫应答与保护 机理等项目进行了系统研究。几年来在国内外专业性学术刊物上已公开发表论文50多 篇。参加完成的国家自然基金资助项目雏鸡法氏囊病、马立克氏病、鸡传染性贫血病 发生机理的研究，均取得创新性成果，通过专家鉴定均达到国际同类研究的先进水平， 并分获黑龙江省教委和省政府

44、科技进步一、二、三等奖七项。近期发表的部分论文有：1 .感染鸡贫血病毒雏鸡ND免疫后血清IgS和HI抗体的动态变化，畜牧兽医学报，1996, 3： 2422462 . CIAV感染ND免疫鸡VNDV攻击后免疫病理学变化，畜牧兽医学报，1999, 30 (3): 2732783 .感染C1.AV雏鸡局部免疫组织抗体生成细胞的动态变化，中国尊医杂志，1997, I: 154 .感染鸣传染性贫血病毒的维鸣新城疫疫苗免疫后局部体液免疫球蛋白含量变化，中国兽医杂志，1997, 12: 795 .感染鸡传染性贫血病雏鸡局部体液免疫俅酱白含量变化，中国兽医学报，1996, 3: 2692726 .感染CIA

45、V雏鸡免疫器官抗体生成细胞的动态变化，中国兽医学报，1998, 2: 1221257 . Changes of cytokines and immune function in chicken infected with chicken anemia virus. Japanese Journa1. of Pathophysio1.ogy, 1995,4(2):648 .感染鸡贫血因子病毒雏鸡免疫器官T细胞变化，东北农业大学学报，1995, 2: 1561599 .维漓感染CIAV后细胞因子与免疫功能变化，离牧兽医学报，1995, 26 (3): 23323810 .鸡贫血因子病的免疫病理学变化，中国农业科学，1997, 4: 748211 .感染鸡贫血病毒雏鸡接种新城疫疫苗后免疫功能和免疫调节的变化，畜牧兽医学报，2001, 1: 92-9612 .感染玛贫血病毒雏碍接种新城疫疫苗后免疫保护效应及其机理研究，中国农业科学，