猪链球菌2型抗体的检测酶联免疫吸附法地方标准编制说明.docx

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1、猪链球菌2型抗体的检测酶联免疫吸附法地方标准编制说明1、项目来源本标准来源于XX区市场监督管理局关于下达 20XX年第二批XX地方标准制修定项目计划的通知（X 市监函120XX） X号）文件，由XX动物疫病预防控制 中心承担。XX动物疫病预防控制中心”猪链球菌2型 抗体的检测酶联免疫吸附法”编写小组，按GB/T1.1 20XX标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结 构和起草规则的要求组织编写的。计划于20XX年完 成。2、目的意义猪链球菌病是通过接触病猪或病猪产品引发的一 种人兽共患传染病。病原猪链球菌血清型众多，其中 猪链球菌2型为最常见和毒力最强的血清型。人感染 猪链球菌主要是通过创口感

2、染，导致脑膜炎、中毒性 休克综合征等疾病，甚至引起死亡，带来严重的公共 卫生问题。近年来，与XX毗连的越南和泰国等东盟国 家均有报道人感染猪链球菌2型并死亡的病例。美国、 英国、葡萄牙、澳大利亚、荷兰等国也相继出现了人 感染猪链球菌的报道。在越南和我国香港地区，猪链 球菌已成为引起成人脑膜脑炎的第一和第三大病原。 统计数据表明，全球因猪链球菌感染已引致400人以 上死亡，其感染和发病有逐年增多的趋势。因此，预 防猪链球菌病不仅是全世界养猪业的迫切需求，也是 全球公共卫生急需解决的焦点问题。我国猪链球菌病 疫情也十分严峻，病原主要以猪链球菌2型（SS2）和 马链球菌兽疫亚种（SEZ）为主。19X

3、X年夏季江苏南 通地区及20XX年7月四川资阳地区，由猪链球菌2 型感染猪群出现暴发性死亡事例，并引起多名相关从 业人员死亡,一度引发极大的社会恐慌。而近几年来，XX人感染猪链球菌发病数呈逐年上升趋势，20XX 20XX年XX分别有34、65、95人感染猪链球菌2型并 发病。XX是养猪大省，年平均气温高、环境湿度大, 利于猪链球菌2型的扩散传播，且XX防城港、百色、 崇左3个地级市中的8个县（市）与越南交界，陆地 边境线长1020公里。边境地区山林密布，野生动物众 多。越南等东南亚国家由于防控水平低，猪链球菌病 等人兽共患病可能通过野生动物的跨境活动和动物及 动物产品的非法贸易传入XX乃至国内

4、。因此，在XX 开展家畜及野生动物猪链球菌检测项目的研究，尤其 是猪链球菌2型的研究及诊断方法的开发。不仅能掌 握野生动物携带猪链球菌的情况，更能有效遏制东南 亚疫情的传入，对猪链球菌病等人兽共患病的防控具 有十分重要的意义。动物机体在被动免疫或感染病原后会相应产生特 异性抗体，通过检测抗体，监视其变化情况可以评价 预防接种效果、协助临床诊断、观察疗效、判断预后， 有助于流行病学调查。及时、快速、准确的检测动物 的猪链球菌2型抗体，具有重要作用。然而，当前国 内外检测猪链球菌2型尚无统一的标准，各类检测方 法良莠不齐，不能对猪群感染链球菌或免疫猪链球菌 疫苗后产生的抗体进行有效监测。亟需建立一

5、种针对 猪链球菌2型抗体的特异性强、敏感性好、高效率、 低成本的检测方法，从而快速诊断机体感染状况，及 时制定相应的防控策略，对保护易感猪群、高危人群 具有非常重要的意义。3、国内外标准对比情况通过检索美国标准及英国标准未有查询到具体的 猪链球菌抗体检测相关标准。当前，国内外猪链球菌 2型抗体检测技术有琼脂扩散试验、间接血凝、免疫 胶体金检测方法。但是，上述方法在实际应用中尚存 在一定的不足或缺陷。如：琼脂扩散试验耗时太长、 敏感性较低；间接血凝试验受电解质、温度、酸碱度 影响较大,结果不稳定；免疫胶体金检测结果不稳定， 容易出现假阳性和假阴性，而且没有相关检测标准， 影响猪链球菌2型抗体的准

6、确检测。猪链球菌2型感染动物机体后会产生特异性抗体, 酶联免疫吸附试验(E1.ISA)通过将抗原吸附在固相载 体，在载体上进行免疫酶反应，通过底物显色，用分 光光度计判定结果。利用抗原抗体特异性和酶催化反 应的高灵敏性，有效的建立了猪链球菌2型抗体检测 方法，操作简便、准确性高、耗时少，适合快速检测 猪链球菌2型抗体，用于家畜及野生动物猪链球菌2 型感染流行病学调查以及疫苗免疫效果评估。但该方 法目前国内外没有相关的统一标准，本课题组制定标 准建立相应的检测规程，作为研究工作的重点，并承 诺本标准内容与各项指标不低于国家强制性标准、推 荐性国家标准和行业标准。4、编制过程(1)接到任务后，XX

7、动物疫病预防控制中心结 合近几年的科研情况和人员情况，成立了以韦显凯为 组长，郑敏、闭璟珊、周庆安、张灿星、李军等同志 为成员的标准编制课题组，负责标准的起草工作。(2)为了确保制定的标准具有科学性、先进性、 实用性和可操作性，标准编制课题组根据工作方案和 任务要求进行了分工，分成2个小组，其中一个小组 负责做生产实践的调查研究，深入到XX南宁、来宾、 柳州、河池、梧州、贺州、玉林、北海、百色、桂林、 崇左等地一些规模化猪场、散养户及屠宰场进行实地 调查研究，了解我区生猪养殖链球菌病防控有关情况, 并查阅相关的技术档案和规章制定，收集流行病学资 料；另一个小组负责查阅国内外猪链球菌检测方面的

8、标准、技术资料和研究报告，并进行实验比对。(3)起草完成标准征求意见稿最后课题组将两个小组收集的材料进行汇总和整 理，起草完成标准征求意见稿。(4)广泛征求意见，形成网上征求意见稿20XX年4月将标准征求意见稿(1稿)，分别送有 关生产、技术推广、科研、教学和标准化等方面专家 征求意见。发出征询专家意见表8份，收回8份，8 位专家提出了修改意见65条，采纳59条。根据专家 意见修改完善标准征求意见稿，形成网上征求意见稿。5、关键技术指标依据和来源XX动物疫病预防控制中心长期致力于XX地区动 物疫病防控研究，承担了大量的疫病防控研究工作， 从人员配备以及仪器设备等均符合项目开展的需要。 课题组长

9、期承担XX区动物疫病预防控制中心业务项 目猪链球菌病流行病学调查与防控，对XX地区生 猪链球菌病的流行情况有系统深入的调查，掌握了大 量第一手的流行病学实践数据。为夯实制定标准的科学依据，项目组对XX猪链球 菌病进行了系统流行病学调查及数据总结，重点了解 XX生猪猪链球菌病的感染率、感染强度、血清型以及 耐药性。201320XX年，XX动物疫病预防控制中心承 担了国家公益性项目“猪链球菌病防控技术研究与示范”的子课题，20XX20XX年，承担了原XX水产畜 牧兽医局科技推广项目“中越边境猪链球菌病防控研 究与示范”。与南京农业大学农业部动物疫病诊断与免 疫重点实验室以及OIE猪链球菌病诊断实验

10、室密切合 作，对中越边境的猪链球菌病进行监测和防控。发现 菌株GX1.O对昆明小鼠和BA1.B/c小鼠致死率均为100%, 菌株GXI1.对BA1.B/c小鼠致死率80%,菌株GX株、GXI1. 对 BA1.B/c 小鼠的 1.D50 分别为 4.5105 CFU、3.6 109 CFUo表明XXBA1.B/c小鼠对猪链球菌的敏感性高 于昆明小鼠，更适合作为猪链球菌致病性研究动物模 型，详见表1和表2。表1部分菌株对昆明小鼠和BA1.B/c小鼠致病性试脸Tab1.e 1 Pathogenicity test of different strains to Kunming mice and BA

11、1.B/c mice 攻毒数（只）死亡数（只）组别血清型OffensiveNumber of deathsGroupSerum typenumber昆明小鼠BA1.B/c小鼠GX75500GX91500GX1.O8555GX1.1.2504GX1229500其他型其他5500HA98012503生理盐水组500Kunming miceBA1.B/c mice表2对BA1.B/c小鼠有致病性的菌株不同浓度的毒力试脸Tab1.e 2 Test of di f1. erent concentration of pathogenic bacteria in BA1.B/c mice组别攻毒数（只）死亡

12、数（只）Number of deathsGroupOffensive numberGXIOGX1.IHA9801.原液553410- 542310-2520010- 35000生理盐水5000本研究建立的猪链球菌2型抗体E1.ISA方法可应 用于监测猪群的猪链球菌2型感染状况，同时用于评 估疫苗免疫后的效果。运用猪链球菌2型E1.ISA抗体 检测试剂盒连续5年对东兴市、那坡县、大新县的屠 宰场和免疫猪场进行猪链球菌2型抗体水平进行监测, 其中屠宰场每个示范每年监测300份血清，免疫猪场 每个示范每年监测100份以上血清。屠宰场猪链球菌 2型抗体平均阳性率为27. 00%,免疫猪场猪链球菌2 型

13、抗体平均阳性率为93. 37%,屠宰场和免疫场血清猪 链球菌2型抗体平均阳性率差异显著（P001）,详见 表3。表3. 20XX-20XX年屠宰场和免疫猪场猪链球菌2型抗体监测结果Tab1.e 3. Detection resu1.ts of Streptococcus suis type 2 antibody in s1.aughterhouses and immunizedpig farms, 20XX-20XX屠宰场 S1.aughter house免疫场 ImmUne fie1.d阳性阳性样品数Samp1.e numb er年份Year样品数Samp1.e numb er数Positi

14、v e numbe阳性率()Positive incidence (%)数Positiv e numbe r阳性率()Positive incidence (%)20X90024927.6738035292.63X20X90024627.3336534193.42X20X90022625.1135032693.14X20X90023826.4434031291.76X20X90025628.4436034595.83X合计4500121527.00a1795167693.37b注：标注不同字母代表P0.01,差异极显著。此外还通过向各地养殖场（户）发放调查表格，调 查生猪发病情况，同时到各县市

15、的动物疫病预防控制 中心调查当地生猪发病情况记载、疫情报告表和检疫 记载等，并采集样品检测猪链球菌2型和常见猪病的 混合感染状况。综合流行病学调查以及实验室检测， 发现在猪常见疾病中，链球菌2型病感染率仅次于 PCV2、PRRSV,平均感染率达10.88%,其中在发病场 和屠宰场的检出率分别为11. 84%和10. 11%。详见表4。表4 6种疫病检测结果Tab1.e 4 Resu1.t of 2 disease detection样品来样品SS2阳性CSFV 阳PRRSV 阳PEDVPCV2 阳PRV阳源数目率性率性率阳性率性率性率samp1.eSamp1.(%)positv(%)posit

16、v(%)positve(%)posi(%)positve(%)positvsourceee ratee rateratetve rateratee ratenumbe发病场morbidit15211.84(18)1.97(3)16.45(25)034.21(52)3.95(6)y farms屠宰场18810.11(19)0.53(1)11.17(21)043.09(81)0(0)s1.aughter houses合计 34010.88(37)1.18(4)13.53(46)039.12(133) 1.76(6)分析SS2和病毒混合感染情况,在发病场中，PCV2 和其他病原的混合感染最为多见。其

17、中，感染最高的 是 CSFV+PCV2,达到 F 95%,其次为 PRRSV+PCV2,阳 性率为3. 29%, PCV2+SS2的阳性率为1. 31%。屠宰场 二重感染较多的感染最高的是PRRSV+PCV2,达到 2. 66%,其次为PCV2+SS2,阳性率为1. 06%o详见表 5o表5二重感染情况检测项目发病场 morbidity farms屠宰场 s1.aughter houses合计tota1.Dtection样品数阳性数阳性率样品数阳性数阳性率阳性数阳性率itemSamp1.epositive(%)Samp1.epositive(%)positive(%)numbernumberp

18、ositvenumbernumberpositvenumberpositveTab1.e 5 Status of doub1.e infectionraterateratePCV2+SS221.3121.0641.17PRRSV+C10.6610.5320.59SFVPRRSV+P 15218853.2952.66102.94CV2CSFV+PC63.950061.76V2本研究选取了平果县的的凤梧乡百丰村兴隆土猪 养殖场、坡造镇绿德村布觉屯潘福春猪场以及四塘镇 红福养猪场作为免疫示范猪场进行免疫，跟踪研究免 疫抗体水平产生规律。使用猪链球菌2型E1.ISA抗体 检测试剂盒对3个猪场，不同时间

19、阶段的180份猪血 清进行猪链球菌2型抗体的检测。检测结果如表6o 实验结果表明，仔猪注射猪链球菌2型疫苗后能够产 生猪链球菌2型抗体,且免疫30 d后,抗体水平最高， 免疫60 d后抗体水平逐渐降低。如果仔猪不进行猪链 球菌疫苗免疫，仍然能够产生猪链球菌2型抗体，但 抗体水平较低。表6猪血清样品的猪链球菌2型抗体的E1.ISA检测结果Tab1.e 6 The resu1.ts of E1.ISA detection of streptococci 2 antibodies in pig serum samp1.es组别Group一免前 Before thefirst immunization

20、二免前 Before thesecondimmunization二免后30天30 daysafter the secondexemption二免后60天60days after the secondexemption抗体阳性抗体阳抗体阳抗体阳数抗体阳性性数抗体阳性抗体阳性性 数抗体阳性性率Antib 率（）Antibo 率()率()Antibod数（ ）Ody AntibodydyAntibodyAntibody yAntibody AntibodPOSiti positivepositiv positivepositive positivepositive yA 场Verate (%)num

21、b ererate (%)numberrate (%) numbernumber positiverate( %)Farm AB 场16.67533.31386.71280Farm BC 场0064012801173.3Farm C0000320746.7措施，建立猪链球菌病免疫接种示范项目，项目包括 链球菌知识培训，开展边境地区猪链球菌疫苗接种， 监测屠宰场和猪链球菌疫苗免疫场的的猪链球菌2型 抗体水平。示范项目在XX边境地区成功建立并推广实 施，以东兴市、大新县和那坡县边境县（市）为示范 区。20XX-2OXX年免疫示范县东兴市、大新县和那坡 县猪链球菌疫苗免疫平均覆盖率达到73. 24%o免疫猪 场猪链球菌2型抗体水平均达93. 37%0 20XX-20XX年 XX猪链球菌病人间病例数分别为26、18、34、65、95 人，而3个县（市）实行免疫示范后，连续5年人感 染猪链球菌数为0。本检测方法对猪链球菌流行的血清型有针对性进 行检测，从而快速诊断机体感染状况，制定切实可行 的疫苗免疫、生物安全等防控对策,对保护易感猪群、 高危人群具有非常重要的意义，适用于当前XX地区猪 链球菌病防控。为规范实验操作，建议在应用本标准 之前，先对操作人员进行技术培训，以培训班的形式 推广本标准。