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1、菌种保藏操作规程目的：规范微生物学标准菌种和野生菌种的保藏。职责：微生物检验员负责菌种的保藏、确认、传代、使用等。范围：本规程适用于标准菌种的管理和实验过程中分离纯化的野生菌种。编制依据：1 .实验室生物安全通用要求(GB19489-2008)2 .实验室质量控制规范食品微生物检测(GB/T27405-2008)；3 .中国工业微生物菌种保藏管理中心(ClCC)提供的菌种保藏方法；4 .微生物学实验(第四版)沈萍、陈向东主编，高等教育出版社；5 .食品微生物实验技术，牛天贵主编，中国农业大学出版社；本中心主要采用斜面定期移植法、液体石蜡法、甘油冷冻保藏法、瓷珠保藏法四种方法对各类型标准菌种或野
2、生菌种进行保藏，其详细操作如下：1斜面定期移植法亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4-6C进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。操作步骤如下：1.1 试剂、培养基种类a.营养肉汤或BHl培养基适用于所有细菌(除真菌外)的增菌；b.营养琼脂平板适用大肠杆菌，枯草芽抱杆菌，金黄色葡萄球菌等的培养；C.沙氏葡萄糖液体培养基适用于酵母、霉菌的增菌。沙氏葡萄糖琼脂培养基适用于酵母、霉菌的培养。1.2 试剂、培养基制备a.按照说明书要求溶解培养基并调PH值。b.将配好的培养基趁热分装。斜面培养基分装量约为试管
3、高度的四分之一（4-5mL）,穿刺培养基分装量以试管高度的二分之一为宜。c.将试管加硅胶塞，外面包扎一层牛皮纸并注明培养基名称及配制日期。根据要求将培养基灭菌，高压蒸汽灭菌121C,15-20mind.斜面摆放：灭菌后及时摆放斜面，斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。e.无菌检查：将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验，通常30C培养1-3天。无菌检查合格后将其保存于4C下备用。1.3 接种a.点接：把菌种点接在斜面中部偏下方处。适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌（如黑曲霉）等。b.中央划线：从斜面中央自下而上划一直线。适用于细菌和酵母菌（如大肠杆菌、枯草芽袍杆菌、金黄色葡萄球菌，白假丝酵
4、母）等。c.密波状蜿蜒划线法：从斜面底部自下而上划密“之”字形线。能充分利用斜面获得大量菌体细胞，适用于细菌和酵母菌（如大肠杆菌、枯草芽袍杆菌、金黄色葡萄球菌，白假丝酵母）等。1.4 培养：将接种后的培养基放入培养箱中，在适宜的条件下培养至细胞稳定期或得到成熟抱子。细菌培养温度一般为30-37C,真菌培养温度一般为25-280Co1.5 保藏：培养好的菌种于4-6覆膜保存，黑曲霉、枯草芽抱杆菌每3-5个月移植一次，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌每月移植一次，白假丝酵母菌保藏间隔为2个月。湿度用相对湿度表示，通常为50%-70%.1.6 菌种复苏：无特别要求，将菌株从冰箱取出至常温后直接转接。2甘油冷
5、冻法由于加入生理盐水能降低甘油的高渗作用，因此甘油一生理盐水保存液保存菌种优于甘油原液。其主要原理是靠低温来降低微生物活性，达到保存的目的。加甘油是为了避免水结冰产生冰晶损伤细胞，甘油还有隔绝空气、衡湿、调节渗透压、并在冷冻过程中起冷冻保护剂的作用。2.1 甘油生理盐水保存液制备取甘油（分析纯）8份加入生理盐水（0.9%）2份，充分混合后，经121C,30min灭菌后备用。2.2 培养基制备同斜面定期移植法。2.3 菌种保存管用带盖小塑料离心管，包装后高压蒸汽灭菌，经121,30min灭菌后烘干。2.4 方法步骤a.将冻干菌种复溶液增菌，根据菌种不同分别划线接种不同培养基于37C培养18-24
6、hob.用接种针取上述典型菌落接种营养肉汤管，37恒温振荡培养箱培养4-6h（亦可置于普通温箱培养6-8h）,真菌用接种环取菌洗入肉汤管，不做培养。C.然后按5份培养液加入2份保存液的比例加入已灭菌的保存液，分装于已作好标记的菌种保存管,每管约0.2ml盖紧,每株细菌保存多支,置-20冰箱保存。此甘油冷冻管为第2代（G2）.d.次日每种菌取一管于37水浴中快速解冻融化，接种于适宜培养基，确证生长良好且无污染，所余各管即可长期保存。保存过程中切忌融化。2.5 保藏时间：此法保存效果良好，主要适用于需氧细菌和酵母菌的保藏，一般菌类保存期限为2-4年。2.6 菌种复苏：使用时取出一支放至室温，转种增
7、菌培养或接种至琼脂平板复苏。3液体石蜡法亦称矿物油保藏法，斜面定期移植保藏法的辅助方法。是指将菌种接种在适宜的斜面培养基上，最适条件下培养至菌种长出健壮菌落后注入灭菌的液体石蜡，使其覆盖整个斜面，再直立放置于低温（4-6）干燥处进行保存的一种菌种保藏方法。操作步骤如下：3.1 无菌液体石蜡的制备选用优质化学纯液体石蜡，将液体石蜡分装加塞，用牛皮纸包好，可采用以下两种方式进行灭菌：a. 121湿热灭菌30min,置40C恒温箱中蒸发水分，经无菌检查后备用。b. 160干热灭菌2个小时，冷却后，经无菌检查后备用。3.2 斜面培养物的制备参照斜面定期移植法。3.3 灌注石蜡将无菌的液体石蜡在无菌条件
8、下注入培养好的新鲜斜面培养物上，液面高出斜面顶部ICm左右，使菌体与空气隔绝。3.4 保藏a.注入液体石蜡的菌种斜面以直立状态置低温（4-6）干燥处保藏，黑曲霉、枯草芽抱杆菌保藏时间2年以上，白假丝酵母1-2年，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌保藏1年。b.保藏期间应定期检查，如培养基露出液面，应及时补充无菌的液体石蜡。3.5 菌种复苏a.此法主要适用于霉菌、厌氧菌、放线菌、芽抱杆菌的保存。b.恢复培养时，挑取少量菌体转接在适宜的新鲜培养基上，生长繁殖后，再重新转接一次。C.从液体石蜡下面取培养物移种后接种环在火焰上烧灼时，培养物容易与残留的液体石蜡一起飞溅，应特别注意，尤其是保藏致病菌更需小心。4瓷
9、珠保藏法冻存管里的小瓷珠表面多孔，细菌可以很方便的吸附在上面。冻存管接种上细菌后，可放置于-20环境中长期保存。（-20C可保存一年）4.1 菌种保存a.使用前用油性笔在每个冻存管上标记上细菌的名称。每支冻存管只可接种一种细菌。b.在无菌条件下，打开冻存管的螺旋瓶盖。c.用接种环挑取18-24小时新鲜细菌纯培养物，放入冷存液中。拧紧瓶盖，来回颠倒使细菌乳化，配成大约3-4麦氏比浊度的菌悬液。此时菌悬液会吸附在小瓷珠内外表面。d.用无菌移液枪将冻存管中的菌悬液尽量吸出。（吸出的菌悬液应放入消毒液中并随后进行高压灭菌处理）。e.拧紧瓶盖。记录下接种细菌的详细情况。f.将接种完细菌的冻存管放在-20
10、C冰箱保存。4.2 菌株复苏a.取出冻存管并用力摇晃，使管内瓷珠分散。无菌条件下拧开冻存管，用无菌的接种环（接种针）或镜子取出小瓷珠，拧紧瓶盖。b.尽可能快地将冻存管放回原来的保存环境，温度过多改变将减弱细菌的生存能力。C.取出的小瓷珠可以直接放在平板培养基上作划线接种，或者直接置于适合的液体培养基中培养。4.3 注意事项a.未经使用的冻存管可在室温保存12个月，已经接种的冻存管在-20可保存12个月。b.在接种之前有如下情况发生，该冻存管不得使用；a）瓶子有漏液情况发生；b）冻存管内的冻存保护液混浊；c）超过有效保存期。C.小瓷珠一旦从冻存管中取出，不得再放回冻存管中；d.当丢弃使用过的或部分使用过的冻存管时，应注意生物危害的预防。
