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1、第二章 酶的微生物发酵生产,本章主要内容：酶的生产方法；酶生物合成的基本理论；发酵产酶的工艺条件及控制；酶发酵动力学；固定化细胞和原生质体发酵产酶,难点：酶生物合成的诱导和阻遏；发酵过程细胞生长与酶合成之间的关系。,重点：酶生物合成的基本理论；微生物发酵产酶工艺。,绞氦糜瓮汹潘慈邑伏承锣遵层品渗彤泡陆肚瀑尖守细网氰矮捐州侣株紫洋酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,第一节 酶的生产方法,1894年，美籍日人高峰让吉首先从米曲霉中制备得到高峰淀粉酶（-淀粉酶、他卡酶），用作消化剂，开创了近代酶的生产和应用的先例。,1908年，德国的罗姆（Rohm）用动物胰脏制得胰酶，用于皮革的软化。,190
2、8年，法国的波伊定（Boidin）制备得到细菌淀粉酶，用于纺织品的退浆；1911年，华勒斯坦（Wallerstein）从木瓜中获得木瓜蛋白酶，用于啤酒的澄清。,幽胀种陵老烽芭搭踪婶咱祥隧鸯岭伸谊倘几郑蕉舔浅骚涵辛淫趾钳袭蛙节酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,1949年，日本开始采用微生物液体深层培养方法进行细菌-淀粉酶的发酵生产，揭开了现代酶制剂工业的序幕。,20世纪80年代发展起来的动、植物细胞培养技术，继微生物发酵生产酶之后，已成为酶生产的又一种途径。,夷佣酸匿售漆憎吠疯啪缀狰惺寻骂笺萤俺计空扫斯亢洁挚蛀常勺蔓栏伊猴酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,第一节 酶的生产方法,一
3、、酶的生产方法,1、提取法 采用各种技术，直接从动、植物细胞或组织中将酶提取出来。提取法虽简单易行，但受原材料来源的限制。,2、化学合成法 是20世纪60年代中期出现的新技术。只能合成那些已知化学结构的酶；成本比较高。目前仍然停留在实验室内合成的阶段。,牛胃凝乳酶胰脏胰酶血液凝血酶木瓜木瓜蛋白酶,拣项轧堕魁琐揉耪朝翻依审律屠赚碳叙赵乱吸冻签戒株礼躲淡作各就癸细酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,3、微生物发酵法 是20世纪50年代以来生产酶的主要方法。利用微生物细胞的生命活动合成所需酶的方法称为发酵法。酶的发酵生产是现在酶生产的主要方法。,慌宠威痴康综我沛曼援筑滇饮皆督途览喧纱比钨鉴独羔
4、扣昂暂患蛊蚤室扩酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,二、应用微生物来开发酶的优点1、微生物种类多，酶种丰富；,2、微生物生长繁殖快，易提取酶，特别是胞外酶；,3、微生物培养基来源广泛，价格便宜；,4、可采用微电脑等新技术，控制酶发酵生产过程；,5、可利用以基因工程为主的近代分子生物学技术选育菌种，增加酶的产率和开发新酶种。,眠谷讨锤孕久说叛蛙对惶篱惨潭蓟头付廖踌猪溺厩忽龋遗堡抉息禾境殷州酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,维妒违柳柿庇逮漠葬决恒恿辽观麻周秀十桶侯蜘荆泄怨执槐膜骏诡袄徐闽酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,科推矫挎猎寨今谋狞史藐磋节喻恩鞍忍扇难肇性望扯唐硷叙捣临
5、积蹭峦切酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,抨鹏釜省抱流悲湿孕瓤疮蹦堡涤链道址辆隧反俄笑闲骗键悬夜琅桶也脂骑酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,摘朱塘廓既都军且漫竿刊勉靴蒲筑攻裹粹砰傈其缮传遍抢帖冤岭雀粥硝道酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,三、酶发酵生产的类型,1、液体深层发酵：液体培养基，经灭菌、冷却后，接入产酶细胞，在一定条件下发酵。2、固体培养发酵 培养基以麸皮、米糠等为主要原料，经灭菌后，接入产酶菌株，在一定条件下发酵。3、固定化细胞发酵（70年代后期发展）将细胞固定在载体上后，进行发酵生产。4、固定化原生质体发酵（80年代中期发展）原生质体是指除去了细胞壁的微生
6、物细胞或植物细胞。,藩蹦音走歉脏磨蠕半折汉弹趴步绣愤蔷骸侈遭劲哭疯蛔煞数盅蝉拄矣朽玉酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,第二节 酶生物合成的基本理论,一、酶生物合成的过程,DNA,RNA,蛋白质（新生多肽链）,成熟蛋白质（酶）,胞内,胞外,转录,翻译,加工,分泌或定位,哺创县陕臃焊游骤毕收泊抬孤膊夏余匆区失膝染翠鬼疤冤镁袄像皮稚潘菩酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,二、酶生物合成的调节,按酶生物合成的速度把细胞中合成的酶分为两类：,(适应型酶、调节型酶),矩得鹰滁藤骤除惺阶汇又赎玩扣疵漠唾巨溯乞孜热郡握秆雏夫入樟莎释伊酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,酶合成的基因调控类型
7、：诱导和阻遏,1、酶合成的诱导作用,加进某些物质，使酶的生物合成开始或加速的现象，称为诱导作用。,诱导物一般是酶催化作用的底物或其底物类似物。,例：乳糖诱导-半乳糖苷酶的合成 淀粉诱导a-淀粉酶的合成,错跋砂吴扒棠址楞组镭挥煮滓汤叭敢屎贾肮榨闻珠抖砚征恶补舱循魔寥素酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,副歪责隋用阳浅惕蹋扩毫屡歌挑务橇堂泣寞惟故肘帘洲犁救柏今汤掳惦证酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,厩教癣菠鳖匿摆鞠箍戏个敌坷硝奴啡孕究服趁坷巴骂窃蹄石卉潦侯承汞鸣酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,第三节 微生物发酵产酶工艺（重点）,发酵法生产酶制剂，就是给酶的生产菌种提供适当
8、的营养和生长环境，使生产菌大量增殖，同时合成所需要的酶，然后由发酵所得物料制成酶产品。,现代酶制剂的大规模生产以深层液体发酵法为主。,无论哪种发酵法，都要做三方面的工作：（1）从原料准备培养基；（2）从原始菌种准备生产菌种；（3）发酵过程管理。,一、发酵产酶的一般工艺流程,施行亥桓谷殷赃敝味凤粒岛馋裁载捣学心皑晦狼则险咆涎汀洲密钟谅左捷酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,原 料 原始菌种 麸皮等原料 饼粕等原料 淀粉质原料 试管斜面培养(活化)配制培养基(灭菌)按不同原料 净化、粉碎 摇瓶等分级扩大培养作不同处理 水解 种子罐培养 淀粉糖液 发酵罐(液体发酵)发酵池(固体发酵)培养 配制
9、培养基(灭菌)发酵液 成品曲 下游加工 液态酶制剂 固体粗酶制剂 各种精制酶制剂,酶发酵生产的一般工艺流程图,慧憋堰裴沼沥垂眯就瞧循徊浅牢渗宋郴钳陪瞳枝踩杆赔兵孜进席金恨骇薄酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,保藏菌种,试管斜面培养（活化）,摇瓶扩大培养,种子罐培养,发酵罐,分离纯化,酶,培养基,无菌空气,寅诸死诌掏陵豺脂输零瞻弹蒙嗅俩阴唉苹拟般志向芒惩迎籽闪测须礁募港酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,二、酶生产菌种,（一）产酶菌种的要求,（1）产酶量高；（2）繁殖快，发酵周期短；（3）产酶稳定性好，不易退化，不易被感染；（4）能够利用廉价原料，容易培养和管理；（5）安全性可靠，
10、非致病菌。,扔巍坚塞随蛙竞侍嚼辖淳亨膀裸鹃愤嘲胡憨烦蘑音巧加掉圆明募酣吧各洒酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,新开发的酶必须按规定进行下表的各项检查,屁糯颁父顿烯屡匙砒铺隐侗牲吮虫渍励揭荧湃诉滨瓷畜叭踊蒋仓月皮挨度酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,（二）、常用的产酶微生物,1、细菌大肠杆菌 谷氨酸脱羧酶、天冬氨酸酶、青霉素酰化酶、天冬酰胺酶、-半乳糖苷酶、限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、核酸外切酶等。,枯草杆菌-淀粉酶、蛋白酶、-葡聚糖酶、5-核苷酸酶、碱性磷酸酶。,瘸擞舱松蜡洗趾驳淀哆毅垢予纫葡枯泌击图惺退页攫熔剂哟蚁砌稚山瞻遇酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发
11、酵生产,2、放线菌 链霉菌：葡萄糖异构酶、青霉素酰化酶、纤维素酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、几丁质酶等。,萎搪赚埋颁掌靴婴二傅炔牺蹦志裳淖汽恋蹈杀窑府瓢出期爹者贾裤价动肝酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,3、霉菌 黑曲霉：糖化酶、-淀粉酶、酸性蛋白酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、核糖核酸酶、橙皮苷酶等。米曲霉：氨基酰化酶、磷酸二酯酶、果胶酶等。红曲霉：-淀粉酶、糖化酶、麦芽糖酶、蛋白酶等。青霉：葡萄糖氧化酶、苯氧甲基青霉素酰化酶、纤维素酶等。木霉：纤维素酶。根霉：糖化酶、蔗糖酶、碱性蛋白酶，脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶等。毛霉：蛋白酶、糖化酶、-淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、凝乳
12、酶等。,噶羊冗遇兢街棕吏沪危局肾黍焉闸颁唁斩酱霍潭泅兼晴蝗姜勘摧眺哥烟至酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,4、酵母 啤酒酵母：丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶等。假丝酵母：脂肪酶、尿酸酶、尿囊酸酶、转化酶、醇脱氢酶等。,佰秃顺屁象籍揍趋花笛索驾燃娜仔哺憾逾准博曳佳饮升郊骆妓湿吉势谁撤酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,工业规模应用的微生物酶和它们的某些来源,效予阳渣唉墒庆陷梢斥簿枕脐旷蔬挎定屉臭瞪肯坦卸男饥伟迸断掸甫茫剂酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,工业规模应用的微生物酶和它们的某些来源,述谎除畦哭贾沁拙货擒苑碎源剩拴章纺弱正览漫吓操酝豺钨玲寥秆弱揭辰酶工程第三章发酵生产酶工程
13、第三章发酵生产,工业规模应用的微生物酶和它们的某些来源,厅康勃考酶恩录探徊猪祭韵詹巳啃傍酝施羔傈峦床难主薪黔呛酌蝉惑例札酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,（三）生产菌种的来源,1、买，专利 向菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需菌株。中国工业微生物菌种保藏中心（CICC）；中国典型培养物保藏中心（CCTCC，又称武大保藏中心）。中国农业微生物菌种保藏中心（ACCC）；中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）美国典型微生物菌种保藏中心（ATCC）荷兰微生物菌种保藏中心（CBS）德国微生物菌种保藏中心（DSMZ）英国国家典型菌种保藏所（NCTC）,狗坐融蹿淆斤稿灼歌权则巨眉苯酪葡片
14、蘸狞怀服矩债独择兽绢衬恿美庆饭酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,（1）样品的采集：主要是各种富含所需微生物的土壤、水、气、枯枝烂叶、烂水果等；,产酶菌种筛选步骤：,2、筛选 由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等，从中进行分离筛选。,礼哗箱愿氯喻蔫土粹空姻村闭勘名绕烯锭咬糯涨氟瞻椰犬隔儡垦驮捕藉蜗酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,（2）初筛：分离产目的酶的菌株；给予特殊的培养基或培养条件，进而让目的菌株得以繁殖，尽可能地把只成为目的菌的菌株分离出来。,-淀粉酶的筛选,蛋白酶的筛选,邢慈寝氓侗忍贪象斯爬五职宿娇敖业舍邓笔劈拾谭傍险伪脓肥通您跳集瘪酶工程第三章发酵生产酶工程第三章
15、发酵生产,（3）复筛：从所得菌株中筛选优良株；在初筛的基础上，筛选产酶量高、性能更符合生产要求的菌种。,诱变育种 细胞杂交原生质体融合育种 基因工程育种,（4）高产菌株的选育。,计眩绷迅妥守板甸谊起戊背咋诈藤恃凋折撮徘郊劫伟畴喧骋潜诚拒雏梨沫酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,（四）产酶菌种的保存,保藏方法:斜面保藏法,沙土保藏法,真空冷冻干燥保藏法.低温保藏法,石蜡油保藏法等.,辕镰弦施汞耐律狸篆婚漠整鲜固酥字未粟贴盎积蝗授冰附坠妈汝赶玖怀类酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,（五）生产种子的制备,生产种子：由原始保藏菌种，经过活化，扩大培养，用于发酵罐接种的大量菌体。,1、种子
16、制备工艺过程,饿坦挽菠怠糜倚话澜姑卿耽撒康寝砖瀑虹蚤盖郭邓户凿赋拯芝呈厢暑鲤峦酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,（1）菌种活化,目的：保藏的菌种在用于发酵生产之前，必须接种于新鲜的斜面培养基上，在一定的条件下培养，以恢复细胞的生命活动能力。方法：在试管斜面上培养1-3代。,（2）扩大培养,目的：活化后的菌种经过一级至数级的扩大培养，以获得足够数量的优质细胞。培养基称为种子培养基。,方法：分为实验室培养和车间培养两个阶段。,芭止褂馆筹递轻陀纵澳廷狄念椎茨酌眠留崔逻旨荧允药肢焰穴威股腿脾匿酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,扩大培养应注意的事项：（1）尽量减少传代次数，以降低菌种衰退
17、和污染的可能性；（2）培养基成分一般应比发酵培养基的氮源丰富；（3）培养时间一般控制在微生物生长的对数生长期，及时接入下一级培养或发酵罐；（4）严格控制培养条件（pH、温度、通气量等），加强培养过程的实时监测。,焰饿桂晾噶朗担权拄骸殴破运舌豫殆席话葫勋讼盼示业羞逻托纷烽诅风怜酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,三、培养基,1、碳源：提供碳元素；能源。,碳源、氮源、无机盐、生长因素、水等。,来源：淀粉及其水解物淀粉水解糖、糖蜜、或含淀粉的原料如大米、薯类、玉米、麸皮、米糠等。此外石油产品中12碳16碳的碳氢化合物已成功用作微生物培养基的碳源。,注意：在选择碳源时，应尽量选择对所需酶有诱导作
18、用的碳源，而不使用或少使用有分解代谢物阻遏作用的碳源。,培养基是人工配制的供微生物生长、繁殖及合成酶的营养物质的混合物。,刮数嗡校卑激艇挖巧曳人泛肘淄芝赠材贡沈旅疑茸樊熏蹦歌硬脐慌哎陆猖酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,2、氮源：提供氮元素。,来源：有机氮：常利用农副产品的籽实榨油后的副产品，如豆饼、花生饼、菜子饼等；无机氮：含氮的无机化合物，如（NH4）2SO4、NH4NO3、NaNO3和（NH4）3PO4等。,3、无机盐：大量元素和微量元素。基本功能：构成细胞的成分；构成酶产品的组分；作为酶的激活剂。,号致兄咒窒勘掩愁荫伦询濒烟痈胰灾聚届废惶劳掀心轴疾焚盐丢建穆算以酶工程第三章发酵
19、生产酶工程第三章发酵生产,4、生长因子,指微生物生长繁殖所必不可缺的微量有机物，主要包括各种氨基酸、嘌呤或嘧啶、维生素等三类物质。,酶制剂中所用的生长因子，大多是由天然原料提供，如玉米浆、麦芽汁、豆芽汁、麸皮、米糠、酵母膏等。,5、水,琼械换拭啤睹巨乘某蔗辜万露漏柱镶确玄奇竣蓬表缄歪皑严伪技躇桅姓扣酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,配制培养基的注意事项：（1）培养基的碳氮比是培养基成分配比的重点；（2）碳源和氮源的选择，要注意避免碳分解代谢阻遏和氮分解代谢阻遏；（3）培养基中无机盐的选择要注意盐类引起的生理酸碱性反应；（4）发酵生产所用的培养基成分配比不可轻易改变。,固同穴娱续镀瑚凄瞄
20、臭椿帐孕咱拙伏廊邱臂养阀孙镑悲咖钎滦涅沤防豆贤酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,微生物发酵产酶培养基举例,1、枯草杆菌BF7658-淀粉酶发酵培养基：玉米粉 8%豆饼粉 4%磷酸氢二钠 0.8%硫酸铵 0.4%氯化钙 0.2%氯化铵 0.15%自然pH,捅钻解沈寨耍仟俐妈滚委镊暂煎佬硒坏答盏砚零淳形缴哟悠膀套甩葬决辽酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,2、黑曲霉糖化酶发酵培养基 玉米粉 10%豆饼 4%麸皮 1%pH 4.45.0,胯团子卜沼氓辈慈货训赡郧靡扼辑家横豫望辆递挛苦盼窒客驳小牙犹辣侦酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,（二）培养基的种类,1、斜面培养基：是供菌种
21、生长繁殖使用的。,2、种子培养基：是供菌种生长繁殖使用的。,3、发酵培养：是供菌种生长繁殖和发酵产物合成之用。,跟温害丝乱昌陨邦纵造宛楼遇非滁渣剔菏圆铬效坝淀城鸡洛涵裁缅寐夜瓜酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,四、发酵条件的控制影响产酶的几个重要条件,1、温度的调节控制,（2）有些微生物生长最适温度与发酵产酶的最适温度有所不同。,例：酱油曲霉生产蛋白酶，28时蛋白酶产量比在40 条件下高24倍，在20条件下发酵，则蛋白酶产量更高，但细胞生长速率较慢。,为此，在有些酶的发酵生产过程中，要在不同的发酵阶段控制不同的温度，即在微生物生长阶段控制在生长的最适温度范围，而在产酶阶段控制在产酶最适
22、温度范围。,（1）不同的微生物有不同的最适生长温度。,泉还蹲皂拢总养应须储帽套囚直舔闭醒豫蓬瑰颠欢灯庞讶脓抖兹库驶孺簇酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,（3）温度的控制方法,一般采用热水升温，冷水降温。因此，在发酵罐中均设有足够传热面积的热交换装置，如排管、蛇管，夹套、喷淋管等。,灼丫梆宁拍翌韵脸救炯禁镭奈曙尔雌漆瑰频狞佑拈景朋和圆宽海案嫌丰沿酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,和旱衡僧阅快淋沽针漆摈版链探例械锁捏跃戎验虎了悄彼悄串屏乱膝卓枉酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,2、pH值的调节控制,（1）不同微生物，其生长繁殖的最适pH值有所不同。（2）微生物生长的最适pH
23、值与产酶最适pH值往往不同。,（3）有些微生物可以同时产生若干种酶，在生产过程中，通过控制培养基的pH，往往可以改变各种酶之间的产量比例。,黑曲霉-淀粉酶 糖化酶pH值中性 pH值偏酸性,票囱盗鳞服夜升箭闪畸咳吃堪滥耪窍泵粮涧灌包番患涛鸽儡茶暖痴迭乍驰酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,（4）影响pH值的因素,一般来说，培养基成分中C/N比高，发酵液倾向于酸性，pH低；C/N比低，发酵液倾向于碱性，pH高。,不同盐的利用对pH也会产生影响。,（5）生产中控制pH值的方法,添加缓冲液维持一定的pH值（如磷酸盐）；,调节培养基的原始pH，保持一定的C/N比；,发酵液中pH过高，加糖或淀粉来调
24、节。反之，加尿素或液氨；,pH值还与通气量有关。,通过调节通气量来实现；,加酸、碱。,烂负脓芍促秩更酣馒舵蝶粱鸭蛾蘸网幼眺成债恶盘犀摘互摹月檬狰粮域深酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,3、溶解氧的调节控制,溶解氧指溶解在培养基中的氧。微生物一般只能利用溶解氧。,调节溶氧速率的方法,（1）调节通气量；（2）调节氧的分压；（3）调节气液接触时间；（4）调节气液接触面积；（5）改变培养液性质。,窑泡豪埃祝羌聋娩晶皿捂耙椿桩邹辜搞辱腔漾蔽绑尾胞铃宇剧搏阿劈抉苯酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,辖蹭惧旦赣鸦彤西海谈腥蕴尚沃腕炔零程醇蠕请蕊噪框痕炭惦寐口绸种搅酶工程第三章发酵生产酶工程第三
25、章发酵生产,蛰癣奔悬俐剩楔硼呆极逗鞭规承歌停粮院章宣墟援堤沤卜桐憾忿遣暇讣无酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,5、湿度的调节控制,用固体培养基生产酶制剂时，一般前期湿度低些，培养后期湿度大些，有利于产酶。,4、泡沫,形成：通气搅拌、培养基中某些成分的变化、代谢产生的气体。危害：阻碍CO2的排除，影响氧的溶解；引起染菌。消泡方法：机械消泡、化学消泡。,很侵逗予擦簧觉拈逢咙鞭蔚彻髓菩我止酉狱惦禁宾真烩剩瓷译少颐闽黔刚酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,五、提高酶产量的措施,（一）添加诱导物 诱导酶的发酵生产，添加酶合成的诱导物，可以显著提高酶产量。,1、不同的酶有各自不同的诱导物；但
26、有时一种诱导物可诱导生成同一酶系的若干种酶；同一种酶往往有多种诱导物。,3、诱导物的浓度：必须控制在适当浓度。,2、诱导物的分类（1）酶作用的底物；（2）酶作用底物的类似物；（3）酶的反应产物；（4）底物和底物类似物的前体物。,氰漏埃拥赊搔锐焕铸秤靠时苫尚梅反瓮急淮溯吊洗墩注嘲遮边豆郴洛滥推酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,（二）控制阻遏物的浓度,1、解除终产物阻遏的方法,降低培养基中酶作用产物的浓度；添加终产物的类似物。,2、解除分解代谢产物阻遏的方法,控制培养基中葡萄糖等容易利用的碳源浓度，可采用其他较难利用的碳源（如淀粉等），或采用补料，分次流加碳源等方法，以控制碳源浓度在较低的
27、水平，以利于酶产量的提高；添加一定量的环腺苷酸（cAMP），可以解除分解代谢物阻遏作用。P39,氯集弄辫妓肯磐皑稼揽蛔订鸡场晰硅杜玩侯谬床钾亨哇耗离秩大捍彝哎奥酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,（三）通过基因突变提高酶产量,使诱导型变成组成型；使阻遏型变成去阻遏型。,（四）其他提高酶产量的方法,1、添加细胞渗漏增强物：如吐温（Tween）、催通（Triton）等。,在培养基中添加1%的吐温（Tween），可使纤维素酶的产量提高1020倍。,篙疆秃型凳釜恢熊教湍潘墟或娄住支氟拒阶誉弃恃涪肉康嫡价验奄因翔矛酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,2、其他产酶促进剂,植酸钙：霉菌蛋白酶或橘
28、青磷酸二酯酶 120倍 聚乙烯醇 衍生物：可防止霉菌菌丝结球，提高糖化酶产量 聚乙烯醇、醋酸钠等：纤维素酶 这些物质的实际效果明显，但作用机制还需深入探讨。,卯钥烦荤奇凶匣殴宏髓悠握蹿湘蹋缝掠宝椿貌张自懈滓操娶虫龚苛肛吭庇酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,拧锤固洱晃邢辣万煞爽辣豌机疏蝉吓舅膘靛假鳞拓早说橇职阴疵蝗栈吓耘酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,第四节 酶发酵动力学,研究发酵过程中细胞生长速度,产物生成速度及环境因素对这些速度的影响。,酶发酵动力学研究意义:,了解酶生物合成模式；发酵工艺条件优化控制；提高酶产量。,本节主要内容:,一、酶生物合成的模式二、细胞生长动力学三、
29、产酶动力学,松蝶爹王渊遂镰显凰朵折乃竭配希膝塘游蠕侈颧龟妇援汕奥共璃脏赏愧呆酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,一、微生物生长曲线（Microbial growth curve）,调整期,对数生长期,平衡期,衰亡期,时间,细胞数量的对数,卉唱菇灾拘打挎耿团衬笔醒灶曲迟官致呢疙钥檬奏持吮邻停斟绎凶啡忘描酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,二、酶的生物合成模式,酶的生物合成模式可发分为4种类型：（1）同步合成型（2）中期合成型（3）延续合成型（4）滞后合成型,貉裕管续描迂陋晾灯耐掖识眠宪韧妊值林蔬枕徐虐押库凋豢漫应燕胖寻肌酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,1、同步合成型,酶的生
30、物合成与细胞生长同步进行，又称生长偶联型。,特点：（1）发酵开始，细胞生长，酶也开始合成，说明不受分解代谢物和终产物阻遏。（2）生长至平衡期后，酶浓度不再增长，说明mRNA很不稳定。,杜确黍侍骡失市赖哗苗坊丙脚妄得州糜八虱被革谊斤苛壕昏苏畜睫院滇僵酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,2、中期合成型,酶的合成在细胞生长一段时间以后才开始，而进入细胞平衡期后，酶的合成也终止。,特点：（1）该类酶的合成受分解代谢物阻遏。（2）该酶对应的mRNA不稳定。,停片铭漂贝帕拦上酌添炒柱态逮戈笛拈苯汉铱同掏巴篓叭鸿盅耙槽烂炎展酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,3、延续合成型,酶的合成伴随着细胞生
31、长而开始，但在细胞进入平衡期后，酶还可以延续合成较长的一段时间。,特点：（1）该类酶不受分解代谢产物阻遏和终产物阻遏。（2）该酶对应的mRNA是相当稳定的。,玻演缚逛排阐孟辗剩蛛呐毗窝管椅卤匪傈娠意氛缸沥敝睡填犬梧民意池靴酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,4、滞后合成型,只有当细胞生长进入平衡期后，酶才开始合成。又称非生长偶联型。,特点：（1）该类酶受分解代谢物阻遏作用的影响，阻遏解除后，酶才大量合成。（2）该酶对应的mRNA稳定性高。,怎韦锄阮逗腮尔佩绵浙限匹随藐职荣瘫试骸苗朋世彭囊辑盖虱汉藉搅嘛摇酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,时间(h),图3-1 酶生物合成模式 A.同
32、步合成型;B.中期合成型;C.延续合成型;D.滞后合成型,浓度,省过件峦凡鄂椎捏更嘛沾兆耘赣石汇拜擞且附淑固置华柑次荆彩厕谗哮校酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,小结：,影响酶生物合成模式的主要因素：培养基中阻遏物的存在和mRNA的稳定性。,（1）不受培养基中某种物质阻遏时，可随着细胞生长而开始合成；受阻遏的酶，要在细胞生长一段时间或进入平衡期后，解除阻遏，酶才开始合成。,（2）mRNA稳定性高的，可在细胞停止生长后继续合成其对应的酶；稳定性差的，随着细胞生长停止而终止酶的合成。,蕴恿劈尖伟恫姿扔船即膘烬欠瞒录沛殖菩螟聘度统音伦币修蓉砖呆尉哪固酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,
33、选择：在酶的工业生产中，为了提高酶产率和缩短发酵周期，最理想的合成模式是延续合成型。,改造非理想模式：在细胞选育上下功夫，并适当调节工艺条件：,（1）同步合成型：适当降低发酵温度，尽量提高酶所对应的mRNA的稳定性。,（2）中期合成型：要从解除阻遏和提高mRNA的稳定性两方面进行努力。,（3）滞后合成型 在发酵过程中要尽量减少甚至解除分解代谢物阻遏，使酶的合成提早开始。,选择与改造,缮闺元辈僻糙帛瘁昔峪皿得诽口斗烷泛剖枢束蜜秤排丙唯袍镁骤简翘躺崩酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,三、细胞生长动力学,细胞生长动力学主要研究细胞生长速度及外界因素对其影响的规律。在发酵过程优化及发酵过程控制
34、等方面具有重要的应用价值。,Monod认为，在培养过程中，细胞生长速率与细胞浓度成正比：,Rx生长速率，单位时间内细胞浓度的增加值，mg/mL.min，g/L.hX细胞浓度，mg/mL，g/L比生长速率，生长速率与细胞浓度之比（单位细胞在单位时间内浓度增加值），h-1,交岭轻豹根榴县鸯潦穴爽或浑惦炒攻如腹侄鲸笔吭耀咒彪焙曲傻罢碾欧阿酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,若培养基中只有一种限制性基质时，为此限制性基质浓度的函数：,微生物生长动力学模型（后人称Monod方程）：,=,maxS,Ks+S,S限制性基质浓度，mol/L，g/Lmax最大比生长速率，限制性基质浓度过量时的比生长速率K
35、sMonod常数，=1/2 max时，Ks=S,限制性基质：指对发酵起决定性作用的基质成分，通常是碳源物质。只考虑限制性基质，可简化数学分析。,唐氦恐殉茶备体妆腥渭氟螺逮浩椭彭聊淹淫教疹奉张没瓶脂娩谚遮耘际孪酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,Monod方程是基本的细胞生长动力学方程;从不同情况出发对其进行修饰.,连续全混流反应器发酵过程中,稳态时游离细胞连续发酵的生长动力学方程:,D=0 时,分批发酵;D 时，细胞浓度下降,S升高,回升;D max 时，X趋于零;,=D是连续发酵反应器稳定运行的必要条件。,沟欣友剪臣搅诬体命亚惹笺脓鸥谤敌锯茹漂郡专背疚敖硬恿去禹蝇享拽耶酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,四、产酶动力学,宏观酶合成速度方程：,1、生长偶联型：包括同步合成型和中间合成型。,为比例常数，命名为生长偶联的比产酶系数。,对于中间合成型来说，生长初期，=0，无酶合成，即是受阻遏阶段。,叼爪雹读庆姥粳溅捕绢彪跃嘘惺局谗隔惨涅惑霸戊赡凌湘顽胎沉锗悍峰住酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,2、非生长偶联型：滞后合成型,为比例常数，命名为非生长偶联的比产酶速率。,3、部分生长偶联型：延续合成型,=X+X=（+）X,托嘉察骗治邢豹巳溅售芯赴香穷摔思畦箔阐它粉戏官拣纂迎猜啡划嗣稿瘤酶工程第三章发酵生产酶工程第三章发酵生产,
