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1、2023年Y染色体丢失在多发性骨髓瘤患者中的临床意义目的探究Y染色体丢失（LOY）在多发性骨髓瘤（MM）患者中的风险分层及预后意义。方法回顾性分析2018年1月至2020年1月复旦大学附属中山医院收治的193例男性初诊MM患者的临床资料，根据初诊染色体核型结果分成正常核型组（178例）与伴LOY核型组（15例）。采用秩和检验、22列联表卡方检验和独立样本f检验比较2组间肝肾功能、免疫组化和细胞遗传学等实验室检查结果、治疗疗效及生存预后等情况，通过生存分析及Cox回归探究LOY的临床预后。结果初诊男性MM患者LOY的发生率为8%（15/178）o伴LOY组的修订的国际分期系统（R-ISS）HI期
2、患者比例（8/15）高于正常核型组（40/178）（2=7.052/0.01）,且发生1q21扩增的比例（10/13）高于正常核型组（77/162）（2=4.159,P0.05）正常核型组在完成第4周期化疗后达到完全缓解（CR）/严格意义的完全缓解（SCR）的比例（63/171）高于伴LOY组（例15）（2=5.564,AO.05）,发生疾病进展（PD）的比例（16/171）也低于伴LOY组（4/15）（2=4.306,PO.O5)。伴LOY组MM患者的2年无进展生存期(PFS)较正常核型组短(Z=-3.201,P0.01)o单因素生存分析结果显示，肌酊93molLx2微球蛋白(2-MG)4.
3、0mgLx血清游离轻链比值(SFLC)0.06、骨髓浆细胞(BMPC)比例30%,R-ISSIn期、化疗4周期后未达CR/sCR及伴LOY、1q21扩增、户53缺失和t(4;14)遗传学异常的初诊MM患者PFS缩短(户均0.05);Cox回归分析显示肌酊之93molL(4/?=4.460,95%C11.61512.314,P=0.004)xsFLC0.06(HR=2813,95%Cn.2066.849,P=0.017)s化疗4周期后未达CR/sCR(HR=3522,95%671.4378.634,P=0.006)及伴LOY(HR=3.485,95%C11.4738.249,P=0.006)为影
4、响初诊MM患者PFS的独立危险因素。结论1.oY对初治MM患者的疗效与预后有重要的临床意义，是不良预后的独立危险因素，或可成为新型的临床评估指标。多发性骨髓瘤(multiplemyeloma,MM)是一种克隆浆细胞异常增殖的恶性疾病，是世界上第二大常见的血液系统恶性肿瘤，多于老年发病,目前仍无法治愈【1】。在使用不同甚至相似方案治疗时，MM患者的预后均具有高度异质性2,3。因此，识别高危患者对于疾病的风险分层非常重要4J。近年来，研究发现Y染色体除了在男性性别决定中的作用外，在生物学功能方面也具有重要意义15。体细胞Y染色体丢失(IOSSofchromosomeY,LOY)与各种癌症发生风险增
5、高以及预期寿命降低有关【6】。目前在血液系统恶性肿瘤相关研究中已发现，LOY与骨髓增殖性肿瘤(myeloproliferativeneoplasms,MPN)、骨髓增生异常综合征(myelodysplasticsyndromes,MDS)、急性髓系白血病(acutemyeloidleukemias,AML)和B细胞淋巴瘤/白血病的发生发展、临床表征及预后等因素密切相关7,8。然而至今针对LOY在MM中的研究却寥寥无几，因此本研究意在探索伴LoY的MM患者的临床特点，并探究该类患者的预后情况，以求找到二者间的相关性，从而为临床提供新型的预后评估思路与信息，并对患者进行更有效的个体化治疗。对象与方
6、法一、对象回顾性分析2018年1月至2020年1月在复旦大学附属中山医院收治的初诊MM男性患者共193例，年龄65(58,71)岁，其中，IgG-K型46例，IgG-人型42例,IgA-K型28例，IgA-入型38例,IgM-K型2例,IgM-入型2例，IgD-g1例，IgD-人型1例，不分泌型4例，K轻链型8例，入轻链型21例。患者均符合中国多发性骨髓瘤诊治指南(2020年修订)诊断标准1z且在诊断时对骨髓样本进行了染色体核型及细胞遗传学分析；患者在随访截止日期前在我院规律化疗至少4个周期。排除伴有严重肝肾原发病；合并其他恶性肿瘤或血液系统恶性疾病患者。根据初诊染色体核型结果将193例患者分
7、为正常核型组和伴LOY核型组，并收集患者的年龄、肌酊、乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase,LDH)、钙(calcium,Ca）、2-微球蛋白（2-microglobulinz2-MG）、血清游离轻链比值（serumfreelightchain,sFLC）、骨髓浆细胞（bonemarrowplasmacellzBMPC）比例、荧光原位杂交技术（fluorescenceinsituhybridizationfFISH）检测结果、修订的国际分期系统（revisedinternationalstagingsystem,R-ISS）分期、治疗方案和疗效预后等临床资料，并对两组各项临床指
8、标进行统计分析和比较。本研究已通过复旦大学附属中山医院医学伦理审查（B2022-207）o由于本研究为回顾性分析，因此复旦大学附属中山医院伦理委员会审核豁免知情同意。二、方法1.仪器与试剂染色体自动扫描分析系统（德国ZEISS公司）、OlympusBX51荧光显微镜（日本OlymPUS公司）、骨髓培养基（青岛莱佛生物工程研究所）、秋水仙胺（日本SIGMA公司）、胰蛋白酶（广州达晖生物技术有限公司）。2 .染色体标本采集与制备：常规抽取患者肝素抗凝骨髓液6ml,取适量骨髓液（使细胞浓度为11062106ml）接种于骨髓培养基中37培养23d,再加入20gL的秋水仙碱20l,37温育120min将
9、骨髓液移入10ml离心管中1300Xg离心10min,弃上清加入预温至37OC的0.075mmo/L的氯化钾IOml充分混匀，37OC温育35min,加入2ml固定液（3：1的甲醇和冰醋酸），混匀后1300g离心Iomin,弃上清，加入固定液10ml充分混匀，放置45min后1300Xg离心10min,弃上清，加入固定液10ml充分混匀，放置45min后1300Xg离心Iomin,弃上清，加入适量固定液配制成细胞悬液制片，用于后续实验。3 .常规染色体核型分析：将制备的染色体标本在显带液中进行G显带处理，即配制0.025%胰酶、0.85%生理盐水及吉姆萨染液，置于37水浴箱中预热20mino玻
10、片采用胰酶消化(50s起),后用生理盐水漂洗终止消化，并放入吉姆萨染液中染色(1min左右)。最后用流水慢速冲洗、风干。在显微镜下分析中期分裂象(每份标本分析20个分裂象)。依据人类细胞遗传学国际命名体制(2016)确定染色体核型与异常克隆9。4 .口514检测：采用池1和口135319、箱21、P53、免疫球蛋白重链基因(immunoglobulinheavychaingene,IgH)探针分别检测13q14缺失、Iq21扩增、P53缺失、IGH重排异常情况。5 .疗效评价标准：本研究中MM患者的疾病分期、治疗方案与疗效评价标准均参照中国多发性骨髓瘤诊治指南(2020年修订)M1o其中疾病分
11、期纳入R-ISSo疗效标准包括严格意义的完全缓解(stringentcompleteresponse,sCR)、完全缓解(completeresponse,CR)、非常好的部分缓解(verygoodpartialresponse,VGPR)、部分缓解(partialresponse,PR)、微小缓解(minimalresponse,MR)、疾病稳定(StabIedisease,SD)和疾病进展(progressivedisease,PD)。6 .治疗方案及随访：含有硼替佐米/地塞米松的方案：硼替佐米/地塞米松、硼替佐米/阿霉素/地塞米松、硼替佐米/环磷酰胺/地塞米松、硼替佐米/沙利度胺/地塞米
12、松；含有来那度胺/地塞米松的方案：来那度胺/地塞米松、来那度胺/硼替佐米/地塞米松、来那度胺/环磷酰胺/地塞米松含有沙利度胺/地塞米松的方案沙利度胺/阿霉素/地塞米松、长春新碱/沙利度胺/地塞米松；含有长春新碱/地塞米松的方案：长春新碱/环磷酰胺/地塞米松、长春新碱/阿霉素/地塞米松；含有伊沙佐米/地塞米松的方案伊沙佐米/地塞米松、伊沙佐米/环磷酰胺/地塞米松;硼替佐米/泼尼松方案。6组间治疗方案的选择无差异。无进展生存期（progression-freesurvivalzPFS）定义为开始对患者进行治疗到肿瘤出现进展的时间。随访时间截至2022年3月1日，随访时间249,23）个月。7 .统
13、计学分析：采用SPSS22.0软件进行统计学处理,正态分布计量资料的组间比较采用独立样本t检验酢正态分布数据以M（Q1,Q3）表示，组间比较采用非参数统计的秩和检验，计数资料以百分比（%）表示，多组间比较采用RC列联表卡方检验，组间比较采用22列联表卡方检验及Fisher精确检验（理论频数5）,生存分析采用KaPlan-Meier法，显著性检验采用LOg-rank法，采用CoX回归进行单因素和多因素分析。双侧P=15)IDw纪E组(r=178)快计值Ptt三(*)69(61,77)65(57.70)-1.7370.078IW(moVL)103(92,158)93(76.123)ZL0.230L
14、DH(U/L)151(132.193)172(140.220)Z三L0040.323(11WVI)2.24(2.12,2.S2)2.28(2.19,2.40)ZlM%0.S43PrMG(M)&26(329.9.21)3.97(242.7,29)ZT.3430.162sac1.72(0.07.26.20)0.61(OM.5.82)Z=T.2140.2MBMPC(%)40(15,53)27(10.S0)Z=T).730.453RlSSw(%)JX2=71520.028I3(3/15)49(27.S)X2O-390.5324(4/15)89(SOaO)2=3,0170.080m8(a/15)40Q2
15、S)2三Z0520.006注：IoY为供色体更失，MM杼3M5WM.IDH力JLtM,B2*g那2gg.SaC为3wm三比值，BMPC力WtMyfflIrRISS为11的国坛分期年院二、正常核型与伴LOY组MM患者的细胞遗传学结果比较178例正常核型与15例伴LOY的初诊MM患者中,分别有162例和13例患者在初诊时完善了FISH检测，包括1q21扩增、13q14缺失、P53缺失及IGH重排，其中IGH重排包括t（4;14）、t（14;16）、t（11；14）.t（14;20）o本研究中未检测到t（14;20）遗传学异常，因此未纳入表格中。结果显示，LOY组发生1q21扩增的比例高于正常核型组
16、（P0.05）（表2）。表2正常核型与伴LoY组MM患者的细胞遗传学结果比较例（%）如IgiS传KHff(HSH)LOYS(/=13)正皂核型维（0=162）x2fflHaSStt1(皿3)43(26.5)2.2720.130IBttq2irm10(10/13)77(47.5)4.1590.04113ql4S失8(8/13)66(40.7)2.1330.142PS3-1(1713)16(9.9)0.0650.802IGHSbllt(4；14)4(4/13)32(19)0.8940.342t(14；16)02(12)0.1620.860t(11；14)2(2/13)33(20.4)0.1870.
17、673注：部分患者自弁有多种透传字异常.LOY为Y染色体丢失，MM为多发性骨MLFISH依光原05如术，/6的免疫次蛋白更快更因三、正常核型与伴LOY组MM患者的疗效比较178例正常核型的MM患者中有171例具有治疗后的连续随访疗效信息，正常核型组在完成第4周期化疗后达到CR/sCR的比例高于伴LOY组（P0.05）,同时正常核型组化疗4周期后发生PD的比例也低于伴LoY组（P0.05）（表3）。表3正常核型与伴LoY组MM患者的疗效比较例（）17LOYiB(n=15)正常核型组（H=171）2佰P(三CR/sCR1(1/15)63(36.8)5.5640.018VGPR2(2/15)33(1
18、9.3)0.3210.570PR8(8/15)52(30.4)3.3160.072MR/SO07(4.1)0.6380.553PD4(4/15)16(9.4)4.3060.038注：LOY为丫染色体丢失，MM为多发性骨询S,CRi完全缓解，SCR为严格由义的完全缓解，VGPR为三朦好的部分缓解，PR为部分重解，MR微小缓解，SD为疾病稳定，PD为疾病进展四、正常核型与伴LOY组MM患者的生存曲线178例正常核型与15例伴LOY的初诊MM患者的PFS分别为2418,249月和12（8.5,21）个月，2年无进展生存率分别为80.3%（143/178）和5/15o正常核型与伴LOY的MM患者的2年
19、PFS差异具有统计学意义，LOY()树外寻嘤相W五、图1正常核型与伴LOY的多发性骨髓瘤患者的无进展生存曲线五、影响MM患者PFS的单因素与多因素生存分析单因素生存分析显示，初诊时患者肌酊93molLx2-MG4.0mg/L、sFLC0.06.BMPC30%xR-ISSIn期、化疗4周期后未达CR/sCR、伴LOY及1q21扩增与患者PFS相关（P0.01）,患者P53缺失及t（4;14）与患者PFS相关（P0.05）。即高水平肌肝、2-MGxBMPC,高R-ISS分期zsFLC0.06化疗4周期后未达CR/sCR及伴1q21扩增、P53缺失、t（4;14）和LOY遗传学异常的初诊MM患者PF
20、S分别较低水平肌肝、2-MGBMPC,低R-ISS分期,sFLC0.06,化疗4周期后达CR/sCR及不伴1q21扩增、P53缺失、t（4;14）LOY遗传学异常的患者缩短（表4）。进一步多因素生存分析结果显示，肌酊93molLSFLC0.06、化疗4周期后未达CR/sCR及伴LOY是影响初诊MM患者PFS的独立危险因素（P均*M7皿atm-IW29)no1,W*ZX7U)14aC04IOKMToWLOJtwiaMCUMO*.P2-HGKmgai.461mOOOl03930.093-16640.20Smcaot172IYTnOOOim血7BMKiJO!M7u9S200011.770d5lXt7
21、*lOASQM1.XQdlM-0lAOMmIvOOMXW3,*W4C.CM3I-MO0M5J1SOOMIJOtOgT*0.1X13414B1.M10.1X164OM.-1211AX)7M0043amt(4：H)I.IW1911QOMI(11；131.10MZCtTW-a：必力MtMIr的内力0aBaSnCgnw三tflBMCWJ三OCMtMNBf三V三rt,L0YWa.RjOH2fts*,w.mts讨论1.OY是男性造血细胞中最常见的体细胞基因组改变之一10,除与正常衰老有关外越来越多的研究发现LoY在恶性肿瘤中高频率出现，且与疾病的发展、表型和治疗反应相关11,包括多种血液系统恶性肿瘤。先前
22、的研究报道，LOY是MDS中最常见的细胞遗传学异常之一，男性的发病率高达30%8x12一些研究发现，与不伴LOY的患者相比，伴LOY的MDS患者环形铁粒幼红细胞的比例更高，而骨髓粒红比值、未成熟细胞比例和血白细胞计数则更低7。此外，伴LOY的MDS患者的总生存期和无白血病生存期更长；相反，在AML、慢性髓系白血病和慢性淋巴细胞白血病中，LOY患者的预后则较差13o尽管LOY在血液系统疾病中的研究已有不少，但其与MM的相关性研究却很少。MM是一种遗传背景复杂的血液系统恶性肿瘤，MM患者的预后存在高度异质性14,因此，早期对MM患者进行风险分层，并随后实施个体化治疗具有重要意义。本研究分析了伴与不
23、伴LOY的MM患者的临床特征、细胞遗传学结果、疗效及预后等情况，以期找到LOY与MM的疾病严重程度及预后等的相关性。本研究中伴LOY的MM患者占所有男性MM患者的比例为8%,与先前的研究结果一致口5,16本研究首先对正常核型与伴LOY的初诊MM患者的临床资料进行比较，发现伴LOY组R-ISSIn期患者比例高于正常核型组(P0.05).近年来，随着细胞遗传学和分子生物学的进展和应用，通过FISH鉴定的特定细胞遗传学异常已被国际骨髓瘤工作组(InterTlatiOnalMyelomaWorkingGroupJMWG)纳入新修订的国际分期系统中，用于MM预后分层180最常见的异常包括P53缺失、13
24、q14缺失、1q21扩增、t(4;14)、t(14;16)和t(11;14)1。其中，t(4;14)、t(14;16)和P53缺失与不良预后有关,被分为细胞遗传学高危异常，而t（11;14）则与相对较好的临床结局有关19。本研究中正常核型与LOY组发生细胞遗传学异常的比例分别为73.5%（119/162）和12/13,在2组间的比较中仅发现LOY组发生1q21扩增的比例显著高于正常核型组（P0.05）。1q21扩增在MM疾病的发生和进展过程中发挥重要作用，故常出现在大多数晚期MM患者中。研究发现，伴1q21扩增的难治性或复发性MM患者的生存期更短，1q21扩增是一个不良预后因素20。因此，本研
25、究认为LOY也可在一定程度上反映不良预后情况。两组间其余细胞遗传学异常差异无统计学意义，但LOY组确实在与不良预后相关遗传学改变组中表现出了更高的比例，也在t（11；14）组中低于正常核型组。可能由于本研究纳入的患者例数有限，需待后续研究探究证实。本研究纳入了第4周期化疗后的疗效评估，发现正常核型组在完成第4周期化疗后达到CR/sCR的比例高于伴LOY组（P0.05）,且发生PD的比例也低于伴LOY组（P0.05）,说明LOY可能与较差的疗效及化疗敏感性相关。目前仅有的涉及MM与LOY的文献报道对于LOY的预后相关性结果尚不明确16。为探究LOY在MM中的预后价值，进一步进行生存分析,发现正常
26、核型与伴LOY的初诊MM患者2年中位PFS分别为24个月和12个月，2年无进展生存率分别为80.3%和33.3%,LOY组明显降低（P0.01）,预后更差，发生进展的概率更高。根据多发性骨髓瘤诊治指南，MM的预后主要由宿主因素、肿瘤特征和治疗方式及对治疗的反应等多方面因素决定1o既往研究报道，年龄、肌醉、sFLCxBMPC.2-MGxLDH、多种细胞遗传学异常和R-ISS等都是MM的独立预后因素14,21,这些指标与合并症发生风险、肾功能受损情况、肿瘤细胞增殖、肿瘤负荷、疾病进展及治疗反应等密切相关。本研究以中位数为界，对各潜在预后影响指标进行了分层。单因素生存分析结果显示，高水平肌酊、2-M
27、G.BMPCz高R-ISS分期，sFLC0.06化疗4周期后未达CR/sCR及伴LOY、1q21扩增、P53缺失和t(4;14)遗传学异常的初诊MM患者PFS显著缩短，提示预后更差。进一步多因素生存分析发现，高水平肌酊,sFLC0.06,化疗4周期后未达CR/sCR及伴LOY为评估MM患者预后的独立危险因素。由于本研究纳入的患者数量有限，且每位患者的疾病随访时间仅为2年，因此并未将总生存期纳入生存分析，也未得到更加完整准确的研究结果，这是本研究的一大遗憾，但也期待在之后的研究中进一步完善。综上所述，LOY与MM疾病高风险相关，且LoY是MM预后的独立危险因素，有可能作为新型MM预后预测指标，并指导临床早期进行干预，实施个体化治疗。参考文献(略)
