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1、2022年Toll样受体是连接过敏进程和卫生假说的桥梁（全文）摘要过敏进程揭示罹患特应性皮炎的婴幼儿后期易发生食物过敏、过敏性鼻炎和哮喘。卫生假说强调个人卫生和环境越干净，哮喘和变态反应（过敏症）的发病率反而越高。现认为，模式识别受体Toll样受体（TLR）是连接固有免疫和适应性免疫的桥梁，在炎症和免疫性疾病中起重要作用。越来越多的证据表明，TLR参与过敏进程的发生发展,并且连接过敏进程与卫生假说，有望成为治疗哮喘和过敏症的新靶标。全球支气管哮喘（哮喘）和变态反应（过敏症）的发病率呈逐年增高趋势。流行病学界提出了两个里程碑式理念,即卫生假说（hygienehypothesis）1和过敏进程（a
2、topicmarch）2z揭示了基因-免疫-环境交互作用在哮喘和过敏症中的致病模式。临床上，控制当前症状和降低远期风险是治疗哮喘的主要目标，而从上游调控疾病发生发展尤为关键。Toll样受体（Toll-likereceptors,TLR）是固有免疫系统一种重要的模式识别受体。现认为，TLR是连接固有免疫和适应性免疫的桥梁，在炎症和免疫性疾病中起重要作用。越来越多的研究表明，TLR及其信号通路在哮喘和过敏症中扮演重要角色，这为再认识过敏进程和卫生假说提供了新的视角。本文将就TLR生物学特性、TLR连接卫生假说和过敏进程的研究进展及临床意义作一综述。一、TLR的生物学特性人们在研究果蝇胚胎背腹侧极化
3、发育时，首次识别了Toll蛋白。1997年克隆了与果蝇Toll蛋白同源的第一个人类Toll蛋白(TLR4)30迄今，在哺乳动物中鉴定了14种TLR,广泛分布于免疫细胞和非免疫细胞的细胞膜和细胞核，包括上皮细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞和抗原递呈细胞等，彰显固有免疫系统TLR功能呈广泛性和复杂性。作为一种重要的模式识别受体(PRR),TLR既特异性识别多种病原微生物，激活机体固有免疫，也参与调控获得性免疫以及诱导免疫耐受。TLR属于I型跨膜蛋白，由胞外区、跨膜区、胞内区三个部分组成。胞外区通常由17-31个富含亮氨酸的重复序列构成,可识别外源性病原相关分子模式(PAMP)和内源性损伤相关分子模式
4、(DAMPX胞内区是含Toll-白细胞介素1受体的结构域(TIR),含有一种重要的接头蛋白髓细胞样分化标志88(MyD88),负责传导多种下游信号通路。业已证实，TLR的信号传导途径主要有两条，即MyD88依赖性信号通路和MyD88非依赖性信号通路。MyD88一旦被激活通过诱导白细胞介素受体相关激酶IRAK)自身磷酸化而产生磷酸化IRAKI和IRAK4,磷酸化IRAKI激活肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6),导致转录因子核因子KB(NF-B)和激活蛋白1(AP-I)的活化，启动多种炎性细胞因子如IL-LlL-6、IL-8、TNF-和趋化因子的转录表达。除了TLR3以外，其余TLR均可通过
5、MyD88通路传导信号。MyD88非依赖性信号通路：TLR3和TLR4可通过含诱导干扰素（INF-）接头蛋白的TIR域（TRlF）依赖途径，通过TRIF相关接头蛋白分子（TRAM）,导致干扰素调节因子3（IRF-3）磷酸化，促进抗炎因子如IFN-a、IFN-B、ILTO和TGF-等释放40二、TLR参与卫生假说卫生假说认为，随着个人卫生提高、家庭设施改善及家庭规模减小，过敏症（如花粉症、湿疹、哮喘）的发病率反而增高。换言之，在儿童早期通过接触病原微生物有助于降氐过敏性鼻炎、哮喘等过敏症的发病率。卫生假说问世之初，没有明确诠释该现象背后潜在的机制。早期变应原暴露可激活固有免疫，通过抗原递呈细胞摄
6、取和递呈抗原，激活CD4T细胞,驱动特应质个体形成Th2优势免疫。随后，接触变应原可刺激B细胞分泌IgE,募集肥大细胞和嗜酸粒细胞。相反，健康个体则形成ThI优势免疫。这印证婴幼儿期存在免疫编辑记忆差异，将对后期罹患过敏症产生影响，但发病机制亟待阐明。TLR为认识卫生假说的分子机制打开了新的视角，缘于TLR参与早期免疫编辑，可影响后期哮喘和过敏症的发生发展。实际上，胎儿期微生物组（包括病原微生物组和共生菌群）和TLR相互作用，即可影响个体后期对过敏症的易感性。多项出生队列研究发现，产前母亲接触富含微生物的环境,包括脂多糖（LPS）等，可显著降低儿童过敏症的发病率5L合并过敏症的孕妇在孕期服用乳
7、酸杆菌和双歧杆菌，产后2个月坚持母乳喂养，可降低婴儿湿疹患病率6o动物实验证明，雌鼠接触不动杆菌可保护子代免受气道过敏症的影响，但一旦敲除TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR9,该保护作用则完全丧失。这提示母体TLR信号通路向后代传递保护性作用。据此推测，在生命早期通过TLR接触微生物配体可诱导形成Thl优势免疫，似乎是控制后期过敏症发生发展的关键。采用配体LPS、Pam3Cys可分别活化TLR4和TLR2,促进树突状细胞激活,募集更多的CD8+T细胞,支气管肺泡灌洗液(BALF)IFN-Y水平增高，引起免疫应答向Thl型偏移,从而抑制哮喘的发生，主要表现为气道高反应性、黏液高分泌、
8、肺部Th2炎症、血清总IgE均降低70调节性T细胞(Treg细胞)也参与早期免疫编辑阶段。若出生时Treg细胞不能对微生物刺激产生免疫应答，可能会增加婴儿第一年发生过敏症的风险8o一项出生队列研究发现农村环境中牛奶暴露能够增加儿童Treg细胞数量，并且产生一种对过敏症发生发展起保护作用的表型，其中TLR2和TLR4信号通路参与调控Treg细胞发育和激活90遗传学研究也为TLR参与卫生假说进一步提供了佐证。除聚丝蛋白突变以外，参与微生物识别和下游信号传导的基因多态性使过敏症的遗传易感性增高。比如，TLR4基因多态性与哮喘患者临床表型和严重程度显著相关10r并影响宿主对环境中LPS的免疫应答。TL
9、R4D299G、A896G和T399I多态性均显示机体对LPS呈低反应性导致过敏症风险增加的表型。表达在巨噬细胞表面的各种TLR多样性与哮喘密切相关，不同表型可呈现易感性抑或保护性11o不过，也有研究未证实TLR4基因多态性与哮喘之间存在相关性12o这可能与研究对象、样本量大小、基因与环境交互作用等多重因素有关。显然，早期实施正确的免疫训练，关键在于机体识别抗原时所处的环境。若与外源性病原相关分子模式或内源性损伤相关分子模式一同被识别，机体很可能把这些抗原当作微生物来源的分子。正如卫生假说所述，不那么干净的环境和多样性的微生物配体，有助于激活TLR信号通路，调控Treg细胞发育及形成Thl型免
10、疫微环境，从而阻断过敏症发生发展。值得一提的是，生活于微生物多样性环境，有些个体易发生过敏症，而同样生活在城市化环境的人群并非皆发生过敏症。这或许与个体基因差异性表达有关，也映射了过敏症受多重因素影响。三、TLR与过敏进程关联哮喘是一种多基因参与、具有遗传易感性的慢性气道炎症性疾病，受遗传和环境双重因素影响。过敏进程认为，若在生命早期罹患特应性皮炎，后期更易发生食物过敏、过敏性鼻炎和哮喘等过敏症20多项流行病学调查显示，特应性皮炎是过敏进程的首发疾病，而且低龄、慢性持续性、重症特应性皮炎患儿后期更易出现其他过敏症130据报道，经皮肤接触变应原乳胶蛋白后，再经气道激发，能够诱导气道高反应性和黏液
11、高分泌140诚然，以过敏进程为契机，聚焦过敏事件序贯发生的临床特点，剖析过敏症早期发生的免疫学机制，或将为预测和防治哮喘等过敏症提供新途径15Jo皮肤是人体免疫器官之一，皮肤多种细胞表达TLR,包括角质形成细胞、朗格汉斯细胞、单核细胞、树突状细胞、T细胞、B细胞、肥大细胞、皮肤微血管内皮细胞以及成纤维细胞和脂肪细胞，参与皮肤抗微生物、伤口愈合和皮肤致瘤性炎症等多个分子机制16o过敏进程起始于皮肤，意味着皮肤细胞表达的TLR在病理生理中发挥重要作用。研究表明，皮肤微生物多态性和皮肤完整性在特应性皮炎发生发展中起重要作用。儿童早期缺乏接触有益微生物或可导致皮肤微生物菌群失调，比如表皮金黄色葡萄球菌
12、占比增高，其产物可破坏表皮屏障的完整性。一旦表皮屏障完整性遭到破坏，便可为病原体和变应原提供入侵位点，并为细菌超级抗原定植提供场所。于是，通过内源性损伤相关分子模式和外源性病原相关分子模式激活TLR,启动固有免疫应答，触发和维持异常的炎症免疫反应。当外源性抗原经皮损入侵激活TLR2和TLR3后，可刺激角质形成细胞分泌胸腺基质淋巴细胞生成素(thymicstromalIymphopoietin,TSLPTSLP是连接皮肤屏障固有免疫和Th2适应性免疫的重要中介17L方面JSLP通过激活树突状细胞，上调0X40L(CD252CD80和CD86的表达，促进初始型CD4T细胞(ThO)分化为Th2细胞
13、。另一方面，TSLP可直接作用于CD4+和CD8T细胞及Treg细胞，促进Th2细胞增殖活化。此外，TSLP还可激活肥大细胞、固有淋巴细胞、巨噬细胞等，协同IL-LTNF进一步分泌Th2细胞因子。一项前瞻性研究发现18,表皮TSLP蛋白表达可作为预测婴儿特应性皮炎发展的早期生物标志物。靶向TSLP有望成为治疗哮喘、过敏症和过敏进程的新靶标19,20JoTLR信号通路激活后是发挥保护作用还是促进过敏进程，取决于其分布位置和所处生命阶段。目前，对TLR4参与哮喘发病机制的剖析较为深入。TLR4亚细胞定位、配体数量、变应原致敏途径和方式以及TLR4基因多态性等，皆与哮喘的调控作用有关。譬如，造血细胞
14、TLR4参与变应原和吸入LPS所致的中性粒细胞炎症反应，而气道上皮细胞TLR4则参与吸入变应原介导的嗜酸粒细胞炎症反应210低剂量LPS暴露时卵清蛋白(OVA)诱导的哮喘小鼠肺组织表现为Th2优势免疫，以嗜酸粒细胞和中性粒细胞浸润为主,气道黏液高分泌。然而，中高剂量LPS暴露时，OVA哮喘小鼠反倒出现中性粒细胞浸润为主，气道黏液高分泌，并诱导Thl免疫应答21o在变应原经皮肤致敏产生过敏性哮喘模型中,TLR2、TLR3和TLR4活化，通过上调机体IFN-Y水平，引起免疫应答向Thl型偏移,从而发挥抑制性作用。研究发现，TLR2功能失调参与特应性皮炎发生发展。特应性皮炎患者外周血巨噬细胞和单核细
15、胞TLR2表达下调，配体刺激TLR2可产生较少的ThvThl7细胞因子(IL-6、IL-lsINF-xIL-12、IL-17和IL-22),但产生较多的Th2细胞因子IL-5。另有研究发现，特应性皮炎患者角质细胞TLR2表达减少，引起紧密连接蛋白1和抗菌肽基因表达下调，如B-防御素和抗菌肽。由此可见，TLR2表达失调可引起机体ThlTh2免疫失衡,Th2细胞因子(IL-4、IL-5和IL-13)分泌亢进，构建Th2优势免疫微环境，启动过敏进程中过敏性鼻炎和哮喘事件的序贯发生220四、靶向TLR治疗过敏症的策略作为连接固有免疫与适应性免疫的模式识别受体，TLR已成为研发预防和治疗性疫苗的靶点。与
16、传统佐剂相比，TLR激动剂更加有利于机体产生抗过敏性T细胞应答。以TLR作为佐剂，在过敏性鼻炎和哮喘的变应原免疫治疗中具有巨大的潜能。多种TLR激动剂治疗过敏症突飞猛进,其中TLR4和TLR9激动剂已进入临床试验，TLR2、TLR5和TLR7激动剂的体外研究和体内研究均显示强劲的抗过敏作用。1. TLR4激动剂：TLR4是第一个被识别的TLRo中国汉族人群TLR4基因多态性与哮喘的严重程度有关，但与易感性无关23oTLR4激动剂单磷酰脂质A(MonophosphoryllipidA,MPL)属于毒性较低的脂多糖衍生物，被广泛应用于肿瘤、感染等多种疾病的辅助治疗。体外研究显示，MPL通过上调IL
17、-10、IL-12和IFN-Y以及下调IL-5而发挥作用240体内研究证明，MPL可上调IgG水平并诱导Thl免疫25oTLR4激动剂的给药浓度是治疗的关键问题，因为在变应原致敏过程中，低剂量LPS促进Th2免疫，而高剂量LPS促进Thl免疫。改良变应原酪氨酸吸附物(mod讦iedallergentyrosineadsorbate,MATA)-MPL是一种将酪氨酸经过修饰的佐剂，既保持其免疫原性，又显著降氐潜在的全身致敏风险，现已进入草和豚草过敏症的临床试验阶段。在一项随机双盲安慰剂对照试验中，MATA-MPL治疗组的花粉季节症状显著减轻,并伴有变应原特异性IgG水平升高26o另一项花粉过敏症
18、的随机双盲安慰剂对照试验显示，与安慰剂组相比，治疗组患者的季节性症状评分降低13%,变应原特异性IgG、IgGLlgG4水平增高270随访已完成MPL变应原免疫治疗超过5年的患者，结果发现MPL变应原免疫治疗组综合症状用药评分较对照组显著下降，这意味着MPL作为佐剂可显著促进变应原免疫治疗疗效28L未来尚需深入探究MPL佐剂的长期效应,并开发用于哮喘辅助治疗的TLR4激动剂。2. TLR9激动剂：与哺乳动物DNA相比，TLR9的CpG二核甘酸水平较高，一系列CpG寡脱氧核昔酸(ODN)被用于探究TLR9受体的生物学功能。采用OVA致敏小鼠，给予TLR9激动剂CpG寡脱氧核甘酸，可通过减少IL-
19、4、IL-5、IL-13、IgE水平而抑制Th2免疫和气道炎症，并促进IFN-产生29L同样,在嶂螂诱导的过敏性哮喘模型的致敏过程中，CpG寡脱氧核甘酸联合给药可减轻气道嗜酸粒细胞炎症和气道高反应性，降低IL-5、IL-13、IgE水平，上调IL-10+Treg细胞和Thl应答30O数个TLR9激动剂已进入辅助免疫治疗的临床试验，阶段性数据显示其有很强的诱导Thl免疫的功能。在一项期随机双盲安慰剂对照试验中，将豚草花粉与一个硫代磷酸寡脱氧核糖核甘酸免疫刺激DNA序列结合，随后连续两个花粉季节观察长期临床疗效。结果发现经过6次季节前注射,治疗组患者在花粉季节的症状评分较安慰剂组显著降低，生活质量
20、也有所改善部分归因于治疗组豚草特异性IgE和IL-4+嗜碱性粒细胞减少31L在一项Ia期临床试验中，另一个TLR9激动剂QbGlO与屋尘螭结合后，展现良好的药物耐受性并诱导机体对变应原产生免疫耐受，在变应原暴露后，患者能持续38周无症状，而且变应原特异性IgG和IgE水平均升高320哮喘患者接受QbGlO注射后，停用类固醇药物,与安慰剂组相比，治疗组患者哮喘症状控制良好33L但是，在一项IIb期临床试验中,QbGlO被用于治疗过敏性哮喘，发现治疗组症状评分较安慰剂组无显著改善。尽管取得了一些有意义的临床数据，但TLR9激动剂治疗哮喘的有效性和安全性还需进一步证实。3. TLR2激动剂：TLR2
21、受体与TLRl或TLR6结合，以异二聚体的形式(TLR2/1和TLR2/6)分布于细胞膜表面。TLR2/1激动齐IJPam3Cys已被用于许多研究并得到相互矛盾的结果。例如，Pam3Cys具有诱导小鼠和人类Thl或Th2表型极化的作用34o总的来说，人体外研究和小鼠体内研究结果均显示,TLR21激动剂有免疫治疗佐剂的潜力。同Pam3Cys一样,TLR2/6激动剂巨噬细胞活化脂肽(macrophage-activatingIipopeptideof2kDa,MALP-2)也通过IFN-Y介导,弓|起Th2细胞因子表达下调。虽然在过去20年里，TLR2在呼吸系统疾病的研究尚停留在人体外研究或小鼠体
22、内研究，并有部分研究报道Th2过敏反应增强，但大部分研究的确证实Th2细胞因子下调、Thl细胞因子上调和Treg细胞增殖。TLR2激动剂OK-432具有治疗肿瘤的可行性，这为TLR2激动剂治疗过敏性鼻炎和哮喘提供了潜在途径35o4. TLR5激动剂：TLR5表达于免疫系统和非免疫系统的多种细胞,在维持肠道内环境稳定中发挥重要作用。TLR5能识别革兰阴性菌和革兰阳性菌的鞭毛蛋白。有研究分析了鞭毛蛋白和变应原的融合蛋白对人体过敏反应的调节能力36,证实鞭毛蛋白虽是过敏性气道疾病的加重因素，但与变应原的融合蛋白却可显著减少过敏反应，有望成为变应原免疫治疗的一种佐剂。5. TLR7激动剂：TLR7多态
23、性与哮喘和过敏症相关联。TLR7激动剂也可能成为变应原免疫治疗的佐剂。它能够削弱Th2免疫，增强Thl免疫并拮抗过敏反应37o咪嘤莫特和雷西莫特被应用于过敏性鼻炎和哮喘的体外和体内实验研究。GSK2245035是一种经鼻内给药的佐剂。随机双盲安慰剂对照试验显示，尽管GSK2245035会出现一些流感样症状，但20ng经鼻给药的耐受性良好，而且疗效持续时间不长38o另一个TLR7激动剂AZ12441970雾化吸入药物4周后，观察到系统性干扰素产生和流感样症状390进一步临床试验表明，尽管药物不良事件频率较高，但耐受性良好40O至于AZD8848随机对照试验，参与者每周1次经鼻给药，共持续8周,可显著抑制变应原诱导的迟发相哮喘反应。这些研究揭示TLR7激动剂或可以佐剂的方式治疗哮喘和过敏症。五、总结和展望卫生假说和过敏进程为再认识哮喘提供了新视角。基因-免疫-环境交互作用促进哮喘和过敏症的发生发展。作为固有免疫的模式识别受体，TLR构筑机体接触外界的第一道防线，介导了一条高度保守而古老的信号通路，是连接固有免疫和适应性免疫的桥梁。TLR将过敏进程与卫生假说有机联系起来。早期脱离过于洁净的环境，接触多样性微生物配体，有助于诱导机体形成保护性Thl免疫，保持皮肤屏障的完整性。因此，靶向TLR信号通路，有望为今后免疫治疗哮喘和过敏症乃至过敏进程带来了新的愿景。
