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1、2022蜡样透明带卵母细胞患者临床助孕结局分析(全文)摘要目的探讨蜡样透明带卵母细胞与正常形态卵母细胞临床助孕结局的差异。方法回顾性队列研究分析2015年1月至2019年12月期间在南京医科大学第一附属医院生殖医学中心q亍辅助生殖助孕的93个卵胞质内单精子注射(intracytoplasmicsperminjectionrICSI)周期，根据卵母细胞的形态和授精方式分为三组：正常形态卵母细胞组(A组，n=52),蜡样透明带卵母细胞常规ICSI组(B组，n=30);蜡样透明带卵母细胞补救ICSI组(C组，n=ll)。比较三组间的实验室和临床结局。结果三组的获卵率、正常受精率、临床妊娠率、种植率差
2、异均没有统计学意义(均P0.05)。A、B组的优质胚胎率62.50%(250/400学59.07%(114/193)均高于C组40.85%(29/71),差异有统计学意义(P=0.001,P=0.006)。A组的囊胚形成率64.78%(160/247)高于C组37.14%(13/35),差异有统计学意义(P=0.002)。另外，A组的流产率2.44%(1/41)低于B组和C组21.05%(4/19),P=0.031;44.44%(4/9),P=0.002,累积妊娠率82.69%(43/52)高于B组和C组56.67%(17/30),P=0.009;45.45%(5/11),P=0.014,差异
3、有统计学意义。结论蜡样透明带样的卵母细胞采用常规ICSI授精可获得与正常形态卵母细胞相当的优质胚胎率和囊胚形成率，但总体的临床结局仍低于正常形态卵母细胞。建议蜡样透明带的异常卵母细胞直接采用ICSl授精方式，可以获得较为理想的临床结局。【关健词】精子注射，细胞质内；胚胎发育；蜡样透明带卵母细胞；累积妊娠率在体外受精-胚胎移植(invitrofertilizationandembryotransfer,IVF-ET)周期治疗中,卵母细胞的质量与临床妊娠结局密切相关。正常形态的成熟卵母细胞应该为圆形，胞质均匀，颗粒均匀，卵间隙小，卵周隙内无杂质，第一极体形态正常，透明带形态正常。但刺激周期往往存在
4、一个或者多个的卵母细胞异常1。有学者认为，卵母细胞轻微的形态异常不会对结局产生不利影响2。也有研究认为部分卵母细胞形态异常，如滑面内质网聚集，胞质中央性粗颗粒区明显降低胚胎的发育潜力3。透明带是包裹卵母细胞的一个特殊结构，在常规受精过程中发挥着重要的作用，当精子与透明带结合，激发透明带一系列的生化反应，继而激发卵母细胞的应激反应，透明带变硬，阻隔其他精子的穿透，防止多精受精。透明带的异常可能会导致异常受精增加或者受精失败4。蜡样透明带是透明带形态学异常的一种，该种类型透明带的卵母细胞形态上观察可以发现无卵周隙，极体挤压严重，或看不到极体形态，行卵胞质内单精子注射(intracytoplasmi
5、csperminjection,ICSI)时透明带缺乏弹性，毫无阻力，如凝胶状，也称之为凝胶状透明带卵母细胞或者齿轮状透明带卵母细胞(图1)。目前关于蜡样透明带卵母细胞临床结局的研究报道并不多见，本研究的数据是分析蜡样透明带卵母细胞不同授精方式下的实验室参数与临床结局，同时与正常形态卵母细胞进行比较，更进一步分析蜡样透明带卵母细胞的最终临床结局，为蜡样透明带卵母细胞的授精方式选择提供参考。资料与方法一.研究对象回顾性队列研究分析2015年1月至2019年12月期间，在南京医科大学第一附属医院生殖医学中心行辅助助孕患者的蜡样透明带卵母细胞和正常形态卵母细胞的ICSl周期的临床资料。纳入标准：男女
6、双方染色体核型正常；常规促排卵方案；对照组正常形态卵母细胞ICSl周期与蜡样透明带卵母细胞为同一天取卵。排除标准：男方极度少、弱精，通过睾丸穿刺获得精子周期。根据卵母细胞的形态和授精方式分为三组，A组为正常形态卵母细胞组，B组为蜡样透明带卵母细胞常规ICSI组，C组为蜡样透明带卵母细胞IVF受精失败后补救ICSI组。本研究通过南京医科大学第一附属医院伦理委员会审批(2018-SR-063)。二.研究方法L促排卵方案及取卵：采用长方案、拮抗剂灵活方案及温和方案促排卵5o注射人绒毛膜促性腺激素(humanchorionicgonadotrophin,hCG,艾泽，德国默克公司；或者达菲林，天津益普
7、生公司)36h,经阴道后穹窿穿刺卵泡，获得的卵泡穿刺液于倒置显微镜下查找卵冠丘复合物，并快速转移至配子体外操作液中，随后转移至受精培养液，放置C02培养箱中继续培养。2 .ICSI操作方法：取卵后至少30min后去除颗粒细胞，去除颗粒细胞后的卵母细胞培养至少30min后方可行ICSI,常规情况下,扳机后(401)h行ICSI操作。将一条形态正常、经制动处理的精子吸入注射针，将卵母细胞用固定针固定，极体位于11-12点位置，于3点处注射针刺入透明带、卵细胞膜，回吸部分卵胞质，然后将回吸的胞质连同精子一起注入卵母细胞内，慢慢撤出注射针。3 .补救ICSI方法：IVF后46h在倒置显微镜下观察卵母细
8、胞第二极体排出的情况，如全部卵母细胞的第二极体均未排出或者30%的卵母细胞排出第二极体，则根据卵母细胞的形态和成熟度，行补救性ICSl,操作与常规ICSI一致。4 .卵裂期及囊胚评分：授精17-18h后观察到两个原核及两个极体即为正常受精，授精72h后根据卵裂期胚胎形态学评估标准评分6,三级及以上的胚胎视为可利用胚胎，囊胚评分采用Gardner评分系统，4CC以上的囊胚认为是可利用囊胚7。所用培养液均由美国Cook公司提供。5 透明带辅助孵化：采用激光在透明带灼烧的方式辅助孵化，激光灼烧点选择卵周隙较大的部位，卵裂胚削薄宽度7080m,尽量不将透明带打穿，囊胚在其处于皱缩状态行辅助孵化，可将透
9、明带打穿。新鲜移植周期，蜡样透明带胚胎常规行透明带辅助孵化。复苏移植周期，正常形态及蜡样透明带胚胎均在移植前行透明带辅助孵化。6 .内膜准备及妊娠结局判定：患者采用本中心常规人工周期或自然周期准备子宫内膜，排卵后第4日且内膜厚度8mm时，在B超引导下行胚胎移植，移植后黄体支持。移植后14d抽血检测，HH-hCG25U/L为生化妊娠，移植后4周见孕囊及胎心为临床妊娠8。7 .观察指标：获卵率二获得卵母细胞数/穿刺卵泡数XIO0%；MIl卵子率=Mll卵子数/获卵数XIO0%;正常受精率二正常受精卵母细胞数/ICSI卵母细胞数XIO0%；优质胚胎率二优质胚胎数/正常受精卵母细胞数X100%;囊胚形
10、成率=囊胚形成个数;囊胚培养胚胎数XloO%;移植胚胎率二移植胚胎数/移植周期数X100%；移植胚胎囊胚占比=移植囊胚数/总移植胚胎数XlO0%；临床妊娠率=临床妊娠周期数/移植周期数Xlo0%；种植率=孕囊数/移植胚胎数XIO0%；流产率=流产周期数/临床妊娠周期数100%;累积活产率=累积活产胎儿数/取卵周期数XloO%。三.统计学方法采用SPSS22.0统计软件进行统计学分析。计量资料符合正态分布，数据以均数标准差(s)表示，采用单因素方差分析进行比较。计数资料以百分率或构成比()表示，组间比较采用2检验。当理论数T5并且总样本量n40,用Pearson卡方检验，原发不孕比例及流产率中有
11、理论数Tl,不符合Pearson卡方检验，故采用Fisher确切概率法。三组间两两比较时，根据邦弗伦尼法校正a值。P0.05为差异有统计学意义。结果一,一般临床数据比较A组纳入52个取卵周期，B组纳入30个取卵周期,C组纳入11个取卵周期。B组和C组的不孕年限均大于A组，且B组与A组间的差异有统计学意义(P0.05)。详见表Ioi憎的修tm簧att较h4111AMurnc取1做S3SOIlRg-1年n1*t44329.436129.T3*3jM04401事”(年)537rS.I8tX403OOOfr1川“90JMI730)091(IOfIIOjOI0022.1MJ92131*12IJ02l00
12、.7M*AM4CMtl257j*t2.92IMJW01ruhjI4O4MI9IMH2.OH9l1tt0J0QpMMNMA*IOItW4,KHIROMk0321Ui扁W*I487Jo0.10.IS4cnaaIUlhMJO工8I3JOS73SO.?!0.4S1敏则时“054*1.91*sa137IJlOmim4t4M.oIU7.naSI4521161.36WI3to.mQB.、AfliIUt,MOJ内外HitQtb0.05),三组间获卵率差异有统计学意义(P=0.047),但两两比较时差异均无统计学意义(均P0.05)。A组和B组的优质胚胎率高于C组(2=11.71,P=0.0015(2=6.94
13、,P=0.006)A组的囊胚形成率高于C组(2=9.87,P=0.002),差异均有统计学意义，详见表2o表2的实绘室指标比较(%)项目AiUBfU(:组ffiPtfi取哪周IW数5230Il我卵率74.82(5()8/679)68.94(273/396)77.94(106/136)6.130.047MII卵率89.76(456/508186.45(23673)Z1.940.164正常受Mi率87.72(400/456)81.78(193/236)83.53(71/85)4.700.095优Mi胚就率62.50(250/400)59.07(114/193)40.850.05.与A纲比;示夕0.
14、05)。A组的流产率低于B组和C组(X2=5.89,P=0.031;2=14.47,P=0.002),累积妊娠率高于B组和C组(2=6.56,P=0.009;2=6.94,P=0.014),差异均有统计学意义。其中，B组和C组的差异无统计学意义，详见表3o表3一沏的临床结局比较(%)AfflCfflfrt。僮取卵同期数5230Il总移植周期数634222移植胚舱数825529移帧胚肪率1.30(82/63)1.31(55/42)132(29/22)0.010.994移植囊胚占比39.02(32/82)29.10(16/55)37.93(11/29)1310.471临床妊娠率65.08(41/6
15、3)45.24(19/42)40.91(9/22)5.930.052种植率53.66(44/82)38.18(21/55)31.03(9/29)5.800.055流产率2.44(1/41)21.05(4l9)a44.44(4/9)*11.950.001果根活产率82.69(43/52)56.67(17/30)*45.45(5/11),9.660.008汴:A组示F需形态卵母细胞组:B组示蜡样透叨带卵q细胞常MeicSlnhC组示蜡样透明带卵出细也八F受特失败后讣敕I(N制；示F0.05.与Aftl比;括号内东阳性数/总数讨论本研究显示，蜡样透明带卵母细胞采用常规ICSI授精可获得与正常形态卵子
16、相当的优质胚胎率和囊胚形成率，但总体的临床结局仍低于正常形态卵子。建议胚胎学家加强卵子形态学评估训练,及时发现卵母细胞异常并采用ICSI授精，可以获得较为理想的临床结局。女方的临床背景（年龄、不孕年限、BML原发继发不孕和基础激素情况）及促排卵的过程都与卵母细胞的质量密切相关。在本研究中，选择与蜡样透明带卵母细胞同期取卵的正常卵母细胞ICSI周期作为对照,可消除不同批号的药物、试剂及操作人员熟练程度差异对最终结局的影响。蜡样透明带卵母细胞常规ICSI组的不孕年限大于正常形态卵母细胞ICSI组,三组的一般临床数据与促排卵用药情况基本一致。本研究的数据显示,去拆除颗粒细胞后,蜡样透明带卵母细胞常规
17、ICSI组及正常形态卵母细胞组的Mn卵子率差异无统计学意义，蜡样透明带卵母细胞补救ICSl组因卵母细胞体外培养时间延长,故未统计其MIl卵子率与其他两组的差异。蜡样透明带卵母细胞常规ICSI组的正常受精率低于正常形态卵母细胞组,而补救ICSI组的正常受精率却稍高于蜡样透明带卵子常规ICSI组，这与先前文献报道的结论一致，延迟卵母细胞的ICSI时间，尤其是质量偏差的卵母细胞，在一定情况下能够提高受精率9。三组间的正常受精率虽然存在差异趋势，但差异没有统计学意义,可能是ICSl技术减弱了透明带在卵母细胞受精过程中的作用，同时也推测这可能是我们的样本量偏少所致。正常形态卵母细胞及蜡样透明带卵母细胞的
18、常规ICSI周期的优质胚胎率及囊胚形成率均高于蜡样透明带卵母细胞补救ICSI补救ICSI作为卵母细胞受精失败后的补救措施，在一定程度上降低了患者在该取卵周期无可移植胚胎从而周期取消的风险，但同时由于可能错过了最佳的受精窗口而导致胚胎质量往往偏差，这一结果已被文献证实10。也有相似文献提示，蜡样透明带卵母细胞建议使用ICSI方式授精11。但鉴于此类卵母细胞往往在取卵过程中才能被发现，蜡样透明带卵母细胞的放射冠结构不明显甚至缺乏，而经验的缺乏可能会导致在捡卵过程中不能第一时间辨认蜡样透明带卵母细胞而行IVF授精，只能剥除颗粒细胞后再行补救ICSI。虽然蜡样透明带卵母细胞组常规ICSI与正常形态卵母
19、细胞的优质胚胎率及囊胚形成率差异没有统计学意义，但累积妊娠率均明显低于正常形态卵母细胞组，流产率高于正常卵母细胞组，这说明虽然蜡样透明带卵母细胞受精后也可正常发育形成优质胚胎及囊胚，但其发育潜力却是明显降低的，也提示透明带异常对卵母细胞发育潜力的评估具有负面的影响。同时也说明我们日常采用形态学评估并不能准确预测胚胎的真正发育潜力12。另外，胚胎在发育过程中需要突破透明带才能在子宫内膜上着床妊娠，蜡样透明带卵母细胞的电子显微镜图显示透明带结构已发生严重异常。Sousa等13研究通过透射电子显微镜发现蜡样透明带卵母细胞的显微结构较正常卵母细胞发生明显改变：透明带结构无分层，基本上无卵周间隙且微绒毛
20、缺失，卵膜下皮质颗粒明显减少，这也能进一步解释蜡样透明带卵母细胞的临床结局较差的可能原因。本研究的最大亮点是追踪到每个取卵周期对应每次移植周期，并统计了该次促排卵周期的最终结局，即每次取卵的累积妊娠率，这为蜡样透明带卵母细胞促排卵周期的成功率评估有重要的参考意义。本研究的不足之处在于仅仅统计了蜡样透明带卵母细胞周期的实验室数据和临床结果，且部分结果（如临床妊娠率、种植率）显示三组有明显的差异趋势，但该差异无统计学意义，这极大可能是因为蜡样透明带卵子并不常见，病例数偏少所致，另外对其结构特点及形成机制未做深入研究，这也是我们后期的研究切入点，需要进一步深入研究来揭开蜡样透明带卵母细胞的神秘面纱。综上所述，对于辅助生殖技术治疗周期中出现的蜡样透明带卵母细胞，我们要尽早发现，并实施ICSl授精，可以获得较为理想的临床妊娠结局。
