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1、裸花紫珠提取物诱导L1210细胞凋亡作用的研究林海易博2(1、海南省妇女儿童医学中心2、解放军928医院).摘要：目的：探讨裸花紫珠(CalliCarPanUdifIOra)体外抗白血病作用及机制，提供裸花紫珠的开发利用的理论依据。方法：第一步用乙醇对裸花紫珠进行提取得到再提物(EtOH-extract),第二步用大孔吸附树脂处理EtOH-extract得到终产物：乙醇洗脱物(EtOH-elution)和水洗脱物(EtH2elution)o实脸分：高、中、低3个剂量组，由(EtOH-elution)和(EtH20-elution)分别配制而成。实险组和对照组L1210细胞培养后，用MTT染色，
2、测定吸光度值计算得到生长抑制率。EtOH-elution.EtH20-elution诱导L1210细胞凋亡作用采用台盼蓝拒染法及Hoechst33258/PI双染色，激光共聚焦显微镜观察。结果：EtOH-elUtion、EtHzO-ClUtiOn能明显地抑制L1210细胞增殖，并能诱导细胞凋亡。结论：诱导肿瘤细胞凋亡是裸花紫珠抗肿瘤作用的重要机制之一。关键词：裸花紫珠：提取物：L1210细胞；湖亡中图分类号：文献标识码：A文章编号：InductiveeffectofCallicarpanudifloraonL1210cellapoptosisHaiLIN,YlBo(DepartmentofPh
3、amuicytNo187HospitalofPLA,Haikou571159,China)AbstractzAIM:Toexploretheanti-leukemiaeffectandmechanismofCallicarpanudiflorainvitro,andprovideatheoreticalbasisforthedevelopmentandutilizationofCallicarpanudiflora.Method:ThefirststepistoextracttheEtOH-extractwithethanolfromCallicarpanudiflora,andtheseco
4、ndstepistotreatEtOH-extractwithamacroporousresintoobtainthefinalproduct:Ethanoleluate(EtOH-elution)andWatereluate(EtHiO-eluiion).Experimentalgrouping:high,medium,andlowdosegroups,whicharemadeupofEtOH-elutionandEtH2O-elution.ThegrowthinhibitoryeffectofmouselymphocyticleukemiaL1210cellswasdeteninedbyM
5、TTmethod.TheeffectsofEtOH-elutionandEtH2O-elutiononL1210cellapoptosiswereobservedbylaserconfocalmicroscopewithtrj,panblueexclusionmethodandHoechst33258/PIdoublestaining.Results:EtOH-elutionandEtH2O-elutioncansignificantlyinhibittheproliferationandinduceapoptosisofL1210cells.Conclusion:Inducingtumorc
6、ellapoptosisisoneoftheimportantmechanismsofCallicarpanudiflora,santi-tumoreffect.Kywords:Callicarpanudiflora;L1210cellLine;EtOH-elution;EtH2O-elution;inductionofdpoptosisChinese：Documentcode:AArticleID:裸花紫珠(CalliCarPanUdifIOraHoOk)属于马鞭草科紫珠属，又称为止血草，紫珠草等。在海南，广东，广西等省区都有生长，具有很高的药用价值，是海南地道的植物药。裸花紫珠具有多种药用
7、价值，在治疗化脓性炎症,妇科疾病，呼吸道和胃肠道出血,外伤出血基金项目海南省中药现代化专项基金(zy201328);作者简介：1、林海(1974),男，贵州贵阳人，硕士研究生,主要从事肿瘤发病机制及药物干预方面的研究。电话：，E-MAIL：.2、通讯作者：易博，副主任药师，主要研究中药现代化及医院药学，Tel:(0898),Fax(0898),Emil:.等方面都有很好的疗效3L,随着南药的开发利用，野生裸花紫珠资源逐渐减少，为满足药用需求进行人工培植。海南有许多大型栽培和种植基地，特别五指山种植的裸花紫珠最优质。裸花紫珠主要是以地面部分干燥后入药叫主要的药用活性成分为苯丙素类、黄酮类、三菇类
8、、二菇类等网。有报道，裸花紫珠具有抗癌活性，乙醇提取物对慢性白血病骨髓瘤K562细胞具有抑制作用“叫不过，抗癌活性的机理研究较少。本文通过对（EtHzO-elution）和（ElOH-elution）诱导L1210细胞凋亡作用的观察，旨在探寻裸花紫珠抗癌作用的机制。1 .仪器与试药1.1 细胞株：小鼠源淋巴白血病L1210细胞株（购自中科院上海生命科学研究院细胞资源中心）。1.2 试药：裸花紫珠：产于海南五指山，取其地面整株风干，经深圳市中科院仙湖植物园鉴定合格后留用；HP-20大孔吸附树脂：三菱化学集团制造。1.3 样品制备：乙醇提取物（浸膏）：称取LO千克风干留存的裸花紫珠进行粉碎，加入乙
9、醇（70%）70C水浴中回流提取1小时。共提取3次，并后提取液，过滤。滤液用旋转蒸发器减压浓缩,去掉大部分的乙醇和水，得到乙醇提取物（EtOH-extract125.0克，浸膏状物）。终产物EtH20-elution和EtOH-elution（浸膏）制备：取80.0克EtoH-extract浸膏，用蒸储水溶解后大孔吸附树脂柱处理，依次用3倍柱体积水和95%乙醇进行洗脱，减压浓缩（旋转蒸发器中），得到终产物：Et0-elution浸膏28.0克和EtoH-elution浸育48.0克，冰箱中冷冻干燥保存。试液配置：试验前一次性取10.Og终产物溶解于DMSO-第麻油（1:1比例）中，配成0.5g
10、ml的储备液。每个药物浓度组由储备液加入不同体积的0.5%CMC-Na进行稀释得到。2 .方法与结果2.1 细胞培养RPMlI640培养液：含10%灭活（56C,30min）小牛血清、NaHC032.0gL青霉素100UmL1链霉素100UmL,o从液氮罐中取出保存的L1210细胞,解冻,加入RPMII640培养液中，培养箱内保持37、5%C02条件下进行培养。2.2药物对L1210细胞增殖抑制作用在培养箱内将L1210细胞于培养至对数生长期，取出细胞，加培养液配制为IXlo个mL的细胞悬液，用加样枪加样，每孔取200HL细胞液，接种于96孔板。实验分组：空白对照组：加培养液20uL；溶剂对照
11、组：加入溶剂20HL（DMSO-毒麻油+0.5%CMC-Na）：实验组：分高、中、低浓度三组药物：EtOH-elution:25mgmLl,50mgmL1,100mgmL,;EtHaO-elution：25mgmL,50mgmLl,100mgmL1o每个药物浓度设定3复管，加药液20uL各组在相同条件下于培养箱内同时培养24、48、72h,加Mn（浓度为5mgmL1）入96孔板，每孔20UL,继续培养4h,取出，倾入小离心管，以IOoonnP离心5分钟，上清液弃掉，沉淀中加150ULDMSO,吹打震荡使结晶充分溶解（约IOnIin）,将酶标仪波长调整至550nm,测定每孔的OD值。结果取3复管
12、平均值计算:抑制率=（I-OD药/0D对）D100%。MTT测定结果显示:EtH20-elution和EtOH-elution对L1210细胞增殖抑制作用呈时间-剂量依赖性。（表1）表LEtH20-elution和EtOH-elution对L1210细胞增殖抑制HionofL1210growthbydrgs药物剂量_(mgL1)细胞增殖抑制（%）24h48h72h对照组0.002.130.002.150.001.97EtOH-elution253.641.647.571.5211.202.455017.702.31*22.924.05*20.742.1T10029.013.5735.92+5.
13、53”44.895.81EtH2O-elution252.192.138.102.554.54+1.195013.87+3.04*18.123.95*10.673.56*10025.184.Ir30.065.2629.754.19”注：切0.05,*p50mgmL,100mgmL-1；EtHaO-elution：25mgmLl,50mgmLl,100mgInLL步骤：接种好的24孔板于培养箱内培养12、24、48、72h（4个时相点），加入Hoechst33258（终浓度为lugml?）,孵育10min（37避光）。PBS冲洗，离心，弃上清，除去HoeChSt33258。加入Pl染液（浓度为1
14、:2.5）,染色15min（4避光）。PBS冲洗，离心，弃上清，除去Ph取细胞沉淀，涂片，在激光共聚焦显微镜下观察（波长352nm和488nm）o凋亡率册）=100个细胞中的凋亡细胞数。结果：Hoechst33258和PI都是DNA染料。其中Hoechst33258为水溶性，能够大量进入凋亡细胞，在352nm波长下激发蓝色荧光；而Pl染料能够大量进入死亡细胞，在488nm波长下激发红色荧光。因此，激光共聚焦显微镜下，凋亡细胞呈强烈的蓝色，死亡细胞呈强烈的荧光，而正常细胞对两种染料摄取量都少，故呈现低蓝色。EtH0-elution和EtOH-elution都能诱导L1210细胞凋亡，凋亡率与药物
15、作用呈时间-剂量依赖性。（表2、图1、图2、图3、图4、图5）表2.Hoechst33258/PI双染色，激光共聚焦观察细胞凋亡情况Tab-2.TheL1210cellsapoptosisbyHoechst33258/PIbi-Stain药物剂量_(mgL1)凋亡率（%）12h24h48h72h空白对照6.51.120.62.139.03.061.06.3EtOH-elution257.12.122.33.845.04.268.32.2508.82.226.74.8*51.05.T78.3+3.5”1008.91.527.65.2*52.06.37*88.3+4.2”EtH2O-elution
16、257.32.121.04.244.0+4.466.33.9508.12.625.05.6,50.07.6*81.32.61008.52.327.5+3.T51.06.587.33.8注：切0.05,*/K.lVS空白对照EtoHelution组凋亡率图1EtOH-elution组凋亡率EtHzdeIution组凋亡率口生白对， 2SB 50OlOO图2EtH20-elution组凋亡率图3、培养48小时（400倍）空白对照组细胞凋亡情况（蓝色：凋亡细胞；红色：死亡细胞：浅蓝色：正常细胞）Fig-1.Negativecontrolgroupfor48h(400)(blue：apoptosisc
17、ells；red：deadcells；lightblue：normalcells)图4、EloH-elution作用48小时细胞凋亡情况(400倍)(蓝色：凋亡细胞；红色：死亡细胞；浅蓝色：正常细胞)Fig-2.TheL1210cellsapoptosistreatedwith50mgmLEtoH-elutionfor48h,(400)(blue：apoptosiscells；red：deadcells；lightblue：normalcells)图5、EtH2-elution作用48小时细胞凋亡情况(400倍)(蓝色：凋亡细胞；红色：死亡细胞；浅蓝色：正常细胞)Fig-3.TheL1210c
18、ellsapoptosistreatedwith50mgmLEtOH-elutionfor48h,(400)(blue：apoptosiscells；red：deadcells；lightblue：normalcells)3讨论传统化疗药物常有严重的毒副作用,近年来，天然药、中药及其组份的抗肿瘤作用有越来越多的报道，具有广阔的前景。裸花紫珠从平地到1200米的海拔都可以生长，常常在路旁，山谷，溪流或灌木广泛的分布，海南、广东、广西等省是裸花紫珠生长分布较多的区域在海南，尤其是定安、僻州，澄迈和白沙、昌江，东方，三亚，陵水，保亭和琼中等地产量极高，其中五指山的裸花紫珠质量最好。裸花紫珠在海南的丰
19、富资源为开发利用提供了良好的前景。裸花紫珠植物具有悠久的药用历史，其作用广泛而且疗效显着。研究表明，裸花紫珠含有多种化学成分，黄酮类，菇类，挥发油，酚戒等都具有良好的药理活性3。裸花紫珠在抗炎及抗菌、止血等方面表现良好的药理活性。目前研究已经发现，裸花紫珠提取物还具有良好的抗肿瘤活性。Mei(H等体外实验研究表明，裸花紫珠提取物对慢性白血病骨髓K562细胞系具有很好的抑制效果。本研究的裸花紫珠采于海南省五指山，干燥，粉碎之后，将醇提取物通过大孔吸附树脂处理得到水洗脱液和乙醇洗脱物，制备成试验药物。本研究研究发现，裸花紫珠乙醇洗脱物在体外能够很好的抑制L1210细胞的增殖，抑制作用与剂量-时间呈
20、很好的相关性。进一步的试验发现，裸花紫珠乙醇洗脱物作用L1210细胞一定时间后台盼蓝染色拒染，倒置显微镜下观察可见明显的凋亡细胞：细胞膜完好,细胞体积变小,细胞形态发生改变,有膜包小体。进一步通过HoeChSt33258/PI双染色激光共聚焦显微镜观察，证实裸花紫珠乙醇洗脱物具有诱导L1210细胞凋亡的作用。凋亡诱导作用呈时间-剂量依赖性。凋亡和坏死皿是细胞死亡的两种不同的方式。研究表明，细胞凋亡皓多细胞生物的重要自稳机制之一。凋亡是细胞固有的生理性的死亡机制，在内源性或外源性的刺激下都可发生，主动的调节细胞生长与消亡。目前的研究认为，白血病的发病机制是由于细胞的生长、分化及凋亡异常导致细胞自
21、稳机制失衡，凋亡受抑，从而使异常细胞大量堆积，耐药细胞往往表现更为明显。本实验仅初步探讨了EtOH-extract在体外的抗肿瘤机制，得到结论是，诱导L1210细胞凋亡是EtOH-extract抗肿瘤作用的机制之一，还不够全面，而体内的作用机制更不清楚，其抗肿瘤作用的分子机制还有待于进一步研究。弁考文献11张绮玲,庞玉新,杨全,于福来,王凯,李伟,谷陟新,范佐旺,张文晴.裸花紫珠的本草考证J.广东药学院学报,2014,30(05):667-671.2广东植物研究所.海南植物志(第4卷)M北京：科学出版社,1977:5313杨子明，谷陟欣,颜小捷，等.裸花紫珠抗炎活性研究J.时珍国医国药，201
22、5,26(11)：2620-2622.4邹薇，姜华珍.裸花紫珠胶囊辅助治疗不规则阴道出血临床观察J.中国中医药现代远程教育，2019,17(19)：66-685易博，张旻，林海等.黎药裸花紫珠在小鼠体内止血活性部位的研究J药学实践杂志,2015,33(3):235-241.6黄梅,陈振星,于福来,谭湘杰,谢小丽,庞玉新,张影波,李伟.海南岛裸花紫珠种质资源调查报告J.中国现代中药,2017,19(12):1717-1721.7董琳，王勇，陈英，刘明生，魏娜，张小坡.黎药-裸花紫珠叶的生药学研究J.齐齐哈尔医学院学报,2014,35(15):2187-2188.8易博，林海，张旻等.裸花紫珠化学
23、成分研究J.解放军药学学报，2016,32(2)：115-119.9高秀丽，程萍，刘杰麟.紫珠果实提取成分对Hep-2细胞株的抑制作用J.贵阳医学院学报，2001,26(6):523.10 MeiWL,HanZ,CuiIlBtetal.AnewcytotoxiciridoidfromCallicarpanudifloraJ.NatProdRes,2010,24(10):899.11 丁强.中草药及有效成分抑制肿瘤作用的研究进展J,时珍国医国药,2006,17(9):1788-1790.12李梦，张小波，景志贤，于福来，黄胜，汪姐，康利平，王凌.裸花紫珠分布区划研究J.中国中药杂志,2020,45(15):3642-3650.13易博，林海，张旻，冯世秀，徐文彤，代瑞甫.裸花紫珠化学成分研究J解放军药学学报,2016,32(02):115-119.14马向华,马超英.中药诱导肿瘤细胞凋亡的研究进展J.时珍国医国药,2012,23(03):732-733.15齐伟，徐扬，邱实.细胞凋亡与肿瘤微环境作用的研究进展J.医学综述,2017,23(22):44334437+4442.6郭燕子,符健.肿瘤细胞凋亡及常用检测方法J.中国热带医学,2017,17(04):413-417.
