第三章大肠杆菌基因工程3.ppt

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1、基因工程 Genetic Engineering,第三章 大肠杆菌基因工程,Escherichia coli（SEM，14000）,四、工程菌构建、分析、发酵与产物分离纯化,三、工程菌构建策略,二、大肠杆菌表达系统高效表达原理,一、大肠杆菌表达（生产）系统的优缺点,五、利用大肠杆菌系统生产重组蛋白案例,第三章 大肠杆菌基因工程,工程菌构建发酵工艺研究分离纯化工艺研究,四、工程菌构建、发酵与产物分离纯化,工程菌构建研究内容与技术路线,目的蛋白分析,表达载体与宿主菌株选择,目的基因的获得与优化,表达载体构建与分析,转化与表达筛选,工程菌稳定性分析,表达产物确证,工程菌菌种保存,1、目的蛋白分析：糖

2、基化？难表达？难复性？药用？1)理化特性(www.expasy.org)*分子大小：5KD、100KD难表达（融合表达、截短表达）*氨基酸组成：Cys、Pro多的难表达（用真核系统）*疏水性：疏水性强的难表达（截短表达、用真核系统）2)生物学特性：膜蛋白难表达（截短表达、用真核系统）,工程菌构建主要研究内容,3)用途药用：安全性、产量、成本（包涵体、独立表达）工业用：产量、成本（包涵体、独立表达）研究用：迅速获得活性产品为首要考虑（可溶、融合表达）,工程菌构建主要研究内容,2、选择表达载体与宿主菌株：1）表达载体选择 启动子、标签、标记基因、拷贝数等。需要可溶表达时采用弱启动子，T7启动子最强

3、，PL/PR热激诱导不宜工业化。从蛋白特性、用途、发酵和分离纯化工艺考虑标签。药用避免氨苄青霉素，用卡拉霉素。4）宿主菌：符合表达要求（T7 RNA酶溶源？可溶？稀有密码tRNA？），来源与遗传背景清楚，资料翔实。,工程菌构建主要研究内容,3、目的基因获得、分析与优化 克隆、合成、索要？,工程菌构建主要研究内容,翻译起始位点与终止密码子：头尾不要缺，中间不能断GC含量：70%时表达水平低二级结构：mRNA 二级结构抑制翻译的起始或终止。基因或者蛋白的大小：一般说来小于 5kD 或者大于 100kD 的蛋白都是难以表达的。前者融合表达，后者截取表达（如抗原用途，选抗原性强、好表达区段）。疏水性：

4、疏水性强的、特别是膜蛋白难表达。截取表达。N端和C端稳定性：人为突变末端残基。,4、表达载体构建与分析1）根据选定载体物理图和基因特点设计与构建 PCR扩增目的基因：*引物中引入适当的酶切位点，避免基因内部位点。*是否需要目的基因带入ATG和TAA？是否要对框？2）表达载体酶切分析：双酶切、多酶切图谱分析3）目的基因序列分析：目的基因或表达盒序列分析,工程菌构建主要研究内容,pET21a质粒物理图谱,pET21a质粒多克隆位点与表达盒,pET32a质粒物理图谱,pET32a质粒多克隆位点与表达盒,M 1 2 3 4,目的基因：VL-,表达载体：pET32aM：Maker，1kb lader1：

5、PCR产物，引物含NcoI、HindIII 2：HindIII单酶切pET32a质粒3：NcoI-HindIII双酶切重组子4：HindIII单酶切重组子,pET32a-VL-酶切鉴定,5、转化与表达筛选 1）转化选定的工程菌宿主株（不同于克隆宿主菌！）2）表达筛选：以表达水平（%）为指标。表达水平（%）=目的产物占总蛋白的百 分数 测定方法：SDS-PAGE+凝胶扫描分析,工程菌构建主要研究内容,6、表达产物确证 1）基本要求：SDS-PAGE+Western-Blot 2）特殊要求（如基因工程药物）：A、结构：末端顺序（N-端15个/C端3个）、氨基 酸组成、肽图等 B、理化特性：分子量（

6、SDS-PAGE、质谱）、等电点、紫外特征吸收峰等 C、生物学活性,工程菌构建主要内容,基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制,改善工程菌不稳定性的策略,大肠杆菌工程菌的不稳定性,工程菌遗传稳定性分析,7、工程菌遗传稳定性分析,工程菌遗传不稳定性的表现形式,结构不稳定性,重组DNA分子上某一区域发生缺失、重排、修饰，导致其表观生物学功能的丧失（不表达、产物结构改变）,分配不稳定性（主要）,整个重组DNA分子从受体细胞中逃逸（curing）。导致表达水平下降。,重组质粒的逃逸：,工程菌部分细胞因质粒丢失而不再携带重组质粒的现象。重组质粒的宏观逃逸率：工程菌培养液中丢失质粒的细胞占细胞总数的百分比。宏

7、观逃逸率（%）=,非选择性平板菌落数-选择性平板菌落数,非选择性平板菌落数,100,关闭质粒DNA合成途径，启动降解程序,重组质粒逃逸的原因,环境因素诱导的重组质粒渗漏高温、表面活性剂（SDS）、药物（利福平）、染料（吖啶）,目的基因高效表达诱导宿主细胞产生应激反应,目的基因表达盒“转录过头”，影响Ori区域。,目的基因本底表达产物引起的毒性反应,抗性标记基因过表达，抗生素消耗过快。,重组质粒结构不稳定性的产生原因,宿主细胞中的修饰性酶系对外源重组DNA分子的破坏,环境因素诱导的突变,宿主细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排,改善基因工程菌不稳定性的策略,1、改进载体-宿主系统,选择性

8、地杀死无质粒细胞如敲除宿主基因组致死性基因（如ssb基因，缺失无法DNA复制），并将其改由表达载体提供,正确设置载体上的多克隆位点，避免DNA片段插在稳定区内,选择特定质粒最适宿主菌株,使用可控型复制子（扩增与表达诱导同步),改善基因工程菌不稳定性的策略,2、施加选择压力,根据载体上的抗药性标记，向培养系统中添加相应的抗生素,药物和食品生产时不宜使用抗生素,采用营养缺陷型宿主菌，载体含营养标记，培养基不含该营,养组份,改善基因工程菌不稳定性的策略,3、采用严紧调控型载体系统，减少本底表达造成的不稳定,4、优化工程菌的培养工艺,培养基组成：限制培养基比丰富培养基更有利于稳定,培养温度：较低的培养

9、温度有利于重组质粒的稳定,在非选择条件下连续传代数代后，对工程菌重组质粒存在状况、结构完整性和功能完整性进行分析：A、存在状况：宏观逃逸率 B、结构完整性：酶切图谱分析、序列分析 C、功能完整性：表达产物免疫特异性（western blotting)表达水平（%）,工程菌遗传稳定性分析,1、原始菌种保存：实验室构建而来。冻干、-70保存。表达载体（质粒）和宿主菌分别冻存更稳定。2、主细胞库（master cell bank,MCB）：由原始菌种单一克隆一次培养与分装而来，供工作细胞库制备。冻干、-70保存。3、工作细胞库（working cell bank,WCB）:由主细胞库单个最小包装甘油

10、种培养与分装而来，供生产用。甘油种，-70保存。,8、工程菌菌种保存（三级种子库）,工程菌生长与表达主要影响因素 工程菌摇瓶水平生长与表达试验 工程菌工业发酵工艺研究,工程菌发酵工艺研究,1、培养基2、菌龄与接种量3、pH值、温度与溶解氧4、诱导时机与收菌时机,工程菌生长与表达主要影响因素,工程菌生长曲线与表达曲线分析,生长曲线 纵坐标：生物量（细胞密度OD600、干重/体积、湿重/体积）横坐标：培养时间（小时）时期：停滞期、加速期、对数期、减速期、平台期、衰减期表达曲线 纵坐标：表达水平（%）、活性单位/体积 横坐标：培养时间（小时）,1、培养基 影响菌体生长、质粒稳定性、表达水平、产物可溶

11、性等 碳源：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等 应避免外源基因表达的“葡萄糖效应”。氮源：有机氮：酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆 无机氮：氨水、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵等 其他：无机盐、微量元素维生素、生物素等,工程菌生长与表达主要影响因素,2、菌龄与接种量菌龄：自接种起培养的时间（小时）影响停滞期、质粒宏观逃逸率接种量：是指接入的种子液体积占培养液体积的百分比 接种量过小：延长菌体停滞期，质粒宏观逃逸率高 接种量过大：菌体生长过快，代谢产物积累过多，抑制后 期菌体的生长，降低表达水平。,3、pH值、温度与溶解氧 pH值：影响生长速度、表达水平和产物可溶性。生长最适pH范围在6.8-7

12、.4，表达最适pH为6.0-6.5 温度：影响生长速度、表达水平和产物可溶性。生长最适37，较低温度利于可溶性表达。溶解氧：影响生长速度和表达水平,4、诱导时机与收菌时机 诱导时机：过早影响生物量、过晚影响表达水平 一般在生长曲线对数中期或对数后期进行诱导 收菌时机：过早影响表达水平、过晚影响产物稳定 性、可溶性、并造成浪费。一般在表达曲线平台期（诱导后3-4小时）收菌,主要研究参数：培养基、接种量、pH值、温度、诱导与收菌时机等主要观察指标 表达水平（%）、生物量、表达产物积累（包涵体形成）情况、质粒宏观逃逸率等结果：生长曲线与表达曲线,工程菌摇瓶水平生长与表达试验,基本要求：高表达、高生物

13、量、便于放大、低成本重点问题：1）质粒稳定性问题2）表达与生长的矛盾问题3）发酵方式问题：分批式or流加式发酵？常规发酵or高密度发酵？,工程菌发酵工艺基本要求与重点问题：,工程菌工业发酵工艺研究,工程菌工业发酵工艺流程,甘油种,活化试管/摇瓶,放大/种子罐,发酵/发酵罐,工程菌发酵工艺流程,1、菌种活化：参数：培养基、温度、培养时间（菌龄）指标：菌体浓度（OD600）、质粒宏观逃逸率2、放大培养（种子液制备）：参数：菌龄、接种量、培养基、温度、溶氧、搅 拌速度、转接时机（菌龄）、放大级数 指标：菌体浓度（OD600）、质粒宏观逃逸率 结果：生长曲线,工程菌发酵工艺研究主要内容,3、发酵（放大

14、培养与表达）：参数：种子液菌龄、接种量、培养基、温度、溶氧、搅 拌速度、诱导时机、收菌时机 指标：菌体浓度、表达水平、质粒宏观逃逸率 结果：生长曲线、表达曲线,工程菌发酵工艺研究主要内容,4、发酵方式：1）批式发酵：较常用，高表达、但菌体量较少。2）流加发酵：较常用，主要补充碳源，菌体量大、表达 水平下降，碳源流加时机和速度是关键。*高密度发酵：无机盐介质，通过碳源限制和流加实现 高密度发酵。3）连续发酵：少用，高表达、高总生物量、难控制。,工程菌发酵工艺研究主要内容,基因工程发酵,表达产物分离纯化工艺研究,分离纯化工艺研究的目的、任务和要求分离纯化工艺设计原则粗提工艺精纯工艺*精纯主要任务*

15、分离纯化总策略*色谱技术为基础的精纯工艺,分离纯化工艺研究的目的、任务和要求,目的：建立高效、便于规模放大和质控的表达产物分离 纯化工艺任务：1、建立粗提工艺：从菌体或培养液中获取目的产物，包涵体形式表达的尚包括变性和复性处理。2、建立精纯工艺：去除蛋白质和非蛋白质类杂质，使纯度达到指定要求。3、建立工艺过程质控体系要求：高活性、高得率、高纯度、低费用,表达产物分离纯化原则,要建立一个方便灵敏的蛋白检测方法，以估价每一步的提纯程度；分离步骤要尽可能少，每一步便于工业放大；尽量采用柱层析技术，各步骤间样品应无需复杂处理；初步分离要快速、大规模，精纯要高分辨率；尽可能避免带入有害物质;每步需统计：

16、得率、纯度、纯化倍数,粗 提,离心,发酵液,发酵液,菌体,包涵体,裂解液,复性液,菌体,粗提液,上清,破菌、离心,洗涤、裂解,复性,胞内表达,分泌表达,工艺流程,精纯工艺主要任务,1、去除非蛋白质类大分子杂质：内毒素、DNA、RNA、脂类、多糖等 2、去除蛋白质类杂质：宿主蛋白、融合表达的Tag、质粒上其它元件表达产物、培养基带来的蛋白等。3、去除纯化方法带来的杂质,分离纯化策略,分离纯化三步策略,分离纯化工艺设计考虑要素,离子交换（Ion exchange chromatography，IEC)速度快，分辩率较高，适合前1-2步；疏水层析（Hydrophobic interaction ch

17、romatography,HIC)速度快，分辩率较高，适合前1-2步；凝胶过滤(Gel filter,GF)分辩率高，上样体积和洗脱速度受限制,适合最后亲和层析(Affinity chromatography,AC)速度快，分辩率较高，但成本高，配基污染，适合1-3步反相色谱（Reversed phase chromatography，RPC)分辩率高，但不适合蛋白质,主要色谱技术特点,色谱技术为基础的精纯工艺,层析系统工作流程,中压层析系统AKTA explorer 100,AKTA-ready系统（生产型）,四、工程菌构建、分析、发酵与产物分离纯化,三、工程菌构建策略,二、大肠杆菌表达系统

18、高效表达原理,一、大肠杆菌表达（生产）系统的优缺点,五、利用大肠杆菌系统生产重组蛋白案例,第三章 大肠杆菌基因工程,重组人胰岛素,*胰岛素是糖尿病特效药，全球约1亿患者*传统的为猪源性产品*1982年，美国Ely LiLi公司首先使用重组大肠杆菌生产人胰岛素*1987年，Novo公司推出重组酵母菌生产的人胰岛素*目前主要在突变型方面进行研发，已有长效型与速效型入市,胰岛素的结构及其生物合成,S,S,S,S,C,N,S,S,B 肽（30）,C 肽（31）,A 肽（21）,R,R,R,K,S,S,S,S,C,N,S,S,N,C,高尔基体内的特异性肽酶,N,C,信号肽,B 肽,C 肽,A 肽,信号肽

19、酶,利用重组大肠杆菌生产人胰岛素,A、B链分别表达法,胰岛素原（BCA）表达法,A、B链共表达法,A链和B链分别表达法,基因工程菌的构建策略：,tac,tac,b-Gal,b-Gal,A peptide,B peptide,ori,ori,Apr,Apr,Met,Met,Met,Met,M,M,N,C,M,M,N,C,化学合成A链,和B链的编码,序列,A链和B链分别表达法,表达产物的后处理路线：,M,M,N,C,M,M,N,C,b-Gal,b-Gal,A,B,CNBr 处理,N,C,N,C,N,C,N,C,Cys 体外氧化和重折叠,分离纯化,人胰岛素原（BCA）表达法,基因工程菌的构建策略：,

20、tac,b-Gal,C peptide,ori,Apr,Met,Met,M,M,N,C,B peptide,A peptide,人胰岛素原的cDNA,重组人胰岛素原,转化,分离纯化,表达产物的后处理路线：,S,S,S,S,C,N,胰蛋白酶,C peptide,A peptide,B peptide,M,R,R,K,R,CNBr,R,S,S,S,S,C,N,N,C,R,羧肽酶B,B链中第22位上的Arg和第29,位上的Lys由于良好折叠的原,因，对胰蛋白酶不敏感,人胰岛素原（BCA）表达法,A链和B链同时表达法,tac,b-Gal,ori,Apr,Met,Met,M,M,N,C,B peptid

21、e,A peptide,化学合成AB链编码序列,重组人胰岛素,转化,分离纯化,CNBr 处理,特异性裂解,体外折叠,1、试述大肠杆菌表达系统工程菌构建技术路线及工程菌鉴定内容。2、工程菌质粒不稳定性的表现形式和机制是什么？有哪些改进策略？3、如何进行工程菌遗传稳定性分析？分析项目包括哪些？什么是质粒的宏观逃逸率？如何测定？4、工程菌常规保存条件为何？菌种库包括哪几种形式？相互关系如何？5、影响工程菌发酵的主要因素有哪些？什么是工程菌的生长曲线和表达曲线？最佳诱导时机在工程菌生长曲线中的什么时期？6、工程菌工业发酵工艺流程如何？发酵工艺研究需要解决的主要问题是什么？如何实现大肠杆菌高密度发酵？7

22、、表达产物分离纯化研究的主要内容和原则是什么？8、大肠杆菌系统表达产物粗提工艺包括哪些内容？9、表达产物精纯的主要任务是什么？为什么主要采用色谱柱分离（层析）技术？在分离纯化三步策略中各有哪些层析技术可选择？,思考题（工程菌构建、发酵、分离纯化）,题目：重组人白介素-2（rhIL-2）大肠杆菌工程菌的构建 请你根据所学习知识，从基因克隆开始，为rhIL-2构建大肠杆菌工程菌株，进行工程菌稳定性和表达分析，并根据你的工程菌构建策略提出相应的发酵与分离纯化策略。,作业：在5月25日前交，严禁互相抄袭！,题目：rhIL-2大肠杆菌工程菌的构建摘要：本文研究目的、内容与结果（200字以内）前言：简要介

23、绍rhIL-2的理化特性、基因结构、生物学活性、临床潜在用途、本文研究目的（500字以内）。材料与方法：1）菌株、质粒、培养基名称与来源（可虚拟）2）工具酶、关键试剂名称与来源（可虚拟）3）仪器：关键仪器名称与来源（可虚拟）4）方法：基因克隆和表达载体构建的全过程、质粒与工程菌鉴定、遗传稳定性分析、工程菌培养与表达诱导分析等的具体方法名称与基本操作过程。,4、结果与讨论1）rhIL-2基因克隆 须包含基因编码序列、PCR或RT-PCR的引物序列、供克隆操作的酶切位点等信息。PCR产物电泳结果请绘图。2）表达载体与工程菌构建 工具质粒和宿主菌允许虚构，但须注明关键元件、目的基因克隆位点、构建所获表达载体的物理图谱（示意图）、表达调控方式、酶切鉴定方法。请尽量采用流程图形式说明构建过程。3）工程菌生长与表达分析 须包含工程菌生长曲线、表达产物初步鉴定（SDS-PAGE、Westernblot）、表达曲线等。4）工程菌传代稳定性分析 须包含结构稳定性和分配稳定性分析结果5）发酵和分离纯化策略 必须根据你的工程菌构建策略描绘可能的发酵与分离纯化工艺设计策略，并给出相应的工艺流程图。,