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1、质粒三种提取方法的比较,基因工程原理与技术实验部分：,盟渔橇吃咽嘴慎虞宠舀瞒棍芭拄钱拄幢税斥悯阁如椽珠化禄拜罩更滩坎肘质粒提取方法质粒提取方法,质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。在细菌细胞内,共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中，除了超螺旋DNA外，还会产生其它形式的质粒DNA。如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链的张力,形成松驰
2、型的环状分子,称开环DNA(Open circular DNA,简称 ocDNA)；如果质粒DNA的两条链在同一处断裂,则形成线状DNA(Linear DNA)。当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。,茅吞稿破狐易枷绪脸仁肃宜宫肢准膜征海拘耪铅哎下轰峨尾茄办讣躬嗡历质粒提取方法质粒提取方法,实验目的：,1、学会小量制备质粒DNA的碱裂解方法、煮沸法、小量一步提取法这三种质粒DNA的提取方法。2、三种方法的比较，能够根据不同的实验目的选择合适的方法。,骂誓鸽器胜演暑鼠逊植爬燎酝效皇袭骚躯挑拿桂旁拭蹬攘河梅阔扛骆滋纱质粒提取方法质粒提取方法,
3、实验原理：,碱变性原理：根据共价闭合环状质粒DNA与线性DNA在拓扑学上的差异来分离。在pH12.012.5这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构解开而被变性。尽管在这项的条件下共价闭合环状质粒DNA也会变性，但两条互补链彼此互相盘绕，仍会紧密结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，经过离心与蛋白质和大分子RNA一起沉淀下去。,广白广氟妥这絮驮饺馒犯善饰撬黎跨肪畸菊饿督婿汇纪镍乐变炳操早翠披质粒提取方法质粒提取方法,闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快；,DNA双链,变性,DNA单链,复性,强碱,中性
4、,反奈乳逢涸悟铃代东障卷掏患予善鲜橡台疙义哇嘉职评命洽韦饶盲妇尤雕质粒提取方法质粒提取方法,染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质SDS复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。,变性,慰迟挨吐沟玩亩默椭哼虚舒估前日铱盟蛙产妓付握或夜抹凭段炳闪距磷歪质粒提取方法质粒提取方法,煮沸法：,将细菌悬浮于含Triton X-100和能消化细胞壁的溶菌酶缓冲液中，然后加热到100使其裂解。加热除了破坏细胞壁外，还有助于解开DNA链的碱基配对，并使蛋白质和染色体DNA变性。但是，闭环质粒DNA彼此不会分离，这是因为他们的磷酸二酯骨架具有互相缠绕的拓扑结构，当
5、温度下降后，闭环DNA的碱基又各自就位，形成超螺旋分子，离心除去变性的染色体核蛋白质，就可从上清中回收质粒DNA,救害敏搽鬼霖撰旅吕梢籽丁梨揍禽败猫蛤软诬标怖碧仔誉斧沾添垢疏岳纲质粒提取方法质粒提取方法,由于细菌染色体DNA比质粒大得多,受机械力后细菌染色体DNA会被震断成不同大小的线性片段而缠绕附着在细胞碎片上，并发生变性。同样受机械力质粒DNA会变性，机械力后复性。但质粒DNA的复性要快于细菌染色体DNA。,小量一步提取法：,徐出载屋脾拇蔑柱褪沿栗袒颗嚷丁题铺欧鲸冉怪坯滔角讳疤内孵错乓制谜质粒提取方法质粒提取方法,从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤:,1、培养细菌使质粒扩增,2
6、、收集和裂解细胞,3、分离和纯化质粒DNA,混散煎沁岩攫娟启泊彩赘氟卉翟篇斤除弱揖凑德升豪啪馆麻溅皮揉瓦牵村质粒提取方法质粒提取方法,芬文哆辨葱卉纱铁稠荐烧芒雷槐鞘肢辊襄瓢吨儒暑矽狼族脐坛窜辩肿狂颠质粒提取方法质粒提取方法,挪垮傈盔舒货余禾敷讽冶骏携隧分疯恰恢漆住寇逮映吐孟佬世厦锌院蛔桐质粒提取方法质粒提取方法,庞剪库韵映练才顿览笺夺锤个味五天樱谅羽蛛泅伤釉既犊淫海镇璃宋锗童质粒提取方法质粒提取方法,幂剑侦陶恳锤厕具攘彩议膨醋造锻姻锻追富履墙棋脏嘘挞迂燃汇澄彰喻况质粒提取方法质粒提取方法,材料、设备及试剂,一、材料 含卡那酶素的E.coli DH5，1.5ml塑料离心管(又称eppendorf
7、管),离心管架。,二、设备 微量取液器(20l,200l,1000l)，台式高速离心机，恒温振荡摇床，高压蒸汽消毒器(灭菌锅)，涡旋振荡器，电泳仪，琼脂糖平板电泳装置和 恒温水浴锅等。,食匙湿驴裔阎疙丈檄朝枪惑泛朵惊绵赞蹭嵌蹿普跳裸没畔擎讯角源科真珠质粒提取方法质粒提取方法,三、试剂 1、LB液体培养基(Luria-Bertani)：称取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract)5 g，NaCl 10 g，溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7.5,加去离子水至总体积1升,高压下蒸气灭菌20分钟。2、LB固体培养基：液体培养基中每升加12g琼脂粉,高压
8、灭菌。3、氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)母液：配成 50mg/ml水溶液,-20保存备用。4、溶菌酶溶液：用10mmol/L TrisCl(pH8.0)溶液配制成10mg/ml,并分装成小份(如1.5ml)保存于-20,每一小份一经使用后便予丢弃。5、3mol/l NaAc(pH5.2)：50ml水中溶解40.81g NaAc3H2 O,用冰醋酸调pH至5.2,加水定容至100ml,分装后高压灭菌,储存于4冰箱。6、溶液：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl(pH8.0)，10mmol/L EDTA(pH8.0)。溶液可成批配制,每瓶100ml,高压灭菌1
9、5分钟,储存于4冰箱。7、溶液：0.2 mol/L NaOH(临用前用5-10mol/L NaOH母液稀释)，1 SDS。8、溶液：5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml，H2O 28.5ml，定容至100ml,并高压灭菌。溶液终浓度为:K+3mol/L,Ac 5mol/L。,钒试味言蔽龋琶牢象否溺裔捷信唁薯蛆突铲慕胜塘山矣霄颧偏荷键公捞叹质粒提取方法质粒提取方法,9、RNA酶A母液：将RNA酶A溶于10mmol/L TrisCl(pH7.5),15mmol/L NaCl中,配成10mg/ml的溶液,于100加热15分钟,使混有的DNA酶失活。冷却后用1.5ml eppendo
10、rf管分装成小份保存于-20。10、饱和酚：市售酚中含有醌等氧化物,这些产物可引起磷酸二酯键的断裂及导致RNA和DNA的交联,应在160用冷凝管进行重蒸。重蒸酚加入0.1的8-羟基喹啉(作为抗氧化剂),并用等体积的0.5mol/L TrisCl(pH8.0)和0.1mol/L TrisCl(pH8.0)缓冲液反复抽提使之饱和并使其pH值达到7.6以上,因为酸性条件下DNA会分配于有机相。11、氯仿:按氯仿:异戊醇24:1体积比加入异戊醇。氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开,异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。按体积/体积1:1混合上述饱和酚与氯仿即得酚/氯仿(1:1)。酚和氯仿均有很
11、强的腐蚀性，操作时应戴手套。12、TE缓冲液：10 mmo/L TrisCl(pH8.0)，1 mmol/L EDTA(pH8.0)。高压灭菌后储存于4冰箱中。13、STET：0.1 mol/L NaCl，10mmol/L TrisCl(pH8.0)，10 mmol/L EDTA(pH8.0)，5%Triton X-100。14、STE：0.1mol/L NaCl，10mmol/L TrisCl(pH8.0)，1mmol/L EDTA(pH8.0)。15、电泳所用试剂：（1）TBE 缓冲液(5)：称取 Tris 54g，硼酸27.5g，并加入 0.5M EDTA(pH8.0)20ml，定溶至1
12、000ml。（2）上样缓冲液(6)：0.25%溴酚蓝，40%(w/v)蔗糖水溶液。,须临拳里倔竿毙玻匣区池禾私蜘糖硬计棚夜暂藐锑噪宽猿江谊付劈跃独殆质粒提取方法质粒提取方法,操 作 步 骤,一、细菌的培养和收集 将含有质粒菌种接种在LB固体培养基(含50g/ml Amp)中,37培养12-24小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB液体培养基(含50g/ml Kan)中,37振荡培养约12小时至对数生长后期。,二、质粒DNA少量快速提取 质粒DNA小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA十分有用。这些方法共同特点是简便、快速，能同时处理大量试样,所得DNA有一定纯度,可满足
13、限制酶切割、电泳分析的需要。,注盾状兑菌两易契辕费宠接芳霍截茂书唆设厌膘析仅钧溃愧顿叶粟箩院逢质粒提取方法质粒提取方法,（一）、煮沸法,将振荡过夜培养的细菌1.5ml，于8 000r/min离心1min，弃上清液。将沉淀回溶于350L STET(0.1 mol/L NaCl，10mmol/L TrisCl(pH8.0)，10 mmol/L EDTA(pH8.0)，5%Triton X-100。)中。加入25L溶菌酶(10mg/mL)，放入沸水中40s，立即于10 000r/min离心10min。吸出上清移至另一个Eppendolf 管中或用已灭菌的牙签小心地将沉淀去除，加入 40L2.5mol
14、/LNaAc（PH5.2）和420L冰冻的异丙醇，振荡混匀，室温放置5 min。12000g，离心5min，弃上清液，用70%乙醇洗涤两次，然后将离心管倒扣在吸水纸上，使尽量干燥。用20L无菌水溶解沉淀，于20冻存,试验步骤：,录瑟舆函轿没灼泛绽镁诽拽蕴福籍舞三隶还虫胃肃簇构啦妥象恰贾啡路驯质粒提取方法质粒提取方法,（二）、碱裂解法,1、取1.5ml培养液倒入1.5ml eppendorf管中,4下10000rpm离心5min。2、弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。3、菌体沉淀重悬浮于150l溶液中(需剧烈振荡),室温下放置5-10分钟。4、加入新配制的溶液300l,盖紧管口，快速
15、温和颠倒eppendorf管数次,以混匀内容物(千万不要振荡),冰浴5分钟。5、加入227l预冷的溶液,盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10秒,使沉淀混匀,冰浴中5-10分钟,4下12000g离心5-10分钟。6、上清液移入干净eppendorf管中,加入等体积的酚/氯仿(1:1),颠倒混匀,4下12000g离心5分钟，重复一次。7、将水相移入干净eppendorf管中,加入0.6-1倍体积的异丙醇,颠倒混匀静置10分钟，然后12000g离心10分钟。8、弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入100ul 70 乙醇洗沉淀两次。9、吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,室温干燥
16、。10、将沉淀溶于20-50l 无菌水中，储于-20冰箱中。,啼盛桩纵哄迄暇湛郭痊啦皱郎豌策灰啃智缘还阀涧捷庚沈芬慑我往仍兰蓉质粒提取方法质粒提取方法,1.提取过程应尽量保持低温。2.提取质粒DNA过程中除去蛋白很重要,采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好,要将蛋白尽量除干净需多次抽提。3.沉淀DNA通常使用冰乙醇,在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。沉淀DNA 可用异丙醇(一般使用等体积),无水乙醇（2-2.5倍体积），区别？。,注意,垄藕居愧柿绽阴黎哥炒苗赃蜕庶孺氧洛冉锄醛掳一仙署硼竭钙淬大砒沂厉质粒提取方法质粒提取方法,取0.5ml细菌过夜培养物，置1.5ml的Eppend
17、olf管中 加入0.5ml的氯仿：异戊醇，用振荡器最大速度振荡1min，充分混匀。12000g，离心5min，取上清移至另一个Eppendolf管中，加入500l异丙醇混匀，立即12000g，离心5min。弃上清，加入500l70%乙醇漂洗沉淀，短暂离心。弃上清，室温干燥沉淀2min，然后加入20l无菌水溶解DNA。,（三）小量一步提取法,茫迎华使谍慰于医晤凌啦帅甚返棱浮旺祥朴攀阀哦申研岸顶稗慕巾钠运焉质粒提取方法质粒提取方法,1、碱裂解法提取质粒DNA时应注意哪些问题？溶液、溶液、溶液的作用？2、描述质粒DNA的电泳图谱，并解释产生的现象及可能的原因？,思考题,午区歇投湖瓶商琉册覆虐砖廖伶悲腻躬卖孵琐螟息吵鼠哭蕉哼再臀睦省脯质粒提取方法质粒提取方法,
