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1、临床医学硕士专业学位（学士、硕士学位连续培养）硕士学位论文论文题目：南方红豆杉水提物联合吉非替尼抑制HGF/MET通路抗人非小细胞肺癌移植瘤吉非替尼耐药的实验研究作者姓名：XXX指导教师：XXX学科专业：中医学（中西医结合临床方向）所在学院：第一临床医学院提交日期20XX年1月此页作为扉页放在学位论文封面后XX中医药大学研究生学位论文原创性声明本人郑重声明：本人所提交的学位论文南方红豆杉水提物联合吉非替尼抑制HGF/MET通路抗人非小细胞肺癌移植瘤EGFR-TKI耐药的实验研究是本人在导师的指导下，进行的研究工作及取得的研究成果。除文中已经加以标注引用的内容外，本论文不包含其他个人或集体已经发
2、表或撰写过的研究成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明和致谢。本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：签字日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解浙江中医药大学有关保留、使用学位论文的规定，同意浙江中医药大学保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权XX中医药大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于1、保密口,在一年解密后适用本授权书。2、不保密口。（请在以上相应方框内打“J”）学位论文作者签名：签字日期：年 月指
3、导教师签名：签字日期： 年 月 日中文摘要VIABSTRACTVIII前言1一、材料与方法3（一）实验材料31 .实验室32 .实验细胞33 .实验动物34 .动物受试药35 .实验仪器36 .实验试剂47 .主要试剂的制备6（二）实验方法71 .动物受试药的制备72 .人非小细胞肺癌细胞系的复苏、冻存、计数及培养和传代73 .裸鼠移植瘤模型的建立与分组84 .裸鼠移植瘤瘤块组织的提取95 .对裸鼠移植瘤目的蛋白表达的WeStern-Blot检测96 .对裸鼠移植瘤目的mRN表达的RT-PCR检测127 .统计学处理14二、结果14（一）4种非小细胞肺癌细胞系裸鼠移植瘤模型的建立14（二）南方
4、红豆杉水提物联合吉非替尼对4种非小细胞肺癌细胞系移植瘤HGF/MET通路相关蛋白表达的影响151.南方红豆杉水提物联合吉非替尼对荷PC9裸鼠移植瘤HGF/MET通路通路相关蛋白表达的影响152 .南方红豆杉水提物联合吉非替尼对荷PC9/R裸鼠移植瘤HGF/MET通路通路相关蛋白表达的影响163 .南方红豆杉水提物联合吉非替尼对A549移植瘤HGF/MET通路通路相关蛋白表达的影响184 .南方红豆杉水提物联合吉非替尼对H1975移植瘤HGF/MET通路通路相关蛋白表达的影响19（三）南方红豆杉水提物联合吉非替尼对荷PCAPC9R549.H1975裸鼠移植瘤HGF/MET通路相关InRNA表达的
5、影响211 .南方红豆杉水提物联合吉非替尼对荷PC9裸鼠移植瘤HGF/MET通路相关mRN表达的影响212 .南方红豆杉水提物联合吉非替尼对荷PC9/R裸鼠移植瘤HGF/MET通路相关mRNA表达的影响223 .南方红豆杉水提物联合吉非替尼对荷549裸鼠移植瘤HGF/MET通路相关mRNA表达的影响234 .南方红豆杉水提物联合吉非替尼对荷H1975裸鼠移植瘤HGF/MET通路相关mRNA表达的影响23三、分析与讨论24（一）南方红豆杉的抗肿瘤作用241 .中医对红豆杉的认识242 .南方红豆杉抗肿瘤的成分研究25（二）南方红豆杉水提物对裸鼠移植瘤HGF/MET信号通路作用的探讨261 .HG
6、F/MET通路与EGFR-TKI耐药262 .抗HGF/MET通路克服EGFR-TKI耐药的基础与临床研究293 .南方红豆杉水提物抑制荷人NSCLC细胞株裸鼠移植瘤HGF/MET通路抗吉非替尼耐药30（三）工作展望32四、小结33结论33参考文献34附图39致谢40文献综述41中文摘要南方红豆杉水提物联合吉非替尼抑制HGF/MET通路抗人非小细胞肺癌移植瘤吉非替尼耐药的实验研究目的研究南方红豆杉水提物联合吉非替尼对荷PC9、PC9/R、A549、H1975裸鼠移植瘤HGF/MET信号通路的影响。方法建立荷PC9、PC9/R、A549、H1975裸鼠移植瘤模型，并测定成瘤率。各细胞株的荷瘤裸鼠
7、均随机分为南方红豆杉水提物组、吉非替尼组、南方红豆杉联合吉非替尼组和对照组，灌胃4周后取出并保存瘤块。用Western-blot法检测每种移植瘤中MET、p-METERBB3、p-ERBB3蛋白的表达水平；用Real-timePCR法测定每种移植瘤中MET、ERBB3mRNA的表达水平；多组间差异选用单因素方差分析，两组间差异选用独立样本t检验，均用SPSS17.0软件处理。结果1.接种PC9、PC9RH1975细胞的裸鼠成瘤率均为100%,接种A549细胞的裸鼠成瘤率为90%。2 .Westem-blot结果：荷PC9裸鼠移植瘤：南方红豆杉水提物单药组较对照组能够显著下调P-MET、ERBB
8、3P-ERBB3蛋白的表达(PvO.Ol)。上调MET蛋白的表达(PVo.01)。荷PC9/R裸鼠移植瘤：相较于吉非替尼组，南方红豆杉水提物联合吉非替尼组能够显著下调MET、P-MET、ERBB3P-ERBB3的表达(P0.01)o南方红豆杉水提物单药组较对照组亦能够显著下调MET、P-MET、ERBB3、p-ERBB3的表达(PP-ERBB3的表达(P0.01),南方红豆杉水提物单药组较对照组能够显著下调ERBB3的表达(P0.01),能上调MET、P-MET、P-ERBB3的表达(P0.01).荷H1975裸鼠移植瘤相较于吉非替尼组，南方红豆杉水提物联合吉非替尼组能够显著下调P-MET、E
9、RBB3、P-ERBB3的表达(P0.01),上调MET的表达(P0.01)o南方红豆杉水提物单药组较对照组亦能够显著下调MET、p-METsP-ERBB3的表达(P0.01),上调ERBB3的表达(PVO.01)。3 .Real-timePCR法显示：荷PC9裸鼠移植瘤:南方红豆杉水提物单药的MET、ERBB3mRNARQ值均显著低于对照组(P0.01)0荷PC9/R裸鼠移植瘤：较吉非替尼组，南方红豆杉水提物联合吉非替尼能下调MET的表达(P0.05),显著下调ERBB3的表达(尸0.01)。南方红豆杉水提物单药组的MET、ERBB3mRNARQ值均在统计学意义上显著低于对照组(P0.01)
10、o荷A549裸鼠移植瘤：较吉非替尼组，南方红豆杉水提物联合吉非替尼能显著下调MET的表达(P0.01),上调ERBB3的表达。而南方红豆杉水提物单药能够显著上调MET、ERBB3mRNA的表达(P0.01)o荷H1975裸鼠移植瘤：较吉非替尼组，南方红豆杉水提物联合吉非替尼能显著下调ERBB3mRNA的表达，显著上调METmRNA的表达(PVO.01)。南方红豆杉水提物单药组的MET、ERBB3mRNARQ值均在统计学意义显著低于对照组(P0.01)o结论1.南方红豆杉水提物联合吉非替尼能通过抑制HGF/MET通路达到对抗荷PC9/R、A549裸鼠移植瘤吉非替尼耐药的作用。2.南方红豆杉水提物
11、单药通过能抑制荷PC9、PC9/R、H1975裸鼠HGF/MET通路达到抗肿瘤的作用。主题词南方红豆杉水提物，吉非替尼，移植瘤，HGF/MET信号通路ABSTRACTAqueousExtractofTaxusChinensisvar.mairei(AETC)CombinedwithGefitinibOvercomeGefitinibResistanceinNSCLCXenograftsbyInhibitingHGF/METSignalingPathwayObjective:ExploretheeffectsofAqueousExtractofTaxuschinensisvar.mairei(A
12、TEC)incombinationwithgefitinibonHGF/METsignalingpathwayinPC9,PC9R,A549,H1975xenografts.Methods:WesetupPC9,PC9R,A549,H1975nudemicesubcutaneousxenograftmodels,andeachcellline,stumorformationratewascalculated.MicewithsamekindofxenograftwererandomizeddividedtoATECgroup,gefitinibgroup,AETCcombinedgefitin
13、ibgroupandblankcontortgroup.After4weeksgastricgavage,xenograftswerestrippedandstored.WeusedWestern-blottotesttheexpressionofMET,p-MET,ERBB3,p-ERBB3proteinineachgroup.Real-timePCRwasusedtotesttheexpressionofMET,ERBB3mRNA.One-wayANOVAwasusedtotestthedifferenceamongmultiplegroups,ttestwasusedtotestthed
14、ifferencebetween2groups.TheywereperformedbySPSS17.0software.Results:1.Tumorformationrate：ThetumorformationrateofnudemicethatinoculatedPC9,PC9R,H1975cellsis100%.NudemiceinoculatedA549cellshasatumorformationrateof90%oWestern-blot：PC9xenografts:Comparedwithcontrolgroup,AETCcansignificantlydecreasetheex
15、pressionofp-MET,ERBB3,p-ERBB3protein(P0.01).SignificantlyincreasetheexpressionofMETprotein(P0.01).PC9Rxenografts:Comparedwithgefitinibgroup,AETCcombinedwithgefitinibcansignificantlydecreasetheexpressionofMET,p-MET,ERBB3,p-ERBB3protein(P0.01).AETCgroupcansignificantlydecreasetheexpressionofMET,p-MET,
16、ERBB3,p-ERBB3proteincomparedwithcontrolgroup(P0.01).A549xenografts:Comparedwithgefitinibgroup,AETCcombinedwithgefitinibcansignificantlydecreasetheexpressionofMET,p-MET,ERBB3,p-ERBB3protein(P0.01).Comparedwithcontrolgroup,AETCgroupcansignificantlydecreasetheexpressionofERBB3protein(P0.01),Significant
17、lyincreasetheexpressionofMET,p-MET,p-ERBB3protein(Pvo.01).H1975xenografts:Comparedwithgefitinibgroup,AETCcombinedwithgefitinibcansignificantlydecreasetheexpressionofp-MET,ERBB3,p-ERBB3protein(P0.01),significantlyincreasetheexpressionofMETprotein(P0.01).Comparedwithcontrolgroup,AETCgroupcansignifican
18、tlydecreasetheexpressionofMET,p-MET,p-ERBB3protein(P0.01),SignificantlyincreasetheexpressionofERBB3protein(P0.0i).Real-timePCR:PC9xenografts:Comparedwithcontrolgroup,AETCcansignificantlydecreasetheexpressionofMET,ERBB3mRNA(P0.01).PC9Rxenografts:Comparedwithgefitinibgroup,AETCcombinedwithgefitinibcan
19、decreasetheexpressionofMETmRNA(P0.05),significantlydecreasetheexpressionofERBB3mRNA(P0.01).AETCgroupcansignificantlydecreasetheexpressionofMET,ERBB3mRNAcomparedwithcontrolgroup(P0.01).A549xenografts:Comparedwithgefitinibgroup,AETCcombinedwithgefitinibcansignificantlydecreasetheexpressionofMETmRNA(P0
20、.01),increasetheexpressionofERBB3mRNA.Comparedwithcontrolgroup,AETCgroupcansignificantlydecreasetheexpressionofMET,ERBB3mRNA(P0.0i).H1975xenografts:Comparedwithgefitinibgroup,AETCcombinedwithgefitinibcansignificantlydecreasetheexpressionofERBB3mRNA(P0.01),significantlyincreasetheexpressionofMETmRNA(
21、P0.01).Comparedwithcontrolgroup,AETCgroupcansignificantlydecreasetheexpressionofMET,ERBB3mRNA(PErbB3、p-ErbB3一抗:美国CeHSignalingTeChnoIogy公司羊抗鼠、羊抗兔二抗：美国SantaCrUZ公司（3） RT-PCR试剂RNAisoPlus：宝生物工程（大连）有限公司焦炭酸二乙酯(DEPC)：宝生物工程(大连)有限公司PrimeScriptRTMasterMix：宝生物工程(大连)有限公司SYBRPremixEXTaq：宝生物工程(大连)有限公司7.主要试剂的制备(1)
22、10%SDSSDS(十二烷基磺酸钠)IOg蒸馆水至100mI50C水浴下溶解，室温保存。SDS需在通风柜内取样。(2) 10%过硫酸铁(APS)过硫酸筱0.1g超纯水LOml现配现用，4度不超过一周。(3) IOX电泳缓冲液Tris30.3g甘氨酸187.7gSDSIOg蒸储水至1000ml混匀后室温保存。IX电泳缓冲液：每IoOmI加蒸偏水至1L。(4) IoX转移缓冲液Tris58g甘氨酸29gSDS3.7g蒸馆水至1000ml混匀后室温保存。IX转移缓冲液：每IoOmI加入200ml甲醉，蒸僧水至1L。(5) 10XTBS缓冲液1mol/LTrisHCl(pH7.5)100mlNaCl8
23、8g蒸储水至1000ml混匀后室温保存。（6） IXTBST缓冲液Tween20200ul-2ml10TBS100ml蒸储水至1OOOml（6）封闭液（5%脱脂奶粉）脱脂奶粉（国产，光明牌）5g1TBST100ml（二）实验方法1 .动物受试药的制备（1）南方红豆杉水提物配制将40g南方红豆杉饮片置于医用不锈钢锅，浸泡过夜，加8倍水煮沸30min,倒出药液，后加8倍水煮沸20min,再加5倍水煮沸20min,将3次药液经真空抽滤器过滤,置于电磁炉上浓缩至终浓度为104mg（生药量）/ml,按每只小鼠灌胃剂量0.1ml10克浓缩药液，过滤除菌，20C保存备用。（2）吉非替尼药液配置根据“人和动物
24、体表面积折算的等效剂量比率表，将吉非替尼片（易瑞沙）250mg,配制成5mgml的混悬液，用生理盐水溶解，按每只裸鼠灌胃剂量0.1ml10克定容，过滤除菌，-2OC保存备用。2 .人非小细胞肺癌细胞系的复苏、冻存、计数及培养和传代（1）细胞的复苏操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管爆裂可能造成操作人员的伤害。将保存在80C冰箱中装有各细胞株的冻存管迅速置于37C恒温水浴中，边摇边融。待溶解后，用酒精消毒后开启，用移液器吸出细胞悬液，注入含35mllO%胎牛血清培养液的15ml离心管中。混匀后800rmin离心5min,去上清液，加入含10%胎牛血清的培养液3ml,混匀，移至25cn?培养瓶中
25、。再加入3ml培养液，置5%Co2,37培养箱中孵育。（2）细胞的冻存对数生长期的细胞，冻存前24小时换液，使细胞处于良好的营养状态。按下述方法制备细胞冻存培养基:无血清培养基7/10,FBS210,DMSOl10o离心收获细胞，计数，800rpm离心5分钟，去上清。沉淀加含保护液的培养基，计数，调整至5xl6ml左右。用吸管轻轻吹打使细胞均匀，Iml管分装到无菌冻存管内。用封口胶，将冻存管口封严。封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。按下列顺序降温：室温一4（30min）一低温冰箱20（30min）一超低温冰箱80（数天）T液氮（长期）。（3）细胞的计数将血细胞计数板和盖玻片用75%酒精擦净，
26、干燥后将盖玻片放在计数室。收集细胞，用完全培养基将细胞做适当稀释，微量加样器吸取IOUI细胞于计数板上盖玻片一端将液体注入其下方的计数室内。静置1分钟，显微镜下观察并计算出四角大格内的细胞数。将计数结果按以下公式计算出细胞密度：细胞密度（万mD二（四大格细胞总数/4）*10,OO0*稀释倍数。（4）细胞的培养与传代人肺腺癌细胞株在含10%胎牛血清的培养液中培养（其中A549细胞株培养液为F12-K；PC9、PC9/R细胞株培养液为DMEM；H1975细胞株培养液为1640）,培养箱保持在5%CO2、37C、饱和湿度条件下，根据细胞生长状态每12天更换培养液1次。待细胞单层铺满培养瓶后，弃去培养
27、液，用PBS洗去残余培养液，加消化液（0.25%胰酶-EDTA）l-2ml,置培养箱内23min,再把培养瓶放倒置显微镜下进行观察，发现胞质回缩、细胞间隙增大，细胞变圆且已有细胞开始悬浮时，加入1-1.5倍于消化液的含10%胎牛血清的培养液终止消化。轻轻反复吹打培养瓶底部，将细胞悬液移入离心管中，80OrPm离心5min,弃上清液。再用含10%胎牛血清的培养液重悬细胞，细胞密度控制在105个/ml左右，移入培养瓶中，于37、5%CO2、饱和湿度的培养箱培养。每12天换液1次，34天传代1次。取对数生长期细胞进行实验。3 .裸鼠移植瘤模型的建立与分组采用BALB/c裸鼠180只进行实验（A549
28、、PC9、PC9/R、H1975,每种细胞株40只）。取处于对数生长期人非小细胞肺癌细胞，制成单细胞悬液，PC9、PC9/R、H1975浓度调整为l-2xl()6ml,A549浓度调整为5-10xl()6mL将不同人非小细胞肺癌细胞株接种于裸鼠右腋皮下，每只裸鼠右腋皮下接种O.2ml,10天后，剔除未成瘤裸鼠。裸鼠成瘤后，计算成瘤率。每种细胞株接种的BALB/c裸鼠均随机分为4组，分别为南方红豆杉水提物组、吉非替尼组、南方红豆杉联合吉非替尼组以及对照组。每组10只。连续灌胃4周。其中，南方红豆杉水提物组灌胃量为南方红豆杉10.4mg10gd,吉非替尼组灌胃量为吉非替尼0.5mg10gd,联合组
29、灌胃量为南方红豆杉10.4mg10gd+吉非替尼0.5mg10gd,对照组灌胃量为NSO.lml/lOg/d。4 .裸鼠移植瘤瘤块组织的提取上述成瘤裸鼠结束灌胃后24h,在冰上取瘤块组织，每只裸鼠瘤块保持薄膜完整，-80C保存备用，待行WeStem-Blot、RT-PCR等试验。5 .对裸鼠移植瘤目的蛋白表达的Western-Blot检测(1)裸鼠移植瘤蛋白的提取取适量RlPA裂解液、蛋白酶抑制剂、蛋白磷酸化酶抑制剂，于冰上放置融解，混匀，短暂离心使沉到管底。取绿豆样大的移植瘤组织，先用预冷的PBS或生理盐水漂洗移植瘤组织数次，以清除表面的血迹，然后将组织切成Imm见方的小组织块，置于EP管中
30、。按每20mg组织加入150uK50ul的RIPA裂解液，1.52.5ul的蛋白酶抑制剂，1.52.5ul的蛋白磷酸化酶抑制剂(RIPA裂解液与蛋白酶抑制剂、蛋白磷酸化酶抑制剂的比例为100rDo在冰上用电动匀浆器匀浆组织，至组织充分裂解。于冰上静置组织30min,每IOmin震荡一次，每次30-60s0离心机预冷后4下1200OrPm离心15min0取上清液转移至于EP管中。4C下重复离心15min一次，取上清液转移至EP管中，可放置于-80C冰箱中保存备用。（2） BCA法测定蛋白浓度将蛋白标准品放置于冰上溶解、混匀。根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(5(M)配制适
31、量BCA工作液，充分混匀，工作液呈绿色。将蛋白标准品按0,1,2,4,8,12,16,20l加到96孔板的标准品孔中，加蒸储水补足到20L加适当体积待测蛋白到96孔板的样品孔中，加蒸储水稀释至20l（待测蛋白与蒸储水比例为l:24）o各孔加入200lBCA工作液。培养箱中孵育30min,酶标仪在562nM处测定OD值，所得数据用excel软件绘制标准曲线，计算样品蛋白浓度及蛋白样本的上样体积，上样量统一为30ug。（3） SDS-PAGE电泳清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸储水冲洗干净后立在筐里晾干。灌胶与上样（配胶和灌胶在通风柜内操作
32、）：a玻璃板对齐后垂直放入夹中后卡紧，双蒸水检漏5-1Omin。准备灌胶。b配制8-12%分离胶，最后加入TEMED后立即摇匀、灌胶，待胶面升到绿带中间线高度时即可。胶上加ImI异丙醉以去除气泡及加速凝胶。加异丙醵时尽量避免对凝胶的冲击，胶面均匀铺上一层异丙醇即可。C上层液体与胶之间出现一条折射带时，胶已凝固。充分凝固后倒去异丙醇并用蒸镭水冲洗一遍，吸水纸吸干。d配制5%浓缩胶，最后加入TEMED后立即摇匀，灌胶，插入梳子，插梳子时保持正中及水平。灌胶时避免胶中产生气泡。凝固过程中胶面尤其是胶的两边可能会有所下降,应适时补加凝胶。e根据移植瘤蛋白的浓度将蛋白样品按1：1比例加入2SDS或5SD
33、S上样缓冲液，IO（TC煮沸5-1Omin使蛋白变性，立即放冰上。根据所测样品蛋白浓度，计算含30g蛋白的溶液体积为上样量。可置于80C冰箱保存。f浓缩胶凝固后，将玻璃板和胶一起拿出，放入电泳槽。电泳槽中由内到外倒入足够的电泳液，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出，开始上样。g用微量加样器贴壁吸取样品，加样器枪头插至加样孔中垂直缓慢加入样品，不能抵住玻板，避免胶与玻板脱离。样品沉入加样孔底部后再撤出加样器。电泳:插上电源，开始电泳,注意正负极。电泳电压浓缩胶60V80V,分离胶90-120V,时间24h。澳酚蓝到达胶底端时，终止电泳。（4）转膜将剪好的PVDF膜（5CmX7cm,剪右上
34、角作为正面标记）置于甲醇中浸泡处理Iomin（浸透即可），然后在转移缓冲液中浸泡10-15min以除去甲醵。在加有转移缓冲液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、海绵垫、玻棒、剪好的滤纸和处理过的PVDF膜。将夹子打开使黑面保持水平，上面垫一张海绵垫及四张滤纸，用玻棒擀走里面的气泡。将玻璃板撬开，将浓缩胶刮去，剥下分离胶盖于滤纸上，使其与滤纸对齐，用玻棒擀去气泡。将PVDF膜盖于胶上（盖满整个胶）并除去气泡。在膜上盖四张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，合起夹子。膜和胶之间不能有气泡。胶在转移缓冲液中浸泡数分钟有利于SDS的去除，利于转膜。将夹子放入转移槽中，夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。槽中加满转移缓冲液，4C层析柜中30mA转膜过夜，或250mA转膜2.5h。（5）免疫反应转膜后将膜用TBST淋洗一遍，然后移至含有封闭液（10%脱脂奶粉）的平皿中（膜的正面即蛋白面朝上），室温下脱色摇床上摇动封闭Ih或4C封闭过夜。将一抗用封闭液稀释至适当浓度（15ml离心管中，3ml）o从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜的蛋白面朝内卷曲置入15ml离心管中，与一抗充分接触，室温下旋转孵育23h后，用
