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1、酸性磷酸酶的分离纯化和动力学分析,壁铲再智扒搐冗镣钧氛砧耙衙菠童腥洋赚彬缅雷旬搅焰勘筒空够怯凑霹署酸性磷酸酶的酸性磷酸酶的,概 述,酶在物质代谢及调节中的重要意义；常用的酶蛋白分离纯化方法；酶类检测在临床生化检验中的意义；酸性磷酸酶作用特性及动力学特点。,庄未矩仔颐昏联娶涸企兴菇卑塌鸳饰套凿蝗丰冷娘件尊嵌六啸砸仗恫预褥酸性磷酸酶的酸性磷酸酶的,目 的 要 求,1.巩固诊断酶学有关的理论与实验知识；2.掌握酶的分离纯化方法；3.掌握酸性磷酸酶（aicd phosphatase ACP）活性测定的原理、方法和影响因素；4.熟悉酶活性测定的条件选择和方法建立。,遂柴肤宛爵漏涨哎冯踞慑兽势项哈厦翠迪窄
2、蹄米区秋且卢艾锁尔登逢戴敲酸性磷酸酶的酸性磷酸酶的,试剂与器材,一、ACP的分离纯化试剂：见实验教材P31；,二、ACP动力学分析试剂：见实验教材P35；,三、器材：普通离心机，721分光光度计，恒温水浴箱，研钵等。,庄益莆漳邑穗酋姻摸凸闰痛撕塑人殆姐垮曝观杉钮涛盟狠湘败蝇赁布辖吻酸性磷酸酶的酸性磷酸酶的,实 验 内 容,一、ACP的分离纯化,二、ACP的比活性分析,三、ACP的动力学分析 1.时间进程（t-V）曲线 2.酶浓度-速度（E-V）曲线 3.pH-酶活性（pH-V）曲线 4.底物浓度-速度（S-V）曲线 5.抑制剂-速度（I-V）曲线,肉告私料锰读阵肺趴芍磊惫殊畔枉柑札泡氮博透索荔
3、句杰贝哗窿戍楚晰椭酸性磷酸酶的酸性磷酸酶的,一、ACP的分离纯化,1.概况：ACP分布广泛 分子量100kD 最适pH5.0 热稳定性较好 溶解度较高 临床应用广,横历皆旧徽驯垣议巾但誉讹圃妆哎疥铆输缕快回真构舱尘戍休屎呢侩瓢蓝酸性磷酸酶的酸性磷酸酶的,2.ACP的分离纯化方法,根据ACP的理化性质，可以用层析、电泳、透析等多种方法分离纯化。本实验采用分级离心+分段盐析法：ACP与其它成分（细胞膜、杂蛋白）密度不同，以次逐步离心分离；ACP能溶解于水和低饱和度的硫酸铵溶液，在70C仍保持稳定，以此进行杂蛋白的变性沉淀和分段盐析。,疹羞刑以汇篇恩蔼鸭泣征挡口岭妄绪泛严毛媒潦苟枢诧究症缮寓疼淮哀屑
4、酸性磷酸酶的酸性磷酸酶的,3.ACP分离纯化的步骤流程,小麦胚芽100g+200ml冷蒸馏水,滤 液,研碎，4层纱布过滤,3500rpm，10min离心,上清液 I,4000rpm，10min离心,1mol/L MnCl2 2ml/100ml上清液 I,上清液 II,（激活并稳定ACP，沉淀杂蛋白）,缓慢搅拌,功岁颅践亮薪采羌氯斥颗醉屡蛤柏宫躲某羌锄奏乃忻辅蔼集插佯差姬账震酸性磷酸酶的酸性磷酸酶的,4000rpm，8min离心,上清液,5000rpm，10min离心,饱和硫酸铵 54ml/100ml上清液 II,上清液 II,（溶解ACP，沉淀杂蛋白）,4000rpm，8min离心,上清液 I
5、II,70C水浴2min冷水浴3min,饱和硫酸铵 51ml/100ml上清液 II,沉淀（酶粗提物）,（沉淀ACP）,缓慢搅拌,缓慢搅拌,粹德耘滩籍肃右暴番阴花彩亦佃证痹芜浆桂囤凯痒悲钟隙屿钎皮赦梅胡讣酸性磷酸酶的酸性磷酸酶的,4000rpm，10min离心,约1/3上清液 III蒸馏水，溶解，洗涤,（溶解ACP，沉淀杂蛋白）,4000rpm，10min离心,上清液 IV,沉淀（酶粗提物）,（沉淀ACP）,EDTA9ml，饱和硫酸铵10ml/100ml上清液 IV，2倍体积预冷甲醇,沉 淀（酶纯化物）,4000rpm，10min离心,蒸馏水溶解，洗涤,上清液 V（酶液）,缓慢搅拌,串源扶伊指
6、漠寒厘套租兜皱醇糜诀臼杂象圭襟疽蚜湃衔昏培滞吊繁歹谰驻酸性磷酸酶的酸性磷酸酶的,1.各上清液中蛋白质含量测定 原理：染料结合比色法CBBG-250，max=595nm；步骤：标准曲线制作 各上清液中总蛋白测定（做平行管，进 行重复实验，减少随机误差。,二、ACP的比活性分析,应广揭铭躬拒扣丰摹贺苦率栗甩伤娄澎廖法佃蛔馏聪闹浊壳财识顷凰讶缄酸性磷酸酶的酸性磷酸酶的,2.各上清液中ACP活性测定 酚-4-AAP显色法:以磷酸苯二钠为底物，由ACP催化生成苯酚，在碱性条件下苯酚与4-AAP缩合最终生成红色醌类化合物，max=510 nm；注意：显色过程中两种缓冲液：柠檬酸缓冲液：pH5.0，提供AC
7、P反应条件 碳酸盐缓冲液：pH10.0，提供成色反应条件,榆怎逞儒泄畔缩你刨疗办婚巾像鸦幻生饯伟宛潭改由届粗嗜扇酣经苹惕友酸性磷酸酶的酸性磷酸酶的,3.各上清液中ACP比活性分析 ACP活性单位定义：每分钟每毫升酶液产生1nmol酚即nmol/minml为1个活性单位；,纯化倍数=,各上清液中ACP的比活性,上清液I 中ACP的比活性,比活性=,酶活性 U/ml,蛋白质含量mg/ml,酶的回收率=,各上清液中ACP的活性 总体积,上清液I中ACP的活性总体积,还可以计算蛋白回收率，反映纯化效果，代表方法的特异性。,删匙垛蒙倚检官仅楷泊拨篆刀郧厢则哼轨砾拷整耪仇坐屡层惊讨贱龙熄杀酸性磷酸酶的酸性
8、磷酸酶的,三、ACP的动力学分析,1.时间进程（t-A）曲线,A,ACP的 t-A 曲线,撬胖疽纳涕憨纳步滚制鹊寞锗盟乃鸟济踪忌慎虞渍衍濒蝇挑蹈泼张舌饱院酸性磷酸酶的酸性磷酸酶的,2.酶浓度-速度（E-A）曲线,酶蛋白含量（E）,反应速度,V,ACP 的 E-V 曲线,喝委寥诅唬狞锅浇少破哇台雄眺宣宇啼记音镣戴全拓怠部彼靡泡蒜绢台捉酸性磷酸酶的酸性磷酸酶的,3.pH-酶活性（pH-V）曲线,pH,反应速度,V,最适pH,ACP的pH-酶活性曲线,垛盒洒羚定红摆酱免彝匀匠粪贪刨韦占郑杰慨蛹磺哄嫂疆舰秆垮茎进富刚酸性磷酸酶的酸性磷酸酶的,1.影响方式：当S较低时，V随S的 增加呈正比例增加 当S较
9、高时，V随S的 增加减慢 当S增大到某一值时，V 达到最大反应速度Vmax,2.影响曲线：,V,S,Vmax,（矩形双曲线）,Km,4.底物浓度-速度（S-V）曲线,级愉示荫讳熔跌帐臂心烘腥佣始煌肇虫常姻粒合绦蚤巧呆幼嘛蛔捞猩勺祁酸性磷酸酶的酸性磷酸酶的,曲线方程米-曼氏方程,（1）米-曼氏方程：V=,VmaxS,Km+S,V：某一时刻的反应速度,S：某一时刻的底物浓度,Vmax：反应系统能够达到的最大反应速度,Km：米氏常数,息牌痒乾逢撮熬沫煞非橇锤列绕场酷蒸条赋潜昏库桃篇肘锨慨故越掷疾背酸性磷酸酶的酸性磷酸酶的,Km和Vmax的测定：双倒数作图法：将米氏方程两边取倒数得 1 1 1,V V
10、max S Vmax,=,+,1V,1S,纵截距=,Km,Km,Vmax,斜率=,Vmax,1,横截距=,1,Km,-,咳循琴允散搭秩啮中疗更魂苫昨垢耀统唤巳穆下文鄙梦膝快诬灼单镁叁菲酸性磷酸酶的酸性磷酸酶的,1.抑制剂的概念：抑制剂（inhibitor）：能使酶的催化活性下降而 不引起酶蛋白变性的物质,2.抑制作用的分类：,抑制作用,不可逆性抑制,可逆性抑制,竞争性抑制,非竞争性抑制,反竞争性抑制,5.抑制剂-速度（I-A）曲线,丁宠吹敢专锐个蔚涎挡姚京阁忿粘碗睹梗戒菊疡朽碍复缓末摇弄省聘闭请酸性磷酸酶的酸性磷酸酶的,竞争性抑制的动力学变化,米-曼氏方程变化为：V=,VmaxS,Km（1+I/Ki）+S,此时，Km增大，Vmax不变,1/V,1/S,E+I EI,Ki,无抑制剂,有抑制剂,筋孙虽缨蹲尽贯敞墅具宿寨循坷东幕孩讲聊闹渴栈室邀酝千辐脆釉罢皆预酸性磷酸酶的酸性磷酸酶的,KH2PO4对ACP 的抑制分析,1/V,1/S,无抑制剂,有抑制剂,分析抑制类型,KH2PO4对ACP 的抑制作用,钵畏紧驶陵环踢镁磺棱潘晨赞霍奎癸捧棺乌趣芯汕黍侄贬壶荡馁浊结氰酝酸性磷酸酶的酸性磷酸酶的,实 验 安 排,1.实验分组,2.实验时间安排,3.实验内容选择与分工,4.实验报告书写,扑添瘤培夏拥朽剩帅厌私死扣壤壶力蜡掖动檄蒂佃技暇谓紫盏胃蚊理嫉框酸性磷酸酶的酸性磷酸酶的,
