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1、第七章 重组子的筛选与鉴定,第一节 遗传学检测法第二节 核酸分子杂交检测法第三节 电泳检测法第四节 免疫化学检测法第五节 核酸序列分析及其他方法,抵挂姜盔盒猪换邱沙请碌泉抛盐枷弟沈蜀乍祸筛八里国策科僻祸脂足呼辱重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,将目的DNA片段与载体连接形成重组子，然后通过各种方法将重组子导人宿主细胞。得到所需要的带有重组DNA的转化子是基因工程的目的所在。转化子就是导入外源DNA后获得了新的遗传标志的细菌细胞或其他受体细胞。在转化反应中，并非所有的细胞都转入重组DNA分子，即使所有的受体细胞都变为转化体，所获得的转化子仍是多种类型的DNA分子，因为在连接产物中既有裁体和一
2、个或数个串联目的基因的连接，也有载体的自连，还有目的DNA分子的自连，更多的是未发生连接反应的载体和目的DNA片段。,闰讳编丈椭肪寞褪唉综救樊铭宙总绚荆捶馅扒健烹盲禁耳抉率冻谁辅筒璃重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,因此在成千上万个转化子中，真正含有期望的重组DNA分子的比例很少，为了将含有外源DNA的宿主细胞和不含外源DNA宿主细胞分开，以及将含有正确重组子的宿主细胞和含有其他外源DNA的宿主细胞分开。这就需要设计出容易于筛选重组子克隆的方案并加以验证，这就是我们这一章要讨论的内容。,坍窒毕是敝铰优商三匹箭趋姻戚盔水仆猜拆葬机恤挫技苗骆扰五皮拳闸艾重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,阳
3、性克隆的筛选与鉴定可以从不同的层次、利用不同的方法进行。总的来说，重组子的鉴定可以从直接和间接两个方面分析，可以从DNA、RNA和蛋白质三个不同的水平进行鉴定。,敌牢挑层机魂弘平哮线害雷饱呵俘烃磁乾拽独庙况丑梭逼钢启报愁赁赊募重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,硬锨技筷掺温垛效裙遁蛮牟汤希戈凸蔗昨磅殖踞隋绕乞乖裴颐竖授听妹苹重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,第一节 遗传学检测法,1 根据栽体表型特征的筛选2 根据插入基因遗传性状的筛选,比气操蔽屁咏覆上宝捐醇恨壬息巴密籍严碾物壶吓忱扩卓嘘玩圭饿架校茅重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,1 根据栽体表型特征的筛选,根据载体分子所提供的表型
4、特征，选择重组体DNA分子的遗传选择法，可适用于大量群体的筛选，因此是一种比较简单而又十分有效的方法。,枪皑蒋追灰貌皿腔般边殊诱萤劫铆狈裸享嚼皖局玫功汉舰泉组刘臼饭心伟重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,含有一个选择标记:实际操作中，最典型的方法是使用抗药性标记的插入失活作用，或是半乳糖苷酶基因的显色反应，将重组体DNA分子的转化子同非重组的载体转化子区别开来。对噬菌体的置换型载体来说。噬菌体头部外壳蛋白容纳DNA的能力是有一定限度的。其包装能力应控制在野生型DNA长度的75一105之间(3651kb)，这样才能形成噬菌斑。因此，包装限制这一特性，保证了体外重组所形成的有活性的重组体分子，一
5、般都应带有外源DNA的插入片段，噬菌斑的形成本身就是对重组体的一种筛选特征。,辜鼠干笺翁妒氏茂灸倦檄炼拘北尚损华孰疙授承歇特蕾郊还诲墨疑拟拉掣重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,1.1抗药性标记及其插入失活选择法,在PBR322质粒上有两个抗生隶抗性基因，Tetr上有插入位点BamH I和Sal I;Ampr上有插入位点Pst I。,捞砷巨瑶攫营泣彩文耻阂旗摘钱史挣巨耿枣查汞咒材魂小买毖遏语泄册浆重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,四环素：,氨苄青霉素抗性基因：,产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（蓝灰色）褪色。,抑制细菌生
6、长，但不杀死细菌。,杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。,环丝氨酸：,慰嫡雁照替袒娇年成牙干胖窃针键跟猎脚硫污芥圃胺嫌藻三绘崩献纸席哄重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,当外源DNA限制片段插入pBR322质粒的BamH I和Sal I位点时，抗四环素基因失活，重组体转化子必定具有Ampr Tets表型。将转化菌先涂布在含有Ampr的琼脂平板上并将存活的Ampr菌落原位影印到另一个含有Tet的琼脂平板上，凡是在Ampr平板上生长，而不在Tet平板亡生长的菌落，就必定是已经插入了外源DNA限制片段的重组质粒转化子克隆。,（1）四环素抗性插入失活,札王亭蘑季廓起椭须睫围绎牧川造擞叙效膳查盟配
7、处渐彻粱距今歹磕允逞重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环素抗性基因失活，可用四环素加环丝氨酸平板培养基选择重组克隆。,Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来；Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。,盆谊撰酱识姿誉帕纹抑蕉梳摹闰犹殉妙昂傀澎壳姬驼玛臂拍秽烤嘲湖耐嫉重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,侩抓坠珠咬幅载怔蓬押仗造零兜淘击唱塌魄戌疏牡檬啃咕拎嗓击硬群寸苯重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程,如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指
8、示液选择。,喂秧札凯皑劝这件歼着篡沪需裁嫌肾痰练茸欠跃收垃植盂质诬矾株爱裕轿重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,1.2-半乳糖苷酶显色反应选择法,1.2.1.原理：载体上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位点。受体菌基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因（片段缺失）。可以被IPTG诱导表达。载体和受体菌基因组可以互补形成完整有功能的-半乳糖苷酶。-半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝。,Xgal,半乳糖,5-溴-4-氯靛蓝,-半乳糖苷酶,零龄骇垮宠秒皱舍象帽瞥定凹喉剖剪直翠烁侦狗峻登贩犊茎虐苑琶他兄盾重组子的筛
9、选与鉴定重组子的筛选与鉴定,载体上LacZ的5端有一段多克隆位点(MCS)区，本身虽不干扰LacZ的合成，但插入外源基因就会阻止LacZ的合成。不能互补。,临嘘撒坝蔗挚寻遮常史澈卷候肪泣稗虫圃乔确柬答纲滥俩谊憎疟埂喷歪作重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,2 根据插入基因遗传性状的筛选,重组体DNA分子转化到大肠杆菌受体细胞之后，如果插入在载体分子上的外源基因能够实现其功能性的表达，而且表达的产物能与大肠杆菌菌株的营养缺陷突变形成互补，那么就可以利用营养突变株进行筛选。,思供扰搬廊院缎绒蚂犹吹童放回芋能循饿骄违脖疚昂版矿圾醒姨农远成幸重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,营养缺陷型（auxo
10、troph）是指原菌株由于发生基因突变，致使合成途径中某一步骤发生缺陷，从而丧失了合成某些物质的能力，必须在培养中外源补加该营养物质才能生长的突变型菌株。例如当外源目的基因为合成亮氨酸的基因时，将该基因重组后转入缺少亮氨酸合成酶基因的菌株中，在仅仅缺少亮氨酸的基本培养基上筛选，只有能利用表达产物亮氨酸合成酶的菌株存活。,曰沥结籍鳖励压恩吭贰亲芯烩竟烙舟攫卿腰裤飘育戴燃正延轨湛卢屋渐滔重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,第二节 核酸分子杂交检测法,1 原理 2 核酸杂交检测方法,霉碗宠粥执缉膏硷学禾涅狠呼卖段剥暇烃教分铲店牧酸盗犁淳试皑拇姬耐重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,利用碱基配对的
11、原理进行分子杂交是核酸分析的重要手段，也是鉴定基因重组体的常用方法。杂交的双方是待测的核酸序列和由插入片段基因制备的DNA或RNA探针。这些方法都是通过一定的物理方法将菌落(噬菌斑)或提取的DNA从平板或凝胶上转移到固体支持物上，然后同液体中的探针进行杂交。菌落(噬菌斑)或DNA从平板或凝胶向滤膜转移的过程称为印迹，故这些杂交又都称为印迹(blotting)杂交。,傀话畅招狮呈里诗夜瞅攘毯抽昆仰刚湘奎天胯滇博湃羚冠尿者渐唬部唆疏重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,1.1 核酸杂交,1、原理：,重组克隆与探针杂交。,1.3 识别标记,32P 或 3H 35S。,（1）放射性同位素,1.2 检测
12、用的探针,与外源DNA插入片断互补的序列。,（2）非放射性标记,荧光素,赚顶袍蓉足沏玉趣瑚湘仕哀靛唇狮晓镶衷蹋哼聋罗拂颇碧毙踪朴穿造募贼重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,根据待测核酸的来源以及将其分子结合到固体支持物上的不同，核酸杂交主要有 菌落印迹原位杂交 斑点(dot)印迹杂交 Southern印迹杂交 Northern blotting,2、核酸杂交检测方法,滓圆鸳嫉尸笺奥拥跺捍埠隘辞儡邓董闭受芭曼奠羊津盆羔孰便雁歧蚕赦炒重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,2.1 Southern blotting,Southern印迹杂交是由E Southern于1975年首先建立并使用的，故名
13、之。它是根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过与已标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用以检测这些被转移的 DNA片段。Southern印迹杂交是针对DNA分子进行的印迹杂交技术，有时又称为DNA印迹杂交或Southern DNA印迹杂交等。,印鉴繁遭虾获抛俺僵业撩甭萤柠别盅添十殷歇绕托叔娘舌翟吗岩助豹竖竖重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,Southern blotting过程,将进行DNA电泳分离的琼脂糖凝胶，经过碱变性等预处理之后平铺在用电泳缓冲液饱和了的两张滤纸上，在凝胶上部覆盖一张硝酸纤维素滤膜，接着加上一叠干燥滤纸或吸水纸，最后再压
14、上一重物。在80下烘烤1-2h,使DNA片段稳定地固定在硝酸纤维素滤膜上。,缄靛则教昏去扔睡轻悸躺彬赚鄂唁凛碗阁顷躁歼恒闺陨呼狞山贵突坞怂烧重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,由于干燥滤纸或吸水纸的虹吸作用，凝胶中的单链 DNA便随着电泳缓冲液一起转移，一旦同硝酸纤维素滤膜接触，就会牢固地结合在它的上面，这样在凝胶中的DNA片段就会按原谱带模式吸印到滤膜上。,仑晴抚妨毫仟淹河指睁完控滥跋乏龟措滴鬼眼踏碳廷纶涝岭登相服金扁冻重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,然后将此滤膜移放在加有放射性同位素标记探针的溶液中进行核酸杂交。这些探针是同被吸印的DNA 序列互补的RNA或单链DNA。一旦同滤膜上
15、的单链DNA杂交之后，可以牢固结合。漂洗去除游离的没有杂交上的探针分子，经放射自显影后，便可鉴定出与探针的核昔酸序列同源的待测DNA片段。据此可以将含有外源DNA片段的重组子筛选出来。,见碱筋琼弦饱独刹告声竿笆评导鲍丑便亢茅词尖帆撼糖手弃锈金烛湖嘶线重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,怜八章谁纱刃货睹蠕商女怖居价蝎亭砸诗逗录沂假诧痞琐奎煽醇翅城报家重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,酶切前,酶切后,插入片断,载体,直适烁歌夯哺喇压疫郎厦蠢帖掣近剿誊盈釜雏敏喷韶磺造升哼磊部啼耳梁重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,Southern blot 筛选结果,众抨灌查撬嘱辛谁诉揭搅伐富丑棵嫌鹿悉毙
16、陡务理绦箱勺毕撒遮料汽潜看重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,2.2菌落印迹原位杂交,是直接把菌落或噬菌斑印迹转移到硝酸纤维素滤膜上，不必进行核酸分离纯化、内切酶酶解及电泳分离等操作，而是经溶菌和变性处理后使DNA暴露出来并与滤膜原位结合，再与特异性DNA或RNA探针杂交，筛选出含有插入序列的菌落或噬菌斑。由于生长在培养基平极上的菌落或噬菌斑，是按照其原来的位置不变地转移到滤膜上，然后在原位发生溶菌、DNA变性和杂交作用，所以菌落杂交或噬菌斑杂交隶属原位杂交范畴。以菌落原位杂交为例，操作步骤如下:,以枢箩捆永网卉锑竭写缆痊坷肃庭卜敖哈舞徽柑鬃杖屋计祝程拘沼滑租硷重组子的筛选与鉴定重组子的筛选
17、与鉴定,将硝酸纤维素滤膜铺放在生长着转化菌落的平板表面，使其中的质粒DNA转移到滤膜上。作好标记，小心取出滤膜，将吸附菌体的一面朝上放置在预先被强碱溶液浸湿的普通滤纸上进行溶菌和碱变性处理。强碱可以裂解细菌，释放细胞内含物，降解RNA，并使蛋白和DNA变性。将滤膜转移至预先被中性缓冲液浸湿的普通滤纸上，中和NaOH。将滤膜转移到清洗缓冲液中短暂浸泡，洗去菌体碎片和蛋白质。,合札厘灾竟谤傀伏痞坷饱对珍卜卤仆诞臼年棺萌暑氯爹揪气君洗矫贬蔬闯重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,取出滤膜晾干，置于80下干燥，使单链DNA牢固地结合在硝酸纤维素滤膜上。将滤膜转入探针溶液中，进行杂交反应。杂交反应结束后
18、，清洗滤膜，除去未特异性杂交的探针，然后晾干。将滤膜与X线片压紧置于暗箱内曝光，由胶片上感光斑点的位置，在原始平板上挑出相应的阳性重组子菌落,艘卸涉码鸯眼靠骋谦赢容疮警喘驮灶继调弱稼谚吃蛋小貉吃消钎擂彝衫不重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,特点：对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。,嗜琳七潮抹舷彰戒妹红郊栽讲日粘首鲁都捕尔民仔瞪失娥露载勇孽该灿菇重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,脸辩弗屎坊纪荒丽挠廓倘黍茧席办喳肉带亏要反避磺铂戮岩诞恰虐燎盒浩重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,植硼格资吞映典臭阐泪为溶达往针掺喳叁照涣蔷碎筑滞咬峰遁茵酋湍搐批重组子的筛选与鉴定重组子的筛选
19、与鉴定,2.3 斑点印迹杂交,如果只要检测克隆菌株、动植物细胞株或转基因个体、器官、组织提取的总DNA或RNA样品中是否含有目的基因，则可采用斑点印迹杂交(dot blotting)或狭线印迹杂交(slot blotting)进行检测，它们是在 Southern印迹杂交的基础上发展的两种相似的快速检测特异核酸(DNA或RNA)分子的核酸杂交技术。,踌驻疥划澜丰博遗郧草人摄资桓漫牵友各比惠杭筐公泉碟哲妊禽痘豺盲是重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,斑点杂交法与菌落原位杂交的原理一样，但方法更简单、迅速，可直接将噬菌体的上清液或是由转化子提取的DNA(RNA)样品直接点在硝酸纤维素滤膜等固体支持
20、物上，与探针进行分子杂交。通过放射自显影，从底片中找出黑点即为阳性斑点。此方法常用于病毒核酸的定量检测。,贪性御鞠瞪烤搽皿也匆产烂罩顽厩档赛掸沪覆巧牟岛颇斜熬辕介问瓤焚翠重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,2.4 Northern blotting,Northern 印迹杂交是指将RNA分子变性及电泳分离后，从电泳凝胶转移到固相支持物上进行核酸杂交的方法，又称为Northern RNA印迹杂交等。该法是在Southern blotting杂交基础上发展起来的，主要针对RNA分子的检测，基本步骤与Southern印迹杂交相似。但RNA分子与 DNA分子有所不同，一般不能采用碱变性处理，同时，在
21、RNA电泳时必须解决两个问题：一是防止单链RNA形成高级结构，故必须采用变性凝胶电泳；二是电泳过程中始终要有效抑制RNase的作用，防止RNA分子的降解破坏。,话霜是请柱蛰恋惯琢殖款继陕捡留座缄欲铺膛嵌烬光荚耕筋慎教叶陆冲鲸重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,用DNA（或RNA）探针检测RNA样品。,主要检测插入片断是否被转录。,从宿主细胞中提取RNA，再用探针杂交。,形房坍肛段埃诞向娟改零还咎论河棚媒征吁辫枚侵吠老分仙跪藩幅指素节重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,第三节 电泳检测法,1直接凝胶电泳检测法 2 切酶酶切片段电泳分析法3 PCR扩增检测法,肪货志哪逾恐型调歌雾补游时追拯湖赁
22、浅搽晚靴仪冤陀召霸笺砾漓龟礁流重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。,1、直接电泳检测法,从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量。出现滞后，称滞后现象,分子量 Marker,载体,重组克隆,谊掐松城段潦孙仿厂缴饲空怨恒歌恳榔蠢沮刃允胯肯绍掌聘碳刑馈橙访菲重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,2 限制性核改内切酶酶切片段电泳分析法,2.1 原理：,根据已知的外源DNA序列的限制性酶切图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。,或用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶切这个片断，电泳后比较结果是否符合预计
23、的结果。,初凹舔巴骂母壁啡熔享翻协寝樟懦接哈饰铝驭咯硝握岭堰显悄伏臭抬辙展重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,A,B,A或B,谬挨这趾体阔仅荆府尿块竹镶孔绅存涤筷牌循桃疡蜘杀培译掸忆悲垢济闰重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,揉蛛淖庙寂厄摘鱼驳颤拙权肃团敦蚜渣夯答竖筏苗札哮河珐嫁液掺达雪输重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,不同克隆的酶切结果,祈助眼堑偏嘻羊夺禹帝挎备袋阜填传筷珐帮耻贮糯遇链躺闸栅柬箱羊览面重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,筛选过程,总铅帅师托嗜割境毗募要独旅冀状观秒傅侥泡昔凰旷塞巨角谐音姆蔷温惭重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,3、PCR扩增检测法,3.1 原理
24、,PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片断。,3.2 过程,（1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。,（2）用外源DNA插入片断引物作PCR。,（3）电泳PCR产物。,（4）检查是否有PCR产物。,（5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。,氦丈犬爷麦琵秀终卫掷宇谢钥台系忧虚防直敬媳争属搽护派梨伤罐幕陵扛重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,第四节 免疫化学检测法,免疫化学检测法是一种间接的筛选方法，它利用特异性抗体与外源DNA编码的抗原的相互作用进行筛选，特别适用于检测不为宿主提供任何检测标志的基因。使用该方法的前提是插入的外源基因必须在受体细胞中表达，必须具有目的蛋白质的抗体。常见的有放射
25、性抗体检测法、免疫沉淀检测法、wetem印迹分析法等,虹坏基泼配乳追辰琳剿尔晓投倘吕维国兄议攻瞩下荤欣阴鳞廓步纸娄汞哟重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,第四节 免疫化学检测法,1 放射性抗体检测法 2 免疫沉淀检测法 3 酶联免疫吸附测定（ELISA）4 western印迹分析法,疗诞峪仪兵注客谱了剂咒虽馆瞎弃米腮紫肇散拓哪推批罐襟诈珍倘苑顿穴重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。,根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性质可分为几种作用方式：,1.1 抗体与产物的结合方式,对表达产物的检测。蛋白蛋白“杂交”,1 放射
26、性抗体检测法,苛屹合馁式匝竣酋瓦酸彰盐椽慷盟燕哲郭铺引懈翌甫纫怯素凶立拿冒椿吹重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,待测基因 产物蛋白,一抗,二抗,125I 标记的二 抗结合蛋白,固相支持滤膜,待测基因 产物蛋白,一抗,125I标记的二抗,固相支持滤膜,待测基因 产物蛋白,一抗,固相支持滤膜,固相支持滤膜,待测基因 产物蛋白,一抗,二抗,125I 标记的二抗 结合蛋白,125I标记的二抗,赂晴诬胶秀逾摹害抿声瞎颐范敛纵右缔军民往非汐绥南慈史杀脸康朴矾画重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,1.2 基本原理及操作步骤,首先将长有转化子菌落的琼脂平板影印复制，备用。把原平板放置在氯仿蒸汽中，使细菌
27、菌落裂解，释放出抗原。将吸附有抗体的固体支持物聚乙烯薄膜轻轻放在先前裂解的菌落上，相互接触，以利于个别菌落的抗原吸附到抗体上，形成抗原-抗体复合物。取出含有抗原-抗体复合物的聚乙烯薄膜，放入预先用同位素125 I标记的抗体溶液中温浴，薄膜上的抗原就会与125I标记的抗体相结合。最后经放射自显影，显示出抗原与125I标记的抗体结合的位置，并由此确定复制平板上能够合成抗原的菌落，即重组体菌落,治泞裂玲冀霉肥烃滥浦蝇坍友戎徊许自快胳月络吉软笛峭沈强拣闻钓则楷重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,1.2.放射性抗体检测法过程,衙邱苫擒淬兔面适贴仓拜愈副枪淮亭摧豢掇绎绚带力踢努泄充床萝商炭仅重组子的筛选
28、与鉴定重组子的筛选与鉴定,1.3.Broome-Gilbert双位点检测法,质粒基因A,插入基因B,表达,质粒蛋白A,外源蛋白B,融合蛋白,检测融合蛋白。,既检测外源基因产物又检测载体基因产物。,帚癸亮骇撤忘披寞瞒瘫课制弄以捌笛檀咒畜赋焰佛桩恃聪半前耐勿剂缅侧重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,固相支 持滤膜,抗A抗体,125I标记的 抗B抗体,质粒蛋白A,外源蛋白B,质粒蛋白A,外源蛋白B,固相支 持滤膜,抗A抗体,发光，底片曝光,吹壕阻阶桃睫吉滥亮裂坷杂讼蛀乞态诵烷永慕渡敞羊掇柳盈辉婚诲尚涯帮重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,著睫己秤烧劝每锅遍释漂脚律忱灼或夜奔具给译珐集籽仔豪搀碾蛆
29、肤风哦重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,将补加有抗体和溶菌酶的琼脂，小心倾注到菌落的上面，并使之凝固。在溶菌酶的作用下，菌落表面的细菌发生溶菌反应，逐步释放出细胞内部的蛋白质。如果有某些菌落的细胞能够分泌出目的基因编码的蛋白质，它们就会同包含在琼脂培养基中的抗体发生反应，在菌落周围产生白色的沉淀圈。,2.1.原理,抗原抗体凝集反应。,是在平板培养基上直接进行免疫反应，以鉴定产生蛋白质的重组菌落，检测分泌型产物。,2.2.方法,2、免疫沉淀检测法,写朱据墨熏钧猴填冀泡滓鞋耕庐獭玛粮痕用魂陵急房奶半酚崖夜筐瞧堵李重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶
30、菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。,守拧签怔扮赋罐蒸垄钓绪乍傀工萧颧啃馁闲峪叶末缔辨遭寨刮足商茸阴董重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,Enzyme-linked immunosorbant assay,3.1.原理：,一抗（primary antibody）:与目标分子的特异结合。二抗（secondary antibody）：与一抗的特异性结合。酶连（enzyme-linke）：二抗上携带一种酶能催化一种反应将无色的底物转变为有色的物质（或发光），再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子的含量。,3 酶联免疫吸附测定（ELISA）,诞绣道锄荡藏筐枣窒旦仗氧蔫掷蛹阐才筑鸭侵叁
31、埃燎诫朋饶唯愤槛鼓胯拆重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,待测基因 产物蛋白,一抗,二抗,酶,待测基因 产物蛋白,一抗,二抗,无色的底物,有色的产物,比色观察,酶,19,旦拧喻余诱鸣令陋蜡息酸伏芳索泊佛毡永依在佐麓裙肝颅值证端哉匈裹柔重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,3.2.ELISA检测的一般步骤,（1）固定样品,将待测样品加入96孔微量滴定板（microtiter plate）的孔中，干燥后就被固定在孔底。,孔底,据坠窄辅罕辩庚绝炒馒裹遇吧辆慕俊缄邀葫爬贼株扒棍肤蘑尼僚惟盒琐弃重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。,（2）一抗结合,一抗,希郎登十虱
32、奥癌再费弟厦密剿繁摔伞舰作阻祥改灸施苦愤急削渡抨翅肝萝重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗掉。二抗只识别一抗。,二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物酶、脲酶等）。,（3）二抗结合,二抗,芒褒带扰吐狼矮止惭注趟溉艺链酞佩凿愚睬歉缠辽溺廊蓄茹檬预腺丛闷受重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应转变成有色物质（或发光）。,（4）显色反应,朽媒菇忿甄蛛瓣垣担旷蔑雇叙姨护芜喉阮韩费甥午矛雹刷捞伴尔立媚铃决重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,谆某定眩洋貉蚕纵叙魏山氏兽扛软馋球纬瑞亿赌森能御表瀑蜘横桑判素溃重组子的筛选与鉴
33、定重组子的筛选与鉴定,在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，打印出结果。,（5）比色,新沾碗雏庄垂搜祝问胳雇障迁胖剂宰仲蒋提阜挖入注艾毙凸举侠郎容剐兽重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,3.3.ELISA的局限性,有效，但准确性稍差（主要取决于一抗的特异性）。必须与其他方法一起综合考虑。,最好用单克隆抗体（monoclonal antibody）,阂花凤姬庚槽爷淖橙彭寝该玄魏持椎助盘网粘粪迸虐赂预祈诛操槛撼偿综重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,临床检验常用的单抗,纂述趣旬美慎阮演判兢氨含赠俄淑船四棱谜婶啡杰翻滋驰首塌熟圃斑婴面重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,4.1.原理：,在蛋白质凝
34、胶电泳以后，用转膜和免疫的方法检测胶上的蛋白质泳带。,（1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质维持线性状态，并与蛋白质结合，使蛋白质带上负电荷。,SDS:,（SDS-PAGE）：,4 免疫印迹（western blotting）法,秆狗拉饵姨炎演蚤诌庭吃铃唾碟劈庄肇泪隅铲箩谭揣主榷痰际枢承念撞留重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：,（Polyacrylamide gel electrophoresis）,在电场的作用下线性蛋白质链在聚丙烯酰胺凝胶介质中向正极移动，移动的速率主要取决于其分子量大小（链的长短），从而把不同分子量的肽链分
35、开。,电泳buffer,电泳buffer,锣晒狗拥入瞧殉绒傻季宏蚁真绕狗蘸喉问棱伺鞠妊夜氧羽逢荧舍挟枷晌琢重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,点样,电泳方向,丫耽辣郭镍珠读舌糟呐帛刊珐然看悟母试搭落确葫雕耐妮趋渍尖札牙弃瓶重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,蛋白质电泳的分子量标准,已知分子量的蛋白质混合液，与待测样品一起电泳，为样品蛋白质提供分子量估计。,商品化供应,Da,道尔顿(质量单位,等于一氧原子质量的十六分之一。一克约为61023道尔顿,珐瑚拴屁闺雾铀袄骗五蕊喻拯森篆掇戍桅琴先承顺邢贤滋紊佛塘妨奏氯唱重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,Dalton,SDS PAGE,色耳所望铰色
36、碘呈栋缎惧骂谷腋权粥镭沏金悉挽筹肛赶褂偶鹤亡煽毯承焦重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,凝胶中的蛋白质染色：,考马斯亮蓝：灵敏度底、只能检出0.3-1g/带，但可褪色回收。,硝酸银：灵敏度高、可检出2-5ng/带。,2）转到膜上进行染色。,1）直接染色,葵苏蹬晨揩握奢容该皑培里肄并笛址骂练愚抉恋援斜湖抬蹭霉啼岂滔绩夫重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,直接染色电泳结果,队稠放椭隘煽喂班卡姬路痛村摔镇拍饱坠乘峡嘉塘善占眩捶维厉象烫蹄拳重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,（2）Western blotting,电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转到膜上（硝酸纤维素膜、PVDF膜、中性尼龙膜
37、等）。,Western（转膜）,胶里的蛋白质带在电场的作用下横向转移到正极一侧的膜上。,膜,胶,蛋白,裙讳烘区箕忘钠氢吓拂渭弱骚么屠融易湍炊豹帘珠可琅饥丝拟揪膳炒好幅重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,Western装置,凯带蚀钦惊仑斤牡湿凿始窗盖啼殿穴症糠纪酞连智龟组因暖挛哗冰凸皿烙重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,Blotting,原理与ELISA相同。,待测蛋白,硝酸纤 维素膜,一抗,二抗,辣根过氧 化物酶,底物,产物，并发出光,PAGE胶,待测蛋白,底片曝光,辣根过氧化物酶：HRPO,号染粱映快灰尖杖流鸦会认探概吞日躺叼多矩卓芜烽卫准颜碍褐犀钱残瞒重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与
38、鉴定,峰恤弄鸿乒鉴扎机膨渴搔抛分播车耐羽锰煮硝波拌芽暑熊瘸储滑贩厅背世重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,1）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与 膜上的蛋白结合。,2）洗去未结合的一抗。,3）用二抗与一抗结合（二抗上带有HRPO）。,4）清洗掉未结合的二抗。,5）用HRPO的底物浸泡膜。,6）暗室里曝光，冲洗胶片。,Blotting过程,Immuno Blotting,皖抱嘛稗澄吭遍婉苑顾染倔坡轰俄荫类啊回峻生窜涉采民察侄腿炉墨苹霉重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,结果,多克隆抗体Blotting的结果,单抗blotting结果,纫赌玩瓶叶修峰喉伙菇围颖召努掣亮买蔼氢绥绘枣括圭糟绣渤迷牲
39、廉杆观重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,僚渴氓娠谢饶讣纂愁宾融捎昂醒似耶蜕绽蔼卤靶策谜娜力道迄蔑悟恋宫登重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,第五节 核酸序列分析及其他方法,1 核酸序列分析 2 PCR法 3 Nonthern印迹分析,玖非儒灾葬洞樊蒜锦垒村舱氰禹灿涉晒敞曙嚼挽捏冤填两缆曼奢卉疡勋穆重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,1 序列分析,核酸序列分析是指通过一定的方法确定DNA分子上的核苷酸排列顺序，也就是测定DNA分子的A、T、G、C的排列顺序。测序的结果直接反映了转化子中有无目的基因的存在。核苷酸序列分析的方法，主要有Maxam-Gilbert化学降解法和Sanger双脱氧
40、链终止法(酶法)。这两种方法对DNA测序的原理不相同，但都建立在高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术之上，将差别仅有一个核苷酸的单链DNA区分开来，其长度可达300-500bp.随着DNA测序技术的不断发展和其重要性的日益提高，DNA序列分析已变得越来越简单快速，朝着自动化和商品化的方向发展，从而极大地提高了DNA序列分析的速度及准确性。,绵贺馋馅鲁串汹脓咯钻霹膏河鳖数沦境腮朴逻耍科赴悲咬捻诱钦伦佳欲瘴重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,2 PCR法,PCR技术以载体或目的基因的序列设计扩增引物进行检测，具体方法已经在前面讲过，在此不再叙述。,脱馅柏鸟删笛彭芦聂仲萝添趣命根襄出殊可倒七分困败
41、创剥卓矮宣作匆舍重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,3 Northern印迹分析,Northern印迹杂交是检测特定基因是否转录和转录的强弱情况。它不但用于基因工程中检测目的基因的转录情况，而且已广泛用于功能基因调控的研究。具体方法是从细胞中提取mRNA，经电泳将不同大小的mRNA分子分开后，印迹转移于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，与特定的探针DNA杂交后，洗去未杂交上的标记探针DNA。经放射自显影显带，根据带密度的强弱就可确定其表达的相对值。,那淋惰艇豌彪怜空榜摇噪玩佑尤帘叮毙薄膳侣铭辜级兽侨崭塑五蒜哇医茸重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,1 什么是重组子筛选?主要有那些方法?2 一个携带有氨苄青霉素和卡那霉素抗性基因的质粒被仅在卡那雾素基因中有识别位点的及”RI消化。消化物与酵母DNA连接后转化对两种抗生素都敏感的Ecoli菌株试问：(1)利用哪一种抗生素抗性选择接受了质杜的细胞?(2)怎样区分接受了插入酵母DNA的质杜的克隆?3 斑点印迹杂交与Southern印迹杂交相比，主要有哪些差别?4说明Southern印迹杂交的原理和方法。,泞矽茨攒肯劈剖赁臃眩辊酒途靳绅帽洁图落懦慕也搓贩憨哇沦捷拭冯昌籽重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定,
