基因工程简答题总结.docx

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1、基因工程原理复习题思考题5、 简单叙述同尾酶和同裂酶的差别。同尾酶：来源不同，识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端，连接后不能被相关的酶同时切割。同裂酶：识别序列相同，切割位点有些相同，有些不同。分完全同裂酶和不完全同裂酶（PS:完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。不完全同裂酶：识别位点相同，但切点不同。）6、 连接酶主要有哪些类型？有何异同点？影响连接酶连接效果的因素主要有哪些?类型：DNA连接酶和RNA连接酶异同点：相同点：都能以DNA为模板,从5向3进行核苜酸或脱氧核甘酸的聚合反应。不同点：DNA聚合酶识别脱氧核糖核苗酸，在DNA复制中起作用;而RNA聚合酶聚合的是核糖核昔酸，在转录中

2、起作用。试分析提高平端DNA连接效率的可能方法。（传说中的网上答案）1.低温下长时间的连接效率比室温下短时间连接的好。2、在体系中加一点切载体的酶，只要连接后原来的酶切位点消失。这样可避免载体自连，应该可以大大提高平端连接的效率。3、足够多的载体和插入片段是最重要的。4、平端的连接对于离子浓度很敏感5、尽可能缩小连接反应的体积6、建议放在四度冰箱连接两天效率更高比14度好7、 基因工程中常用的DNA聚合酶主要有哪些?1）大肠杆菌DNA聚合酶2、 ）Klenowfragment3）T7DNA聚合酶4）T4DNA聚合酶5）修饰过的T7DNA聚合酶6)逆转录酶7)TaqDNA聚合酶第四章基因克隆的载

3、体系统1.作为基因工程载体，其应具备哪些条件？具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性(可转移性)；具有合适的筛选标记；具有较高的外源DNA的载装能力；具有多克隆位点(MCS);具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。3、 载体的类型主要有哪些？在基因工程操作中如何选择载体？基因工程中常用的载体(VeCtor)主要包括质粒(PlaSmid)、噬菌体(Phage)和病毒(VirUS)三大类。这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。4、 质粒转化原理,影响转化率的因素有哪些？A、化学法（CaCI2法）转化原理：是Ca2+与细菌外膜磷脂

4、在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内（感受态细胞1B、电穿孔转化转化原理：将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场，在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内。影响转化率的主要影响因素：1）载体本身的性质及其空间构象：超螺旋构象转化率最高；2）插入片段的大小：插入片段越大，转化效率越低；3）受体细胞的类型及预处理；4）转化方法：电击法高于化学法。5、重组体分子的选择方法主要有哪些？并简单阐述其原理。从总体上看，重组体分子的选择与鉴定方法基本上可以分为如下几

5、个类型：（1）基于载体遗传标记检测法在构建基因工程载体系统时，载体DNA分子上通常携带了一定的选择性遗传标记基因，转化或转染宿主细胞后可以使后者呈现出特殊的表型或遗传学特性，据此可进行转化子或重组子的初步筛选。（2）基于克隆DNA序列检测法Southern印迹杂交：根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过与已标记的单链DNA探针的杂交作用以检测这些被转移的DNA片段。（3）基于外源基因产物检测法如果目的基因产物能降解某些药物使菌株呈现出抗性标记，或者基因产物与某些药物作用是显颜色反应，则可根据抗性或颜色直接筛选含目的基因的克隆子。第五章基因的克隆一

6、般方法1.基因的克隆方法主要有哪些？并阐述其克隆原理（至少3种，都是书上找的，自选哈，建议必选DDRT-PCR和SSH,原因请看下题）？1）差减杂交（SH）通过DNA复性动力学原理富集目的基因序列，并以此构建减数文库的方式来进行目的基因分离克隆的。2 ）抑制性差减杂交（SSH）SSH的核心技术是抑制性PCR,它是一种将检测子CDNA单链标准化步骤和消减杂交步骤结合为一体的技术。其中标准化步骤均等了检测子中的CDNA单链丰度，而消减杂交步骤去除了检测子和驱赶子之间的共同序列，使检测子和驱赶子之间不同的序列得到扩增。3 ）差异显示PCR（DDRT-PCR）利用真核生物mRNA结尾处有POLY（八）

7、结构，在其3端设计象5-TllGA样引物，该引物可与mRNA总数的十二分之一结合,从而使这部分基因得到逆转录，同时结合5端的随机引物（20条10-mer）,可以使不同长度的基因得到扩增。4 ）DNA代表性差异分析（DNARDA）代表性差别分析是通过突变型（驱赶DNA,driverDNA）与野生型（检测DNA,testerDNA）基因组之间的差异来分离和鉴定突变基因的方法。5 ）扩增限制性片段长度多样性（AFLP）基因组DNA经过限制性内切酶消化后，产生粘性末端。使用人工合成的短的双链接头，该接头一端具有同样的内切酶识别粘性末端，互补连接后成为DNA模板。接头和与接头相邻的酶切片断的几个碱基序列

8、作为引物的结合位点。2、简单阐述差异显示PCR克隆基因的原理及其优缺点，有何应用？主要原理利用真核生物mRNA结尾处有POLY（A器构,在其3端设计象5-TllGA样引物，该引物可与mRNA总数的十二分之一结合，从而使这部分基因得到逆转录，同时结合5端的随机引物（20条10-mer）,可以使不同长度的基因得到扩增。优点：简便、灵敏、高效、省时，能快速显示mRNA的组成。所需的mRNA量少。各样本mRNA的差异可同时进行比较。扩出的CDNA可直接用于测序、文库筛选等。缺点：假阳性条带多，对低丰度的基因表达不容易检测。工作量大。无法定量研究。扩出的条带往往是3端比较短的UTR区的一段序列，提供的信

9、息较少。利用该技术，目前已有越来越多的差别表达基因得以分离和鉴定，在分子生物学和基因工程研究领域发挥了极大的作用。（P221）3、抑制性差减杂交的原理与应用。原理：SSH的核心技术是抑制性PCR,它是一种将检测子CDNA单链标准化步骤和消减杂交步骤结合为一体的技术。其中标准化步骤均等了检测子中的CDNA单链丰度，而消减杂交步骤去除了检测子和驱赶子之间的共同序列，使检测子和驱赶子之间不同的序列得至U扩增。应用：基因突变体的研究：如基因的表达与不表达；基因时空表达的研究：如根、茎、叶；不同处理条件下的基因表达差异：如施肥与不施肥、光照与不光照。4、酵母双杂交技术、噬菌体表面展示技术的原理。A.酵母

10、双杂交技术原理：大部分真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分隔开的结构域，一个是DNA特异结合域(DNA-bingingdomain,BD),一个是转录激活域(transcriptionalactivationdomain,AD)这两个结构域各具功能，互不影响，但一个完整的、具有激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域，否则无法完成其激活功能。不同来源的激活因子的BD区与AD区结合后则能特异地激活BD结合基因的表达。B.噬菌体表面展示技术原理：当外源DNA片段插入丝状噬菌体基因组的一个外被蛋白基因中时，如果两者读码框结构保持一致,这个外源DNA片段所编码的产物可与此外被蛋白一

11、起以融合蛋白的形式表达，并显示在噬菌体的表面。利用抗此外源基因编码产物（多肽或蛋白）的抗体，通过亲和纯化，就能从大量的噬菌体中富集、分离出含有所要的基因的融合噬菌体。然后，通过基因扩增，得到大量所要的目的基因。5、T-DNA标签法克隆基因的一般技术路线。农杆菌侵染植物得到转化苗，筛选出表现某种突变性状的个体。建立突变体基因组文库及野生型基因组文库.用T-DNA片段做probe筛选突变体文库，获得阳性克隆。用获得的阳性克隆筛选野生型基因组文库，获得野生型的阳性克隆。把阳性克隆转化突变体进行功能互补及进行测序分析。第七章克隆基因的表达1、通过比较，分析大肠杆菌表达系统和酵母表达系统各有何优缺点。大

12、肠杆菌表达外源基因的优势：全基因组测序,共有4405个开放型阅读框架；基因克隆表达系统成熟、完善；繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定；被FDA批准为安全的基因工程受体生物。大肠杆菌表达外源基因的劣势：缺乏对真核生物蛋白质的复性功能；缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统；内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白；周质内含有种类繁多的内毒素。甲醇酵母表达系统的优点：具有强的受严格调控的AOXl启动子表达蛋白的翻译后的加工和修饰营养要求低，工业化生产成本低可高密度发酵表达蛋白可存在于胞内和胞外酵母表达系统的缺点：酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题（这个找不到，百度的）2、如何提高克隆基因的表达水平

13、？1表达载体的优化设计；2提高目标基因mRNA和目标基因产物的稳定性；3X密码子偏爱性；41表达环境条件的优化。3、克隆基因目的蛋白的表达的形式主要有哪些类型？表达蛋白按溶解特性通常包括：不溶性蛋白和可溶性蛋白两类，具体包括如下几种结构形态：包涵体型蛋白、融合型蛋白、分泌型蛋白5、表达载体和基因工程一般克隆载体在元件构成上有何差别？表达载体：启动子；终止子；核糖体结合位点（SD序列）；筛选标记；复制子（质粒拷贝数）；多克隆位点克隆载体：筛选标记；复制子（质粒拷贝数）；多克隆位点第八章植物基因工程2、外源基因导入植物的方法主要有哪些？物理方法：电击法、基因枪法（bi。IiStic）、显微注射法、

14、微激光束法化学方法：PEG介导法、脂质体介导法生物学方法：农杆菌介导法、花粉管通道法四.问答题（一）简答4 .某学生在用EcoRI切割外源DNA片段时，出现了星号活性，请分析可能的原因。答：盐离子浓度不对，温度不对，甘油浓度过高。5 .在序列5GAACATATGGAGT-3中含有一个6bp的11类限制性内切核酸酶的识别序歹IL该位点的序列可能是什么？答：回文序列是5-CATATG-3。6 .下面几种序列中你认为哪一个（哪些）最有可能是II类酶的识别序列：GAATCG.AAATTT.GATATCxACGGCA?为什么?答：GATATC和AAATTT,因为它们是回文序列。7 .用KIenoW酶填补

15、的办法可使5黏性末端转变成平末端。这种方法常使DNA上的某些限制酶的识别位点消失。请问,对于下列限制酶，用这种方法处理会不会使它们的识别序列都消失？BamHI(GIGATCC).TaqI(TlCGA)xBssHII(GICGCGC)o答:BssHII不会。四、问答题2 .DNA连接酶的作用特点有哪些?连接反应需要在一条DNA链的3末端具有一个游离的-0H,而另一条DNA链的5末端具有一个磷酸基团(-P)的情况下，才能发挥其连接DNA分子的功能作用，而在末端带有5-羟基和3-羟基;5-磷酸和3-二脱氧核昔基团的两个DNA片段之间不起连接作用。连接反应中需要ATP或NAD+和Mg2+为辅助因子和激

16、活因子；DNA连接酶不能够连接两条单链的DNA分子，被连接的DNA链必须是双螺旋的一部分。DNA连接酶只封闭双螺旋DNA骨架上的缺口(NiCk),即在双链DNA的某一条链上两个相邻核昔酸之间失去一个磷酸二酯键所出现的单链断裂，而不能封闭双链DNA的某一条链上失去一个或数个核甘酸所形成的裂口(Gap3 .影响DNA连接酶连接反应的因素主要有哪些?答：1)反应温度：最佳反应温度37。(：，但黏性末端之间退火形成的氢键结合不稳定，连接黏性末端的最佳温度,一般认为420。C比较合适。2) DNA片段末端：不仅要考虑反应体系中DNA末端的总浓度，还要考虑载体与插入片段的末端浓度的比例。原则上应保证一个D

17、NA分子的末端有较高的几率与另一DNA分子连接，减少同一个分子两个末端之间的自身连接。载体与插入片段3:11:303)连接酶浓度：平末端DNA分子的连接反应，最适酶量大约是12单位；而黏末端DNA片段间的连接，在同样的条件下，仅为0.1单位时,便能得到最佳连接效率。四、问答题1 .YAC载体具有什么样的？为什么在克隆大片段时，YAC具有优越性？答：(1)功能性DNA序列：来自于酵母的125bpDNA片段的着丝点序列(CEN4)来自酵母的自主复制序列(ARSl)f起始在酵母中的DNA复制。来自酵母的端粒序列，它是(5-TGTGGGTGTGGTG-3)的多拷贝重复,它对染色体的复制和维持是必需的。

18、在酵母中进行选择的标记基因，URA3(尿哪碇生物合成基因)和TRPl(色氨酸合成基因X寄主是这些基因的营养缺陷性，只有带有这些基因的转化体才能在选择培养基上生活具有细菌的复制起始点和选择标记基因。YAC载体通常含有CoIEl的Ori和氨莘青霉素抗性标记基因，可以在大肠杆菌中复制和繁殖，所以它也是一种穿梭载体。(2)优越性：YAC能够容纳长达上千kb的外源DNA,这是质粒和黏粒办不到的。大片段的插入更有可能包含完整的基因，在染色体步移中每次允许更大的步移距离，同时能够减少完整基因组文库所需的克隆数目。3.举例说明什么是穿梭载体？答：穿梭载体是含有细菌质粒和克隆的真核生物DNA片段的杂种质粒,有两

19、个复制起点和能在两种不同细胞中进行选择的选择标记，所以，很容易从一宿主转到另一个宿主(来回穿梭)。5 .什么是YAC?YAC克隆载体常出现哪些问题？答：YAC即酵母人工染色体(YeastArtificialChromosome)的缩写，是人工构建的染色体样大容量克隆载体，基本组成有着丝点、能在细菌和酵母中进行复制的复制起始点和选择标记及端粒。最大DNA克隆片段可达到2000kb.问题有：(I)YAC有嵌合现象，一个YAC中克隆的DNA片段可能来自两个或多个不同的染色体。在基因组文库中，嵌合体占克隆总数的10%60%o(2) YAC内部有重组现象，插入的DNA较大，序列发生重排，导致和原来染色体

20、的序列不一致，重组很难检出。(3) YAC还有缺失现象，影响YAC文库的代表性。(4) YAC结构和酵母天然染色体结构相似,使用常规方法不易将YAC和酵母天然染色体分开。(5)构建好的YAC转化原生质化的酵母菌，转化效率低。(6)建好库后保存方便，但要筛选某个基因时工作量大6 .什么是BAC?BAC载体的组成与优缺点有哪些？细菌人工染色体(BAC)是从大肠杆菌F因子改造构建而来的，能够携带大约300kb的DNA插入片段。载体具有F因子的复制起始点(OriS),可使载体维持每个细胞一个拷贝的水平。载体包括有4个维持DNA复制和拷贝数目的基因,repE,parA,parBandparCo具有一个抗

21、生素选择标记基因，和IacZf基因。在IacZ基因中组装有一多克隆位点，便于外源片段的插入和蓝白反应筛选克隆子。插入的DNA片段非常稳定，可以在大肠杆菌细胞中维持数百代，而且不易发生重组和从寄主细胞中丢失。主要缺点是每个细胞中的拷贝数少（12个），使得分离和筛选较为困难。7 .利用pBR322质粒插入失活分离带有外源DNA片段的重组克隆的原理是什么？外源DNA片段插入在pBR322质粒tetr基因的编码序列内（BamHI）位点，使该基因失活；体外重组反应混合物转化大肠杆菌ampstets菌株,并涂布在amp琼脂平板上，凡获得了pBR322质粒和重组质粒（AmPrTetS）的寄主细胞都可长成菌落

22、;将amp琼脂上的菌落原位影印在tet琼脂平板上生长，对比这两个平板的菌落生长情况，凡在amp平板上能够生长而在tet平板上不能生长的菌落，便是属于带有重组体质粒的转化子克隆；挑出这样的阳性克隆，扩增分离带有外源DNA插入片段的重组体质粒。8 .pUC质粒利用-互补作用筛选重组子原理是什么？答：PUC系列质粒载体是在pBR322质粒载体基础上改造来的，它用IacZ基因取代了pBR322质粒载体上的tetr基因。IacZ基因编码B-半乳糖苔酶的N末端1-63个氨基酸（-肽链）的DNA片段，在IacZ基因内组入了一个多克隆位点（MCS）,但不影响IacZ基因的功能。pUC载体的宿主（E.coli）

23、携带一个编码B-半乳糖苗酶C端序列的基因片段，它们本身用这个基因片段产生的-半乳糖首酶片段是无活性的，但它们可以通过-互补作用在体内相互弥补，即两部分产物可以结合形成有活性的-半乳糖吉酶。当pUC质粒引入大肠杆菌中，在含有指示剂X-gal和IPTG的诱导培养基上培养时，菌落成蓝色。如果在MCS插入外源DNA片段（基因），破坏了lacZ,基因的功能（插入失活)，不再产生-肽链，不能和宿主细胞产生的多肽片段形成有活性的B-半乳糖甘酶，形成的菌落是无(白)色的。因此，根据这种B-半乳糖昔酶的显色反应，便可以检测出含有外源DNA插入序列的重组体克隆。9.自然界中具备理想条件的质粒载体为数不多，即使是C

24、olEI和pSCI01这两个自然质粒也不尽如人意，通常需要进行改造。请问质粒改造包括哪些基本内容？答：基本内容包括：(1)删除一些非必要的区段及对宿主有不良影响的区段；削减载体的分子质量，使载体具有更大的容纳外源片段的能力。(2)加上易于选择或检测的标记。(3)限制性内切核酸酶的酶切位点的改造，便于外源基因插入到载体中的特定位置。(4)加上一些调控元件，有利于克隆基因的表达。(5)安全性改造，限定载体的宿主范围。10.质粒制备的基本原理？答：带有质粒的细菌细胞在SDS作用下裂解，并在碱性条件下使DNA变性。调节PH值至中性时质粒DNA首先复性,而细菌基因组DNA不能复性而与SDS-蛋白质形成复

25、合体，可以被离心沉淀除去。上清液中的质粒DNA分子可被酒精沉淀或其他方法沉淀纯化出来。四、问答题1 .入噬菌体DNA被包装到噬菌体的头部需要哪些基本条件？为什么？答：两个cos位点；线性DNA;分子大小在人噬菌体基因组的75%105%。2 .为什么野生型的人噬菌体DNA不宜作为基因工程载体？答：噬菌体DNA没有容载能力，因为噬菌体的头部对DNA包装的量是有限制的，不能大于基因组的105%,所以要将入噬菌体改造成载体，必须削减本身的分子大小；(2)野生型的入DNA对于一些常用的酶都有多个识别和切割位点，不便于克隆；(3)没有可供选择的标记；(4)野生型的人噬菌体具有感染性,因此不够安全。4 .入

26、噬菌体载体具有哪些优点与不足？答：优点：(1)人基因组中有1/3的非必需区可以被置换。改造成载体后，克隆的片段较大(可达20kb),而质粒载体的克隆片段只有几个kb;(2)用噬菌体入DNA作为载体，即使不进行体外包装，转染的频率也比质粒转化的效率高，包装后的效率就更高了;(3)人可通过溶原化反应整合到寄主染色体上，当不需要外源基因大量表达时,可让它以溶原性存在，若要表达，可通过诱导即可进入裂解途径，释放出大量的噬菌体，得到的重组DNA的拷贝数就会很多。缺点：(1)包装比较麻烦，包装率不稳定，购买包装蛋白的费用高；(2)没有质粒的用途广泛。5 .以置换型人噬菌体作为载体进行克隆时，为什么说能够形

27、成噬菌斑的就一定是重组体？答：改造的置换型噬菌体载体，重组入外源片段之后，总体积不能超过入基因组的105%,不能小于又基因组的75%0以置换型人噬菌体DNA作为载体，首先要分离左、右两臂同外源DNA重组。如果没有外源片段，仅是两臂连接，长度短于久基因组的75%,不能被包入噬菌体颗粒，就不能感染寄主，也就不能形成噬菌斑。如果插入了外源片段后，总长度超过人基因组105%后，也不能包入噬菌体颗粒，自然也不能形成噬菌斑。6 .M13系列载体具有哪些优缺点？答：M13克隆系统具有很多优点：(1)克隆的片段大：M13噬菌体的DNA在包装时不受体积的限制,所以容载能力大。有报道，有些噬菌体颗粒可以包装比野生

28、型丝状噬菌体DNA长67倍的DNA(插入片段可达40kb)。(2)可直接产生单链DNA,这对于DNA测序、DNA诱变、制备特异的单链DNA探针都是十分有用的。(3)单链DNA和双链DNA都可以转染宿主,并可根据人工加上的选择标记进行筛选。M13克隆系列的不足：(1)较大的外源片段插入后，在扩增过程中往往不够稳定。一般说，克隆的片段越大，发生丢失的概率越大。(2)单链载体分子感染的细胞中，往往是单链和双链混杂，分离双链1:匕较麻烦。7 .黏粒载体具有哪些特点与不足？答：主要特点有：柯斯质粒是含有人噬菌体COS位点的质粒载体。柯斯质粒具有质粒的复制子，进入寄主细胞后能够像质粒一样进行复制，并且能够

29、被氯霉素扩增。具有质粒载体的抗生素抗性基因的选择标记和克隆位点。插入片段的消化、连接及后来重组克隆的纯化与质粒载体相同。具有人噬菌体的包装和转导特性。与质粒载体转化细菌细胞不同，重组体像入载体一样，需体外包装后转染细菌。包装后形成的人颗粒用来感染大肠杆菌，重组DNA像入DNA一样注入细菌细胞，并以COS位点环化。由于缺乏人的其他DNA序列，环化DNA在细菌体内以质粒一样维持。简化了筛选。载体体积小,承载外源DNA片段大。如果载体的分子质量在5kb的话，得到的转导子几乎排除由载体自连的可能性,因为要被成功包装,至少要7个分子的载体自连。尽管如此,也是不能被包装的,因为COS位点太多了。重组体只有

30、达到32-45kb才能有效包装体外包装，这就提供了对重组体的正向选择。对转化体的选择是基于载体上的抗生素标记。感染后形成菌落，而不是噬菌斑。黏粒载体也有如下不足：如果两个黏粒之间有同源序列，可能会发生重组，结果会使被克隆的片段重排或丢失。含不同重组DNA片段的菌落生长速度不同，会造成同一个平板上菌落大4环一。另外由于不同大小的插入片段对宿主细胞的作用不同，会造成文库扩增量的比例失调。包装过程复杂,包装效率不稳定，代价高。四、问答题1 .怎样将T平末端的DNA片段插入到EcoRI的限制位点中去？答：可以化学合成一个连接子(linker),即一段长为IObp含有EcoRI识别位点的短的DNA片段，

31、然后与待克隆片段两端连接起来,如果用EcoRI切割这种连接片段，就会产生EcoRI的单链末端。这种片段就可以插入到任何EcoRI的限制性核酸内切酶位点中。2 .构建基因组文库时为什么要对基因组DNA进行部分酶切？(列举至少两条理由)答：部分酶切可获得长度适宜的片段(如获得中等长度的酶切片段)；部分酶切可保证切出的DNA片段内部依然保留了部分限制酶位点，便于后续的克隆分析。3 .什么是基因组文库(genomicIibrary)?它同遗传学上的基因库有什么不同？答：基因组文库是用基因工程的方法，人工构建的含有某一生物基因组DNA的各种片段的克隆群。包括下列过程：高分子质量染色体DNA的制备;体外重

32、组连接；将重组DNA导入寄主细胞并扩增；筛选。基因组文库同遗传学上所讲的基因库是完全不同的概念。基因库(genepool)是指在进行有性生殖的某一群体中，能进行生殖的个体所含总的遗传信息。在基因组文库的构建中，由于使用的载体不同，分为噬菌体载体和黏粒载体构建的基因组文库、YAC文库、BAC文库等。4 .什么是CDNA文库？同基因组文库有何差别?答：同mRNA互补的DNA称为cDNA0cDNA文库是以某一物的总mRNA为模板，在无细胞系统中，在反转录酶的作用下，首先合成一互补的DNA,即第一链，破坏RNA模板后，再以第一链为模板合成第二链，得到的双链DNA称为CDNA0选用适合的载体，将合成的C

33、DNA重组导入寄主细胞，经筛选得到的CDNA克隆群称为cDNA文库。由于CDNA技术合成的是不含内含子的功能基因，因此是克隆真核生物基因的一种通用方法。由于细胞内的基因在表达的时间上并非是统一的，具有发育的阶段性和时间性，有些则需要特殊的环境条件。所以，CDNA文库是不可能构建得十分完全的，也就是说，任何一个cDNA文库都不可能包含某一生物的全部编码基因。CDNA文库与基因组文库的主要差别是：(1)基因组文库克隆的是任何基因，包括未知功能的DNA序列；cDNA文库克隆的是具有蛋白质产物的结构基因，包括调节基因。(2)基因组文库克隆的是全部遗传信息,不受时空影响；cDNA文库克隆的是不完全的编码

34、DNA序列，因它受发育和调控因子的影响。(3)基因组文库中的编码基因是真实基因,含有内含子和外显子；而cDNA克隆的是不含内含子的基因。6.如何使用甲基化酶对克隆DNA进行保护?有什么意义？答：在构建基因文库时，可用与接头中限制性内切核酸酶相应的甲基化酶对克隆DNA先进行甲基化修饰，将插入片段上该酶可能的识别序列先行保护起来。意义：用这种方法，不仅保护了插入片段的大小不会改变，又有利于插入片段的回收，因为插入片段中特定限制性内切核酸酶的识别位点被保护起来，重组后可以用特定的限制性内切核酸酶将插入片段回收。8.某一质粒载体具有Tetr和Kanr的表型，在Kan抗性基因内有一BgII的酶切位点。现

35、用BglI切割该载体进行基因克隆，问：转化后涂皿时应加什么样的抗生素？培养后长出的菌落具有什么样的抗性基因型？如何利用抗性变化筛选到含有插入片段的重组体？提示：加四环素；TetrKans和TetrKanr;重新点种在含Tet、Kan和只加Tet的平板上，选择只在Tet平板上生长的菌落，即为所需的重组体。9.限制性内切核酸酶BamHI和PstI切割某一DNA序列，结果如下所示。5, GIGATCC3BamHIGGATCC3,CCTAGTG5,CCTAG G5,CTGCAIG3, Pst ICTGCAG3 ,GTACGTC5,GACGTC(1)指出被切割DNA分子的5端和3端；(2)如果你将切割后

36、的DNA同DNA聚合酶、4种dNTP在一起温育这些DNA末端会有什么样的变化？(3)经过(2)中的反应后，你还能够用T4DNA连接酶将BamHI末端连接起来吗？PstI末端呢？(T4DNA连接酶能够连接平末端和黏性末端。)(4)在(3)中的连接后，能够重新形成BamHI位点吗？PstI位点呢？为什么？答:(1)切割后分子的5和3端(如图示)：(2)如图所示,BamHI的末端能够被DNA聚合酶填补，而PStl的末端却不能。这种差异是由DNA聚合酶的作用条件所决定的:dNTP只加到具有3-OH的引物上，并且要有一条保证正确添加的模板链。BamHI的末端可以满足这些条件，但PstI的末端却不能，因其

37、具有隐蔽的5端，这种末端是不能作为引物的，故不能被填补。(3)如图所示,平末端化的BamHI末端和未被修饰的PstI末端二者都能被T4DNA连接酶连接。(4)连接处理过的末端可以再产生PstI的位点，但不会产生BamHI的位点(画图说明切割、填补末端并重新连接，常会产生新的限制酶酶切位点，这些位点对于进一步的操作有时是有用的。10.从基因组DNA文库中分离的一段DNA(如下图所示),其中有一编码基因(黑框)，图中给出了几种限制性内切核酸酶的作用位点。该图同时给出了用作表达该基因的表达载体，弯曲箭头是启动子的转录方向，并给出了几种酶的作用部位。请根据此图，回答下列问题：(1)给出限制性内切核酸酶

38、PstI、BamHLEcoRI.HindHl和Clal所在部位的遗传学名称。(2)如果你打算用该表达载体表达DNA片段中的基因该片段应如何插入表达载体？(3)如果只想表达该基因的一部分，以获得部分表达的蛋白质用于制备抗体，应如何操作？(4)如果你需要将整个基因在表达载体中表达，应如何操作？是用单酶切还是双酶切？答：(1)多接头区域(MCS),也叫多克隆位点。(2)主要是插入的方向问题。因为启动子的转录方向必须与基因的方向一致，所以该DNA必须倒转180。插入，即5端必须紧挨启动子。(3)用EcoRI切割载体和基因组DNA,用连接酶重组后筛选重组体,通过测序确定正确方向的重组体进行蛋白质表达。(

39、4)可用PstI和HindIII双酶切割基因组DNA和表达载体DNA,这种切割可将基因组DNA片段定向克隆入表达载体。四、问答题1.构建表达载体应注意些什么？答：Q)构建表达载体的关键是用于表达克隆序列的启动子类型，如果目的是基因的高效表达，就要选用强的启动子；如果表达产物对寄主细胞有毒性，可选择弱的启动子，最好使用可诱导型启动子，使在一定的条件下表达。(2)表达载体还应具有以下组成元件：携带能在寄主细胞中维持的复制的起始点。具有抗生素选择标记或其他选择机制。在紧接启动子的下游安排限制性位点，用于插入需表达的基因。具有单一的酶切位点来克隆基因，克隆位点应位于准确的位置，以使克隆基因有效表达。4

40、 .插入失活法和插入表达法筛选重组体的主要差别是什么？答：主要差别是：(1)插入失活法是直接根据失活基因的表型变化来筛选重组体。(2)插入表达法是根据一个基因的失活引起另一个基因的表达表型来选择。5 .一个携带有氨节和卡那霉素抗性基因的质粒被仅在卡那霉素基因中有识别位点的EcoRI消化。消化物与酵母DNA连接后转化对两种抗生素都敏感的E.coli菌株。(1)利用哪一种抗生素抗性选择接受了质粒的细胞？(2)怎样区分接受了插入酵母DNA的质粒的克隆？提示：(1)选择AmPr的转化子；(2)所需的克隆是Ampr和Kanso任何能够抗这两种药物的克隆都是自连的非重组质粒。6 .用EcoRI和HindI

41、II分别切割同一来源的染色体DNA,并进行克隆。在前者的克隆中筛选到A基因，但在后者的克隆中未筛选到A基因，请说明原因。提示：因为HindHI的切点位于A基因内。7.用一限制性内切核酸酶切割Lac+Tetr的质粒载体,已知该酶识别的是4个碱基序列，并产生有两个碱基突出的单链末端，该酶在Iac基因内有切割位点，并在第二个氨基酸密码子内,该位点可以被任何氨基酸所取代而不影响酶活性。用该酶切割后,用DNA聚合酶将单链末端补齐为双链的平末端,然后重新连接成环，转化Lac-Tet-受体菌，筛选Tetr转化子，问：Lac的基因型是什么？并说明原因。提示：基因型是Iac-,原因是在该密码子中插入了两个碱基，

42、造成了移码突变，所以Lac的基因是缺陷的。10 .在基因工程中，为了在细菌细胞中表达真核生物的基因产物，为什么通常要用CDNA而不用基因组DNA?为什么要在CDNA前加上细菌的启动子？答：这是因为细菌没有内含子剪接系统，并且不能识别真核生物的启动子的原因。11 .如何根据下面的应用设计探针?(1)假定你分离纯化了一未知功能的蛋白质，需要确定是何种组织和细胞表达这种蛋白质。假定你获得了绵羊的胰岛素mRNA,如何进一步从人的CDNA文库中获得含人胰岛素的克隆并使之在E.coli中表达？提示：(1)首先对该蛋白质进行部分测序，然后根据测得的氨基酸序列设计简并引物。(2)以该mRNA为模板反转录，得到

43、CDNA,即可进行标记用作探针。13.单链RNA作为探针,具有哪些单链DNA探针所没有的优点？答：单链RNA探针的下列优点是单链DNA探针所没有的：(1)RNA/RNA和RNA/DNA比DNA/DNA杂交体具有更高的稳定性。因此，杂交可以在更严格的各件下讲行.杂交后的信号也比较强。(2)单链RNA由于不存在互补双链的竞争性结合，所以杂交效率比较高。(3) RNA中不存在重复序列，所以特异性比较高。(4)杂交后可用RNaSe消化掉未杂交的RNA,因此降低了本底。四、简答题(每题6分,共24分)1 .酵母作为真核基因的高效表达系统有什么优缺点？克服大肠杆菌表达系统的不足,能繁殖快，高密度发酵，可以

44、进行蛋白质翻译后的修饰合加工。缺点：缺乏强有力的启动子，分泌效率差，表达菌株不够稳定，表达质粒易于丢失等例如甲醇酵母系统，利用甲醇作为唯一碳源。乙醇氧化酶将甲醇氧化为甲醛，乙醇氧化酶的启动子是强启动子，编码乙醇氧化酶的基因是AOXl合A0X2.A0X1基因的表达受甲醇严格调控，诱导表达水平可达30%以上。五、问答题(每题8分，共16分12 .基因组文库构建的基本步骤是什么？构建基因组文库需要用到哪些载体？步骤载体的制备；高纯度大分子量基因组DNA(HighmolecularweightDNA,HMWDNA)的提取；HMWDNA的部分酶切与脉冲电泳分级分离(PFGEsizeselection);

45、载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞；重组克隆的抖僦和保存。载体的选择：入噬菌体，YAC,BAC,粘粒等。基因文库构建的一般步骤：(1)染色体DNA大片段的制备酶切法物理切割法(2)载体与基因组DNA大片段的连接粘性末端直接连接人工接头法(3)转导受体(4)筛选重组子CDNA:以mRNA为模板合成的互补脱氧核糖核苗酸序列。CDNA文库：某种生物基因组转录的的全部mRNA经反转录产生的各种cDNA分别与克隆载体重组，贮存在一个受体菌的群体中，这个群体就称为CDNA文库。CDNA文库与基因组文库的区别在于CDNA文库是有时效性的。CDNA文库的特点优点：分离的目的基因可直接用于表达；比DNA文

46、库小的多，容易构建缺点：只与编码序列有关；不能反映内含子；不能反映启动子、终止子以及与核糖体识别的序列构建CDNA文库的一般步骤：(1)总RNA(totalRNA)提取(2)mRNA的分离纯化原理：利用mRNA都含有一段polyA尾巴，将mRNA从总RNA(rRNA、tRNA等)中分离纯化。mRNA的分离纯化CoIUmn(柱)(3) CDNA的合成CDNA第一链合成降解mRNA模板CDNA第二链合成(CDNA第二链合成的方法有四种,自身引导合成法，置换合成法，引导合成法和引物-衔接头合成法。)(4) CDNA与载体连接：(5)噬菌体颗粒的包装及转染或质粒的转化(导入宿主中繁殖)基因的化学合成：

47、寡核甘酸单链的化学合成；探针的化学合成；连接子和接头的合成；基因的半合成；全长基因化学合成目的基因的分离：目的序列已知：一般采用PCR技术或分子杂交技术分离克隆目的基因目的序列未知：差异表达序列；无差异表达的目的序列，可采用文库筛选法、功能蛋白分离法、序列克隆法第七章高等动物基因工程1.基因导入细胞内的方法物理方法：裸DNA直接注射、电穿孔、显微注射化学方法：磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法、阳离子-质粒复合物法生物学方法一动物病毒载体：腺病毒、SV40、腺相关病毒、反转录病毒、人牛痘病毒、疱疹病毒等。反转录病毒(单链RNA病毒)优点：A、宿主范围广（几乎所有类型哺乳动物细胞）B、效率高，可以感染大量的细胞，通常一次可以感染106107细胞C