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1、医学分子生物学,课程主要内容,第一章 生物大分子的分离纯化第二章 分子生物学常用技术（PCR、核 酸分子杂交、基因测序等）第三章 基因工程第四章 细胞培养技术,第一节 DNA重组技术(分子克隆)第二节 分子克隆的工具酶第三节 分子克隆的载体（vector）第四节 分子克隆的一般过程第五节 克隆基因的表达,第3 章 基因工程,基因工程（gene engineering）：将目的基因进行克隆(基因与载体的体外重组)，并利用克隆的基因表达、制备特定的蛋白质或多肽产物，或定向改造细胞和生物个体的特性所用的方法及相关的工作。,上游技术DNA重组技术(分子克隆)下游技术基因表达,基因工程的基本特点：分子水
2、平操作(DNA)，细胞水平表达。,Cohen的重组DNA实验,DNA重组（DNA recombination）：指不同来源的DNA分子通过磷酸二酯键将末端连接形成重组DNA分子。,DNA重组技术（DNA recombinant technology）,也称分子克隆，指在DNA水平上，将目的基因在体外重组于能自我复制的载体DNA分子上，然后将重组DNA导入宿主细胞中进行增殖，以获得大量的目的DNA片段的过程。,DNA重组技术,目的基因的分离切,目的基因与载体的连接（重组DNA）接,重组体导入受体细胞（宿主细胞）转,阳性重组体的筛选和鉴定筛,基本步骤,以研究或应用为目的、所需要的基因或基因克隆群体
3、（外源基因或靶基因）。,基因工程,基因工程技术的应用,一、生产（基因工程）产品：1.构建基因组文库，cDNA文库，核酸探针等；2.生产基因的(用于医药目的)的一级产品，即蛋白质、多肽；二级产品，如维生素、多糖、氨基酸(因为它们由酶催化产生）；3.生产基因疫苗，如:乙肝疫苗；4.转基因动物与植物 二、改良生物的性状 如将固氮基因引入水稻,就可以不用施氮肥了 基因治疗 三、分子诊断,在分子克隆技术中，对DNA进行切割、合成、补平、连接和修饰等工具酶是必不可少的。常用的工具酶主要有：限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、逆转录酶、DNA连接酶、碱性磷酸酶、核酸酶和末端脱氧核苷酸转移酶、甲基化酶等。,工具酶
4、（tool enzyme),一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease，RE）,简称限制酶，是一类能识别和切割特定DNA序列的核酸内切酶，为原核生物所特有。分为三型。其中型被称为基因工程的分子剪刀，是分子克隆技术中最重要的工具酶。,作用,三种限制性核酸内切酶的作用,酶活性 核酸内切酶 核酸内切酶 核酸内切酶 甲基化酶 甲基化酶 ATP酶 DNA解旋酶DNA链上的 无 有 有特异识别位点DNA链上的 无 在识别序列内 在识别序列外特异切割位点在分子克隆中 无 有 无的重要意义,限制酶的命名与分类,EcoR I,大肠杆菌Escherichia属、coli种、RY13株中
5、 分离到几种限制酶，分别表示为:EcoR I、EcoR、EcoR 等。,型限制性核酸内切酶的作用模式,根据需要在特定的位点上精确切割双链DNA分子，产生特异末端的DNA片段。,识别序列：双链DNA特异的碱基对（一般46个），在识别序列内特异切割DNA。,断裂磷酸二酯键,型限制酶的特异识别序列回文结构（palindrome structure）：指双链DNA分子上按对称轴排列的反向互补序列。,5GAATTC3,EcoR 识别序列：,对称轴,3CTTAAG5,限制性核酸内切酶（restriction endonuclease，RE）,简称限制酶，是一类能识别和切割特定DNA序列的核酸内切酶，为原核
6、生物所特有。,黏性末端（cohesive/sticky end）,平末端（blunt end）,限制性核酸内切酶（restriction endonuclease，RE）,简称限制酶，是一类能识别和切割特定DNA序列的核酸内切酶，为原核生物所特有。,黏性末端（cohesive/stickyend）：指限制酶错位切开两条对称轴互补DNA双链所产生的带单链突出的末端。,平末端（blunt end）：指限制酶在对称轴上同时切割互补DNA双链所产生的末端。,黏性末端（cohesiveend）：指限制酶错位切开两条对称轴互补DNA双链所产生的带单链突出的末端。,GAATTCCTTAAG,平末端（blun
7、t end）：指限制酶在对称轴上同时切割互补DNA双链所产生的末端。,EcoR,CCC GGGGGG CCC,Sma,Cohesive/Sticky end,限制性内切酶反应影响因素,DNA的纯度和结构 反应缓冲液的pH值及离子浓度 酶解温度和时间 限制酶：根据实验目的加以选择,“分子剪刀”的用途,改造和组建质粒组建基因组DNA物理图谱基因组DNA同源性研究DNA重组克隆及亚克隆DNA杂交与序列分析,1、DNA连接酶(DNA ligase,“缝纫”针)2、DNA聚合酶3、碱性磷酸酶4、核酸酶,二、其他工具酶,限制性核酸内切酶(“分子剪刀”),1、DNA连接酶(“缝纫针”)2、DNA聚合酶（DN
8、A合成）3、碱性磷酸酶4、核酸酶,二、其他工具酶,1.DNA连接酶（DNA ligase）,一种封闭DNA链上缺口的酶，催化DNA中相邻的5磷酸基和3羟基末端形成磷酸二酯键。,大肠杆菌DNA连接酶只能连接粘性末端，而T4DNA连接酶既能连接粘性末端，又能连接平末端。,粘性末端的特异性连接,53外切酶 53聚合酶 35外切酶,DNA聚合酶,36kD(小)76kD(大),C,N,DNA聚合酶和Klenow片段,修复DNA的3末端；合成双链cDNA的第二链；标记探针；DNA序列分析；,是一种耐热的DNA聚合酶，分子量65KD，最佳作用温度是72。Taq酶具有53 聚合酶活性和依赖于聚合作用的53外切
9、酶活性(无校正功能)。可用于DNA测序及聚合酶链反应（PCR）。,Taq DNA聚合酶（简称Taq酶）,RNA指导的DNA聚合酶活性（RDDP）。核糖核酸酶H活性（RNaseH）。DNA聚合酶活性（DDDP）。,逆转录酶的作用合成cDNA：,逆转录酶（reverse transcriptase）是依赖RNA的DNA聚合酶，它以RNA为模板，4种dNTP为底物，催化合成DNA，此过程称为逆转录过程。逆转录酶是多功能酶。,在二价阳离子存在下，催化脱氧核糖核苷酸转移到单链或双链DNA分子的3末端-OH上。特点：不需要模板DNA。,末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidy
10、l transferase，TdT，简称末端转移酶）,末端转移酶的功能主要有：同聚物加尾 标记探针 构建人工黏性末端,(A、G、C、T)n,(A、G、C、T)n,(A、G、C、T)n,（1）底物是单链DNA或有3突出末端的双链DNA，需要Mg2+。,（2）底物是平端或5突出末端的双链DNA，需要Co2+。,(A、G、C、T)n,3、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）,催化去除DNA、RNA或dNTP上的 5-磷酸基团。主要用途有：防止载体DNA自身环化，提高重组效率。,5-pCpGpC-OH 3,碱性磷酸酶,5-CpGpC-OH 3,碱性磷酸酶防止自身环化,4、核酸
11、酶S1,水解DNA或RNA分子中的单链部分。其主要作用有：变粘性末端为平末端。去除发夹结构。分析RNA的茎环结构和DNA-RNA分子的杂交情况。,核酸酶S1功能：,水解双链DNA、RNA或DNA-RNA杂交体中的单链部分。,+,第一节 DNA重组技术第二节 分子克隆的工具酶第三节 分子克隆的载体（vector）第四节 分子克隆的一般过程第五节 克隆基因的表达,第3章 基因工程,DNA重组技术,指能携带外源DNA片段进入宿主细胞进行扩增或表达的工具。载体的本质为DNA。制备的目的基因必须与合适的载体连接形成重组体，才能进入受体细胞并进行复制和表达。-DNA重组,载体（vector）:,第三节 分
12、子克隆的载体,自我复制能力；带有遗传筛选标记（抗药性、营养缺陷型、显色表型反应等）。具较高的拷贝数，易与宿主细胞的染色体分开，便于分离提纯；有适当的限制酶切位点，便于外源基因的插入和筛选。具有较高的遗传稳定性。,载体应具备的特征：,常用载体：质粒DNA 噬菌体DNA 病毒DNA plasmid phage virus,按来源分类：质粒、噬菌体、黏性质粒、酵母和病毒等改造后才能成为载体。,克隆载体(cloning vector)：用于克隆和扩增某一目的基因，为研究提供材料或建立基因库。,表达载体(expression vector)：是指能将目的基因在受体细胞中有效转录和正确翻译的功能性载体。,
13、按功能分类:,穿梭载体(shutter vector)：指在两种宿主生物体内复制的载体分子。,质粒（plasmid）DNA,独立于染色体外，非宿主生长所必需，能进行自主复制和遗传的双链环状DNA分子。,一、克隆载体,（一）质粒克隆载体,插入失活,双抗生素筛选法,重组体的筛选双抗生素对照筛选,可能的阳性克隆（含目的基因）：3和5,pUC18、pUC19质粒载体,载体中装入一个来自大肠杆菌乳糖操纵子的DNA片段（lacZ基因），该基因编码-半乳糖苷酶氨基端的一个片段，异丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG）可诱导此片段合成，而此片段能与宿主细胞所编码的缺陷型-半乳糖苷酶实现基因内互补（-互补），形成完
14、整的-半乳糖苷酶。,-半乳糖苷酶能催化指示剂底物5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷（X-gal）形成蓝色菌落。pUC载体的lacZ基因中含有MCS，当外源基因插入MCS，lac-肽基因阅读框架被破坏，细菌内将无-半乳糖苷酶活性，菌落呈白色。,蓝白斑筛选,pUC18、pUC19质粒载体,多克隆位点（multiple cloning sites，MCS）一段人工合成的DNA序列，含有密集排列的多种限制性内切酶识别序列，以利于不同来源的外源DNA片段插入载体。,（一）质粒克隆载体：,用于保存和扩增 10Kb目的DNA。,（二）噬菌体载体 噬菌体载体和M13噬菌体载体,噬菌体载体,主要用途：,插入
15、外源基因在10kb-22Kb之间,主要用于构建cDNA文库和基因组文库。,重组噬菌体的分子量必须在野生型噬菌体分子量大小的75%105%之间。,M13噬菌体,是一类雄性特异的大肠杆菌噬菌体，含一约6.4Kb的单链（正链）闭环DNA分子。在细菌内呈溶源状态生长，在适当条件下可生成百余个过渡形式的双链环状复制型DNA，成熟的噬菌体以单链（正链）形式释放到培养液。M13噬菌体只降低宿主细胞的生长速度，而不溶解宿主细胞，故可从细菌培养液的上清液中获得噬菌体。,M13噬菌体在细菌内的复制模式图,噬菌体正链,复制型DNA,M13噬菌体载体 主要用于目的DNA的测序和单链探针的制备，克隆的外源DNA一般1K
16、b。,（三）黏性质粒(cosmid),特点：,具有质粒特征(环状,双链)；,具噬菌体载体特征(cos区)；,具有高容量的克隆能力（40-50kb）；,cosmid是由质粒和噬菌体的cos位点构建而成。,主要用于构建基因组文库。,加入噬菌体头部和尾部蛋白，可将粘粒包装成类似于噬菌体的具感染能力的颗粒，更易进入大肠杆菌。,粘粒进入细菌后则完全失去噬菌体的功能，而表现质粒的特性。,特点：,粘粒（粘性质粒）载体大小为46Kb，而插入外源基因长达4050kb。,用途：,克隆大片段DNA；构建小的重叠群以进行DNA测序；,（四）酵母细胞中克隆基因常用载体 酵母是研究真核生物DNA复制、重组、基因表达和调控
17、过程的理想材料;酵母人工染色体（yeast artificial chromosome，YAC）是利用酵母染色体DNA和大肠杆菌pBR322改造而成，可以插入长达1 000 Kb的外源DNA片断。将质粒与酵母DNA重组已构建了许多YAC载体，根据其复制方式不同分为三型：整合型（YIP）、复制型（YRP）和附加体型（YEP）载体，其中YRP型质粒中插入酵母染色体的着丝粒区，构成酵母着丝粒质粒（YCP）载体。,（五）动物细胞基因克隆的载体,已构建并经常使用的动物病毒克隆载体：猿猴空泡病毒40（simian vacuolating virus 40，SV40）载体、腺病毒（adenovirus）载体
18、、逆转录病毒（retrovirus）载体等,外源基因在细胞中表达需要重要调控元件，是在克隆载体（复制原点，多克隆位点,筛选标记）的基础上导入表达调控元件：,二、表达载体,转录相关元件；翻译相关元件；,(一)原核表达载体 真核基因表达、合成有功能的蛋白质依赖于基因的有效转录、mRNA正确的翻译和翻译后修饰。,有效转录 转录起始 转录终止 转录效率 转录后修饰,原核启动子,终止子,强启动子，如trc启动子,mRNA剪接内含子切除,cDNA,有效翻译,必须保证外源基因插入方向的正确性翻译起始：核糖体结合位点(SD序列)，起始密码子（AUG）,原核生物特有的、位于mRNA上起始密码子上游的一段富含嘌呤
19、（AGGA)碱基的短序列，是mRNA与核糖体小亚基结合位点，直接影响翻译效率，又称为核糖体结合位点（ribosomal binding site，RBS）。,SD序列（Shine-Dalgarno),有效翻译,必须保证外源基因插入方向的正确性翻译起始：核糖体结合位点(SD序列)，起始密码子（AUG）阅读框架（三联体密码）翻译后修饰（肽链折叠，二硫键生成，肽段切除，侧链化学修饰磷酸化，糖基化，乙酰化等）,原核表达载体,报告基因（reporter gene）,为了判断某一待测DNA序列的生物活性，常采用报告基因（reporter gene）方法。报告基因是指处于待测基因下游并通过转录和表达水平来反
20、映上游待测基因功能的基因，又称报道基因，如绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因。,报告基因绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）,(二)真核表达载体,1原核DNA序列 包括能在大肠杆菌中自身复制的复制子和抗药基因的筛选标记。2真核表达调控元件,包括启动子（promoter）、增强子（enhancer）、终止子（terminator）和加polyA信号等。3真核细胞的复制起始序列、筛选标记和多克隆位点等,猴空泡病毒SV40载体；腺病毒载体；慢病毒载体；腺相关病毒载体；逆转录病毒载体（Rous肉瘤病毒载体和鼠类的乳腺瘤病
21、毒（MMTV）载体）；,病毒表达载体：,酵母穿梭载体示意图,酵母复制起始区,质粒可在大肠杆菌 和酵母之间穿梭,切,接,转,筛,第四节 分子克隆的一般过程,获取目的基因和载体,目的基因和载体连接,重组DNA导入受体细胞,重组体的筛选与鉴定,分,限制酶切割,1.从基因文库中获取2.PCR-最常用3.人工合成DNA片段4.直接从染色体DNA中分离,目的基因：指被研究的某一基因或DNA序列，即需要克隆或表达的基因。,（一）已知基因的获得,1.从基因文库中获取 基因组文库（genomic library，G-文库）是指含有某种生物全部基因组DNA的重组DNA克隆群。构建基因组文库时，先将原核或真核细胞染
22、色体DNA提纯，通过机械或限制酶切使之成为一定大小的片段，将其与适当的载体（一般为噬菌体载体）相连接，经体外包装、转染细菌，得到一组含不同DNA片段的重组噬菌体颗粒。,基因组文库技术(引自Griffiths et al.1996),从基因组文库获取目的基因,基因组文库特点,含有基因组内全部基因片段，是一个贮存基因组全部序列的信息库（含内含子等）；真核细胞G-文库DNA中含有较多的重复序列与内含子，一个单拷贝基因只占基因组的10-710-5；具有种属特异性，但无组织特异性；,cDNA文库（cDNA library）：以细胞全部mRNA经逆转录，制备出全套的cDNA克隆集合，又称为C-文库。C-文
23、库中，平均一个目的基因所对应的mRNA占总mRNA的10-410-3，相比之下后者比前者在含量上提高23个数量级，便于提取一个目的基因。体现实时表达的信息，不包含全部遗传信息。既有种属特异性，又有组织特异性；,以mRNA为模板，利用逆转录酶合成与mRNA互补的DNA（cDNA)，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，即获得cDNA文库。,cDNA文库构建(引自Old&Primrose,1980),从cDNA文库获取目的基因,2.PCR 应用较广泛。使用前提是目的基因的序列至少部分已知,以便设计引物。特点：短时间获得大量DNA片段。高保真酶/测序验证！,3.人工合成DNA片段 根
24、据已知某种基因的核苷酸序列或某种基因产物的氨基酸序列，可推导出为该多肽编码的核苷酸短序列，再用DNA合成仪人工合成目的基因。适用于合成分子量较小的目的基因（100bp以内），如：人生长激素释放因子、血管加压素、干扰素、胸腺素及胰岛素原的基因等。,4.直接从染色体DNA中分离目的基因,根据染色体DNA的限制性内切酶图谱，用适当的限制性内切酶切割染色体DNA、分离目的基因。本方法适用于制备原核生物目的基因，其原因为：（1）真核细胞染色体DNA有丰富的内含子，它们在原核细胞中转录后不能被剪接。（2）真核细胞的基因多数为单拷贝，难以分离到足够量的目的基因。,（二）未知基因的获得,构建基因组文库构建cD
25、NA文库 mRNA差异显示技术筛选差异表达基因差异蛋白质谱表达技术筛选功能基因,正常组织,肿瘤组织,噬菌体和粘性质粒载体常用来构建基因组文库；构建cDNA文库和克隆较小DNA片段常用pUC系列等质粒；M13噬菌体则用于克隆一些待测的DNA序列。这些载体不仅可以携带外源基因片段进入宿主细胞，而且还可以使外源基因在宿主细胞中表达。常用的宿主细胞是大肠杆菌。,二、载体的选择与构建,目的基因与载体连接,粘性末端匹配,三、目的基因与克隆载体的连接,同一种限制酶酶切,(一)黏性末端连接,缺点：,载体自身环化；,双向插入；,碱性磷酸酶防止载体的自身环化,定向克隆,使目的基因按正确方向插入载体分子中的方法。,
26、定向克隆的两种连接方式：,粘粘 连接粘平 连接,同聚物加尾连接,本法适用于在载体和目的基因上没有相同的限制酶切位点,同聚尾连接法构建DNA重组体,本法适用于在载体和目的基因上没有相同的限制酶切位点,人工接头（linker）：化学合成的含一种或多种限制酶切位点的平端双链寡核苷酸片段。,PCR扩增,(二)平末端连接,质粒,目的基因,缺点：效率低；载体自身环化；双向插入；,对宿主细胞的要求：具有接受外源DNA的能力，易于转化；限制修饰系统缺陷;重组系统缺陷;遗传表型具有互补性;感染寄生缺陷（安全性）;,四、重组DNA导入宿主细胞,受体细胞(宿主细胞)分两大类：原核细胞:大肠杆菌、枯草杆菌等；真核细胞
27、:酵母、昆虫、哺乳动物细胞等,四、重组DNA的导入-转,重组DNA的克隆和表达必须借助受体细胞（宿主细胞）,（一）重组DNA导入大肠杆菌,CaCl2转化法,电穿孔转化法,体外包装感染法,感受态(competent)容易吸收外源DNA的状态（细胞膜结构改变、通透性增加等）。,磷酸钙沉淀法,病毒感染法,脂质体介导法,显微注射法,（二）重组DNA导入哺乳动物细胞,阳性克隆：含有目的基因的宿主细胞克隆。,阳性克隆的筛选步骤:带载体的克隆；带重组体的克隆；带特异目的基因的克隆；,五、重组体的筛选和鉴定,针对载体（一）根据遗传表型进行筛选 抗生素抗性筛选 遗传标记补救筛选 噬菌斑筛选,阳性克隆的筛选方法,
28、抗生素抗性标记筛选,双抗生素对照筛选筛选重组体,遗传标记补救筛选 蓝白斑,噬菌斑筛选法 噬菌体载体,重组噬菌体的分子量必须在野生型噬菌体分子量大小的75%105%之间。,限制酶谱分析 核酸杂交法 PCR扩增 序列测定,针对重组体结构筛选,目的DNA序列,免疫分析筛选表达蛋白质,序列分析,PCR,限制酶谱分析,核酸分子杂交,Western blot,1 2 3 4,第五节 克隆基因的表达和分离纯化,外源基因（主要真核基因）在原核细胞中的表达 原核生物基因表达具有以下特点：只有一种RNA聚合酶；表达调控主要在转录水平，操纵子；转录和翻译是偶联、连续进行的；原核基因一般无内含子，缺乏真核转录后加工系统；核糖体结合位点SD序列；,如何提高外源基因在原核系统中的表达?,转录水平 翻译水平 诱导表达？提高表达蛋白的稳定性?,克隆基因在真核细胞中的表达,酵母表达系统 哺乳动物表达系统,表达产物的分离纯化,
