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1、除湿外用溶液对湿疹模型大鼠皮损TH17细胞的影响彭勇I王英杰I*李劲锋2姜珠倩I刘杰I罗瑞静I武宗琴I（1.上海市嘉定区中医医院皮肤科，上海市嘉定区博乐路222号，201899：2.海军军医大学卫生毒理教研室,上海市杨浦区翔殷路800号，200433）摘要目的：探讨除湿外用溶液对湿疹大鼠模型TH17细胞的影响。方法：将30只湿疹造模大鼠，随机分为3组：除湿外用溶液组、生理盐水对照组、丁酸氢化可的松乳膏阳性对照组，每组10只，雌雄各半。各组均连续给药7d,随后停药Id,取材进行检测qRT-PCR检测给药皮片组织中ROR”和IL-UAmRNA相对表达量；WesternBlot检测RORYt和IL-
2、17A蛋白的表达。结果：中药组和阳性组IL-17a和RORt的mRNA表达量无显著影响；中药组和阳性组均有抑制RORYt表达和IL-17a表达趋势。结论：除湿外用溶液通过调节Thl7细胞功能抑制炎症反应，有效治疗湿疹。关键词：除湿外用溶液；湿疹；大鼠；TH17EffectofDehumidiHcationTopicalSolutiononInflammatoryReactioninEczemaModelRatsAbstractObjectiveToexplorethemechanismofdehumidificationtopicalsolutiononTH17cellsoftheratmod
3、elofeczema.MethodsThirtyeczemamodelratswererandomlydividedinto3groups:dehumidificationtopicalsolutiongroup,normalsalinecontrolgroup,andhydrocortisonebutyratecreampositivecontrolgroup.Eachgrouphad10rats,halfmaleandhalfmale.Eachgroupwasgivencontinuousadministrationfor7days,thentheSolutionwasstoppedfor
4、1day,materialswerecollectedfortesting.qRT-PCRwasusedtodetecttherelativeexpressionofRORtandIL-17AmRNAintheskintissue;WesternBlotwasusedtodetecttheexpressionofRORtandIL-17AtsBoththetraditionalChinesemedicinegroupandthepositivegrouphadnosignificantI基金项目国家中医药传承与创新“百千万”人才工程（全国中医临床特色技术传承骨干人才，编号19Z-1-66）；上
5、海市进一步加快中医药事业发展三年行动计划项目（zy3-jsfc-2-2001）.作者简介彭勇，硕士研究生，副主任医师，研究方向：中西医结合治疗皮肤病的临床研究，Tel:,Email:.通讯作者王英杰，硕上研究生，副主任医师，研究方向：中医药治疗皮肤病的临床研究，Email:effectonthemRNAexpressionofIL-17aandRORt;thetraditionalChinesemedicinegroupandthepositivegroupbothinhibitedtheexpressionofRORtandIL-17a.ConclusionDehumidificationt
6、opicalsolutioncaneffectivelytreateczemabyregulatingthedifferentiationofTh17cellstoinhibitinflammation.KeywordsDehumidiflcationtopicalsolution;eczema;rats;TH17湿疹是一种炎症性皮肤病，发病原因复杂，众多细胞因子参与其中，如Thl、Th2和Thl7细胞等。目前治疗湿疹主要药物包括糖皮质激素、钙调磷酸酶抑制剂均有一定的局限性，不宜长期使用。除湿外用溶液是上海市嘉定区中医医院院内协定皮科8号方转化的院内制剂，临床治疗湿疹疗效显著，本研究通过动物试
7、验，探讨除湿外用溶液对湿疹模型大鼠的作用机制。1材料与方法1.1 药物与试剂除湿外用溶液（苦参30g、黄柏30g、地肤子30g、马齿览30g莓草30g、一枝黄花30g、白矶6g透骨草30g、蛇床子10g、花椒6g、红花6g）,上海市嘉定区中医医院委托万仕诚中药饮片厂代煎；丁酸氢化可的松乳膏（天津金耀药业有限公司，30g）；2,4-二硝基氯苯（上海试剂一厂，25g）；丙酮（国药集团化学试剂有限公司，AR级，500ml）；0.9%氯化钠注射液（辰欣药业，500ml）；qPCRKit（SYBRPremixExTaqKitCompany）；RORt单克隆抗体（Takara,Japan）；IL-17A单
8、克隆抗体（RD,USA）。1.2 实验室设备电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司，AWH（SA）-15型；流式细胞仪，Beckman,CytoFLEX型；化学发光显影仪，GE,AI600型；RT-PCR,ABL7500型；酶标仪，MolecularDevices,型号SpectraMaxM2e,电泳设备，Bio-rad,型号Mini-PROTEANo1.3 实验动物SD大鼠，SPF级，雌雄各半，试验开始时体重：雌性大鼠体重217.1g-258.9g,雄性大鼠体重245.2g-369.6g,7-8周龄，购自上海西普尔必凯实验动物有限公司，实验动物许可证号：SYXK（沪）2017-0004,上海
9、市科委颁发。1.4 实验操作1.4.1 敏化剂和激发液的制备称取3.5g2,4-二硝基氯苯（DNCB）溶解在丙酮溶液中，然后在50ml容量瓶中稀释成7%DNCB丙酮。1.4.2 造模方法30只健康SD大鼠（半雄性，半雄性）脱毛，于大鼠背部皮肤A处脱毛面积2CmX2cm,小鼠背部皮肤为B处脱毛面积4CmX4cm,100UL7%DNCB丙酮溶液涂于A部分皮肤，1周后200uL7%DNCB丙酮溶液涂于B部分皮肤进行激发。大鼠每5天刺激一次，表现出明显的瘙痒、抓挠和翻滚行为。大鼠B皮肤如出现红斑、丘疹、水肿、抓挠、脱皮等，则造模成功。1.4.3 分组及给药方法将30只成功制备的湿疹模型大鼠随机分为三组
10、：除湿外用溶液给药组（中药组）、生理盐水模型对照组（对照组）、丁酸氢化可的松乳膏对照组（阳性组），每组10只动物，一半雄性一半雌性。B组湿疹皮肤用生理盐水（对照）、氢化可的松乳膏（阳性组）和除湿外用溶液（中药组）分别于早晚各一次。每组连续给药7天，然后停药1天。最后，我们使用来自B处的皮肤组织。1.5 检测项目与方法1.5.1 RORYt和IL-17AmRNA相对表达检测：称重后，取各组皮肤组织，放入液氮中粉碎成粉末，用Rneasytm动物rna提取试剂盒提取总rna,测定总RNA浓度并将试剂盒逆转录成CDNAoSYBRPremixExTaqII10L,上游引物1RL,下游引物1ULo2LDN
11、A模板,6L无菌水，总共20L充分混合并逆转录。得到的CDNA产物在反应体系中制备：反应条件：95预变性，30秒，PCR反应温度95C,5秒，60,30秒，72,15秒，大鼠B-以肌动蛋白循环40个循环后重复反应得到各组的Ct值作为内参，采用2-Ct法分析引物的基因表达。1.5.2 RoRYT和IL-17A蛋白表达检测：称重后，取各组皮肤组织切成小块，从组织中提取蛋白，得到各组总蛋白，蛋白浓度用BCA试剂盒测定。用10%SDS-PAGE凝胶电泳转膜，将PVDF膜置于5%脱脂奶粉封闭液中2h,用TBST洗膜3次，每次5min,稀释一抗（Re）RYt,ILAdd按-17A）1:1000稀释）室温2
12、小时，用PBST洗3次5分钟，加入辣根过氧化物酶标记的二抗稀释液，反应1小时，洗膜3次，每次洗5分钟，然后显影。1.6 统计处理方法使用spss22.0软件进行统计分析。数据表示为平均值标准偏差（Xs）o多组比较采用方差分析，差异有统计学意义（P0.05)o图1：qRT-PCR检测给药皮片组织中RoRYt和IL17AmRNA相对表达量2.2 在翻译水平检测RC)RYt和IL-17A蛋白的表达，如图2所示，与对照组相比，中药组和阳性组均抑制了RORYt和IL-17A的表达，而差异有统计学意义(P=0.0310,05)解/炉&*小/盥妙&/三三IL-17A图2：WesternBlot检测RORt和
13、IL-17A蛋白的表达3讨论湿疹的发病机制涉及多种免疫细胞。近年来的研究表明，Thl7细胞在湿疹的发病机制中起重要作用。Thl7细胞产生的IL-17可通过有效介导中性粒细胞聚集来介导组织炎症反应已引。孤束核受体(RORYt)是Thl7细胞分化的标志转录因子，RoRYt可诱导IL编码基因的表达，包括17A和IL-174J在皮肤中，IL-17在刺激皮肤角质形成细胞、增加促炎细胞因子的分泌、维持皮肤炎症反应的慢性形成等方面发挥着重要作用。在这项研究中，我们使用了经典的湿疹动物模型。已发现除湿外用溶液对湿疹皮损处的Thl7细胞有一定的调节作用。除湿外用溶液是在外科正宗卷四的中医外科名方“蛇床子汤”的基
14、础上化裁而来。苦参、黄柏、地肤子均味苦，性寒凉，苦能燥湿，寒可除热，为君药,共奏清热燥湿，解毒止痒之功；马齿览、菌草、一枝黄花、白研味酸苦，性寒凉,共为臣药，起到清热解毒，燥湿止痒，增强了收涩止痒之效；透骨草、蛇床子、花椒、红花味辛、性温，与大队苦寒之品相伍，共为佐使药，一方面佐助君臣起到燥湿解毒功效，另一方面调和药性，温性药的反佐补充了杀虫止痒的作用，同时透骨草、红花活血化瘀，增强药效，起到引经药作用。全方寒温并用，气血同调，共奏清热燥湿，祛风止痒，解毒杀虫，活血通络之功。除湿外用溶液的主要成分是苦参，广泛用于治疗湿疹、外阴肿胀、外阴瘙痒等皮肤病。大量研究俗表明苦参具有抗炎、抗过敏、抗病毒微
15、生物、抗肿瘤和免疫调节等多种药理作用。苦参水提物能抑制Thl7细胞的分化，降低Thl7细胞的比例。其机制可能是抑制转录因子RORyt和STAT3的活性，从而降低IL-17A和IL-17F的表达。其主要成分氧化苦参碱可有效降低免疫功能低下小鼠肠黏膜中Thl7细胞的含量及Thl7细胞与Treg细胞的比例，调节Thl7细胞与Treg细胞的平衡。根据透骨草的研究口叫发现外用可明显减轻角叉菜胶引起的足趾水肿和二甲苯引起的小鼠耳水肿程度，对急性炎症有较好的治疗作用。地肤子的相关研究表明口”,地肤子的抗炎机制与地肤子甲醇提取物显著抑制脂多糖诱导的肿瘤坏死因子(TNF-)、前列腺素E2(PGE2)和一氧化氮(
16、NO)有关与炎症递质的释放有关。蛇床子总香豆素的挥发油成分可提高豚鼠磷酸组胺的瘙痒阈值，抑制皮肤组织中肥大细胞释放组胺，抵抗二甲苯引起的小鼠耳廓肿胀以及DNCB诱导的迟发型超敏反应。除湿外用溶液的主要成分具有抗炎、抗过敏和免疫调节作用，既往研究结果表明它可以调节ThI7。本实验中Thl7细胞中转录因子RORyt和IL-17A的蛋白水平低于对照，说明除湿外用溶液可以抑制RORyt和IL-17A蛋白的表达，减少Thl7细胞的分化，它通过抑制炎症反应起作用。本实验为除湿外用溶液治疗湿疹提供了理论依据。参考文献彭勇,罗瑞静,刘杰,王英杰,武宗琴,李淑,柴维汉.湿疹外洗方汽雾透皮治疗手部湿疹临床观察J上
17、海中医药杂志,2014,48(12):63-65.2 DamskerJM,HansenAM,CaspiRR.ThlandTh17cellsJ.AnnNYAcadSci,2010,1183(1):211-221.3 1.outenJ,BonifaceK,deWaalMalefytR.DevelopmentandfunctionofTH17cellsinhealthanddiseaseJ.JAllergyClinImmunoh2009,123(5):10041011.4 IvanovILZhouL,LittmanDR.TranscriptionalregulationofTh17celldiffe
18、rentiationJ.SeminImmunol,2007,19(6):409417.5 VanBeelenAJ,TeunissenMB,KapsenbergML,etal.InterIeukin-17ininflammatoryskindisordersJ.CurrOpinAllergyClinImmunol.20077(5)：374-381.6 MAH,HUANGQ,QUW,etal.Invivoandinvitroanti-inflammatoryeffectsofSophoraflavescensresiduesJ.JEthnopharmacoL2018,224：497-503.7张丽
19、华，陈邦恩，潘明佳.苦参碱药理作用研究进展5.中草药，2009,40(6)：1000-1003.8张丽华,陈燕,彭雨舒,周宝珠,危荧靖,黄小玲,郭嘉亮.中药苦参水提取物抑制Th17细胞分化的研究J中药新药与临床药理,2020,31(03):251-256.9张岚琨，张志强.氧化苦参碱靶向抑制Th17对肠道黏膜免疫屏障的作用J沈阳药科大学学,2019,36(12)-10.14066j.21-1349r.2019.12.007.10羊菲,金若敏,范斌,张宁,杨连娟,何文靖,符胜光.复方透骨草溶液抑菌和抗炎作用的实验研究.上海中医药杂志,2017,51(05):82-85.7 KMShin,YHKi
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