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1、过表达ABAD对AB2刺激的293T细胞线粒体功能和自噬水平的影响洪婷婷张宇崔理立()广东医科大学广东省衰老相关心脑疾病重点实验室广东湛江524001【摘要】目的探讨Api/刺激下，在293T细胞中过表达ABAD对线粒体功能的影响及自噬相关标记蛋白水平的变化。方法293T细胞分别经APM2(5M10M20M)处理后，ATP试剂盒测定其细胞ATP含量；活性氧试剂盒测定其活性氧生成量。自噬诱导剂处理后，WeSternbIot观察线粒体自噬相关蛋白表达量的改变。通过标准曲线换算ATP细胞含量和活性氧生成量，用ImageJ对WeSternbIOt条带进行量化。结果对照组与293T过表达ABAD组ATP
2、含量和活性氯生成量无明显差异(P均0.05)；与不给药组相比,在给予Aj2(IOuM)刺激后，293T细胞过表达ABAD的ATP含量减少，差异具有统计学意义(P0.05)；与DMSO处理对照组相比，CCCP自噬诱导剂处理组在Apb42IOuM诱导后线粒体自噬相关蛋白P62降低、LC3B升高，差异均有统计学意义(PvO.O5)o结论过表达ABAD不影响293T细胞的线粒体功能，但在特定浓度A,42刺激下可影响线粒体ATP产生及促进线粒体自噬发生。【关键词】：ABAD,A,线粒体功能：线粒体自噬；【中图分类号】R74【文献标识码】AEffectsofoverexpressionofABADonmi
3、tochondrialfunctionandautophagyof293TcellsstimulatedbyA,42HONGTing-tingZHANGYuCUILI-li*Guangdongprovincialkeylaboratoryofagerelatedheartandbraindiseases,GuangdongMedicalUniversityZhanjiang524001,Guangdong,ChinaAbstractobjectivetoinvestigatetheeffectofoverexpressionofABADonmitochondrialfunctionandthe
4、levelofautophagy-associatedmarkerproteinin293TcellsstimulatedbyA32Methods293TcellsweretreatedwithAp42(5uM,IOuM,20uM)respectively,andtheirATPcontentwasmeasuredbyATPkit,andtheproductionofreactiveoxygenspecies(Ros)wasmeasuredbyRosKit.Aftertreatedwithautophagyinducer,theexpressionofMitochondrialautophag
5、y-relatedproteinswasobservedbyWesternblot.TheamountofATPcellsandreactiveOxygenSpecies(Ros)werecalculatedbystandardcurve,andtheWesternblotwasquantifiedbyImageJ.ResultstherewasnosignificantdifferenceinArPcontentandreactiveoxygenspeciesproductionbetweenthecontrolgroupand293Toverexpressionabacigroup(P0.
6、05);comparedwiththecontrolgroup,theATPcontentof293TcellsoverexpressionABADwasdecreasedafterAm2(IOuM)stimulation,thedifferencewasstatisticallysignificant(P0.05);comparedwiththecontrolgrouptreatedwithDMSO,mitochondrialautophagyrelatedproteinP62decreasedandLC3BincreasedinthegrouptreatedwithCCCPautophag
7、yinducerafterAB.42(IOuM)stimulation(PBCA蛋白检测盒（美国ThermO公司），ABAD过表达质粒、ABAD干扰质粒（上海毅乐生物），增强型ATP检测试剂盒、活性氧检测试剂盒（碧云天生物技术），CCCP（MCE）,A1.42（上海强耀生物科技有限公司），DMSO（青岛生物科技），抗体：LC3B（Sigma）,P62、ABAD（Abcam）,P-actin（CST）,低温高速速离心机（德国Eppendorf公司），酶标仪、化学发光仪（美国Thermo公司），曝光机（美国AzureBiosystems公司）。1.2 方法1.2.1 细胞培养与分组293T细胞购买
8、于上海中乔新舟生物公司，使用完全培养基（10%胎牛血清+1%的双抗+高糖培养基）在37、5%C2细胞培养箱传代培养。倒置显微镜下观察细胞，每隔23d传代1次，用含EDTA胰酶消化3min,加两倍体积培养基终止胰酶消化。传代3次后进行实验。分组为1、正常组、ABAD过表达组、正常给药组（Ap.425uMIOUM、20uM）、ABAD过表达给药组（A425uMIOuMs20uM）1.2.2 细胞转染严格按照汉恒LiPOFiter说明书转染。细胞传代3次后，按IxIO5/孔接种，细胞培养箱中培养24h,在细胞密度在60%左右进行转染。ABAD过表达和ABAD干扰转染终浓度为2ug孔。转染5-6h后，
9、更换新的培养基继续培养。24h后，用配制的不同浓度APy2刺激细胞24h1）1.2.3 A阮42的配制AB2母液配制：取人源A2单体，用HFlP重悬，在通风橱中挥发后获得A。肽膜，以DMSO溶解肽膜，稀释至适当浓度后，37孵育48h后即得到AB寡聚体，孵育后的溶液1周内使用。1.2.4 CCCP的配制CeCP母液配制：离心试管，在无菌操作台中称取适量CCCP粉末，加入DMSO,使浓度为20mM,充分震荡混匀离心，即得到CCCP母液，1月内使用。1.2.5 ATP检测按照产品说明书操作，吸除培养液，10OUl裂解液/12孔板每孔，移液器反复吹打,充分裂解细胞。裂解后4C12000g离心5min,
10、吸取的上清即为样品。按照每个样品/标准品需IoOUlATP检测工作液的比例配制适当量的ATP检测工作液。把待用试剂在冰浴上融解。取适量的ATP检测试剂，用ATP检测试剂稀释液稀释ATP检测试剂(1:4)。稀释后的ATP检测试剂即为ATP检测工作液。加IoOUlATP检测工作液到检测管内，室温放置5min。检测管内加上20Ul样品/标准品，迅速用枪混匀，间隔2s后，用化学发光仪测定RLU值。1.2.6 ROS检测按照产品说明书操作，用无血清培养液稀释DCFH-DA(GoOO),使终浓度为10微摩尔/升。用稀释好的DCFH-DA重悬细胞，细胞浓度控制在约一百万至二千万/ml,37细胞培养箱中孵育2
11、0min。隔5min上下颠倒混匀，待探针和细胞充分接触后，用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。使用流式细胞仪检测荧光的强弱。1.2.7WesternBlot移除培养液，用冰PBS小心洗一遍，按IoOUI裂解液/6孔板每孔的比例加入裂解液，置于摇床冰上，裂解15min,用细胞刮充分刮数下，收集蛋白至EP管。检测细胞浓度(BCA蛋白检测法)。各组样本取相同摩尔质量和体积的蛋白量进行SDS-PAGE电泳(初始电压为60V,待蛋白条带入分离胶，调整电压至IoOV),预先将PDVF膜泡在甲醇液中5-1Omin,待电泳结束，将其转印至PVDF膜，赶走膜和胶之间的气泡，放
12、入转膜槽(100mA,10Omin),IXTBST稀释的5%脱脂牛奶，摇床上常温封闭lh。将一抗和膜置于孵育袋中共同孵育，(一抗稀释液配制所有的一抗，浓度为1:1000),4度摇床过夜。回收一抗，1XTBST洗膜三次，IOmin/次。二抗用IXTBST稀释的5%脱脂牛奶溶解，与膜在摇床上常温孵育lh。IxTBST洗膜三次，1Omin/次。显色及曝光。将归一化后目标蛋白灰度值与内参-actin灰度值之间比值视为目标蛋白相对表达量。1.2.8 统计方法所有实验重复至少3次。用GraPhPadPriSm6.0对实验结果进行统计分析。表中数值均为平均值标准误差(-s)o数据采用单因素方差分析(ANOV
13、A)或者t检验进行分析。P0.05)以上结果表明ABAD过表达不影响293T细胞线粒体功能。为进一步证实ABAD作为线粒体蛋白，在线粒体功能起重要作用，我们分别测试干扰ABAD后293T细胞的ATP和活性氧变化。如表2所示，干扰ABAD使293T细胞ATP产生减少(P0.05)。表1：293T细胞过表达ABAD线粒1本功能的比较(xs,n=4)组别ATPROSControl0.98330.047130.66820.06820ABAD1.0210.077440.73970.02966F值2.7005.288P值P0.05P0.05表2：293T细胞干扰ABAD线粒体功能的比较(Xs,n=4)组别
14、ATPROSControlsh-ABAD19.430.907712.841.9710.86290.052880.82170.02315F值4.7175.217P值P0.052、在不同AP浓度刺激下，293T细胞过表达ABAD对线粒体功能的影响为了进一步验证AP刺激下，过表达ABAD对线粒体功能的影响，我们在293T细胞过表达ABAD后，加入5uMA阮42,分别测试其ATP和活性氧。如表3所示，无论有无Ap刺激,过表达ABAD均不能影响293T细胞ATP产量和ROS产生，这可能是AP浓度还不足以与ABAD结合，引起其构象改变，因此我们又增添了两个浓度的APm2(IOuMs20UM)。如表3所示，
15、只有在APm2刺激浓度在IOUM时，过表达ABAD与对照组相比，ATP产量相对减少(P0.05)o这可能是ABAD与ApiK的结合需要一定的浓度范围，浓度范围过低不能竞争结合ABAD,浓度过高，Ap0.05P0.05Control+A(5uM)0.85590.037650.83460.03486ABAD+A(SuM)0.89180.034900.86560.02309F值1.1642.279P值P0.05P0.05Control+A(IOuM)0.93100.047470.77290.05607ABAD+A(IOuM)0.66070.086390.84370.1290F值2.4845.294P
16、值P0.05Control+A(20uM)ABAD+A(20uM)0.86030.015100.80260.090600.89690.014950.87990.05456F值36.0013.32P值P0.05P0.053、在293T细胞过表达ABAD对线粒体自噬蛋白水平的影响过表达ABAD对线粒体功能无明显影响，且只在A。4特定浓度下，线粒体ATP产生减少。为进一步探究过表达ABAD与线粒体自噬的关系，我们在293T细胞中过表达ABAD24h,再用线粒体自噬诱导剂CCCP20uM处理6小时，观察线粒体自噬相关蛋白P62和LC3B的蛋白水平。如图1、表4所示，在293T细胞中过表达ABAD,P6
17、2蛋白水平下降(P0.05),但不影响LC3B蛋白水平，提示正常ABAD过表达可能影响溶酶体，因为P62是溶酶体的标志蛋白。ControlControlABADABADLC3BP62ABAD-actinDMSOCCCP+-+-+图1在CCCP自噬诱导剂诱导下，293T细胞过表达ABAD不引起线粒体自噬发生。表4：293T细胞过表达ABAD线粒体自噬相关蛋白P62和LC3B的比较(xs,n=6)组别ABAD蛋白P62LC3BControl+DMSO1.2840.14111.4050.15611.8720.2616ABAD+DMSO4.7950.43981.0280.044591.8120.045
18、39F值9.71612.2533P值P0.05P0.05Control+CCCP1.0700.16831.2890.14522.5500.2500ABAD+CCCP4.1290.36620.80070.068202.7680.1943F值4.7344.5361.655P值P0.05P0.054、在A032刺激下，293T细胞过表达ABAD对线粒体自噬蛋白水平的影响只在Amy210uM诱导下，过表达ABAD可使线粒体ATP的产生减少，因此考虑ATP产生受损是否会诱发线粒体自噬，故我们在293T细胞中过表达ABAD,加入A-4210uM24小时，再加入CeCP诱导剂20UM6小时，观察线粒体自噬蛋
19、白水平的变化，如图2、表5所示，在A/刺激下，CeCP诱导自噬过程中，293T细胞过表达ABAD使P62蛋白水平降低、LC3B水平升高（PV0.05）,提示过表达ABAD在Az2刺激下促进线粒体自噬发生。ABAD-actinDMSOCCCP图2在ABi2IOW刺激下，293T细胞过表达ABAD促进线粒体自噬发生表5：ABi210UM刺激下，293T细胞过表达ABAD线粒体自噬相关蛋白P62和LC3B的比较(x+s,n=6)组别ABAD蛋白P62LC3BControl+DMSOABAD+DMSO2.6181.17133.610.99490.69840.043080.57640.034290.49
20、900.050320.24070.01333F值1.3851.57814.25P值P0.05P0.05Control+CCCPABAD+CCCP1.5240.380841.521.6760.76210.052150.61840.021060.75830.033440.92890.03241F值19.366.1291.065P值P0.05P0.05P0.053讨论ABAD属于羟基雷体脱氢能家族，在成人和胎儿的大脑海马和杏仁核的神经元细胞中表达最为丰富。在小鼠和爪蟾胚胎的研究显示，胚胎早期丧失ABAD可能是致命的，因为在小鼠胚胎中敲除ABAD基因，小鼠胚胎早期出现因线粒体功能隙碍引起的细胞凋亡和死
21、亡，这意味着其在细胞存活中起着重要作用，且研究还发现这种作用独立于其醐的催化活性，可能只是它的存在，提供了某些结构功能或者维持结构的完整性。研究发现，ABAD的LD区域可特异性与AB结合，导致ABAD结构异常，不能发挥能活性，线粒体膜通透性发生变化，进而导致线粒体窘迫和细胞毒性。同时，也有报道表明，使用ABAD诱骗肽(ABAD-DP)来拮抗A和ABAD的结合能保护神经元线粒体功能，而ABAD与A分离,则能使线粒体、神经元免受AP的毒性阳2】。线粒体自噬是各种内外刺激诱发、由自噬囊泡包裹并吞噬受损的线粒体或需要降解的蛋白质，通过与溶酶体相结合，形成自噬溶酶体，降解其包裹的内容物的过程。当线粒体受
22、损程度超出线粒体融合所不能中和的范围，机体将促线粒体进行分裂，通过线粒体自噬途径将受损线粒体清除，其中LC3B和P62是检测自噬通量的两个主要标志物。自噬发生时，新生成的LC3则从胞浆型LC3转变为膜型LC3；P62作为特异性底物，与LC3相互作用，在自噬-溶酶体通路中被降解，通过测量LC3比值和P62水平可评估自噬水平的高低。但当线粒体轻微应激时，则可能通过融合方法，将轻度受损的线粒体成分与健康的线粒体成分结合，以中和损伤的影响WL本研究发现，在293T细胞中，过表达ABAD并不会影响线粒体功能，而干扰ABAD则只能影响线粒体ATP的生成。仅在IOUM浓度A.42刺激下影响线粒体ATP的生成
23、，并促线粒体自噬发生。综上，考虑出现这些情况的原因可能有以下几点：1、神经元是富需能场所，更易受A0聚集的破坏。Ap32对293T细胞产生的毒性作用亚于神经元细胞;2、ABAD作为线粒体成分，但其含量较小，其与A的结合仅些微改变线粒体功能；3、考虑到线粒体功能受损影响功能可能存在次序，而非同步出现，轻微的损伤只影响ATP的生成，而活性氧产生可能是后期受损严重的结果；4、线粒体严重受损才能诱发线粒体自噬，CCCP诱导剂本身也是具备毒性作用，加上ABAD与A的相互作用产生的毒性作用，才足以破坏线粒体，促使线粒体自噬发生。综上所述，过表达ABAD不影响293T细胞的线粒体功能，在特定浓度A042刺激
24、下促进线粒体自噬发生。本次研究尚有很多不足之处，如线粒体功能及线粒体自噬检测方式多样，细胞器的选择及补充等，相关的实验还需进一步探究以明确ABAD与A的结合影响线粒体功能及自噬这一机制。参考文献1VinklarovaL,SchmidtM,BenekO,etal.Friendorenemy?Reviewof17beta-HSD10anditsroleinhumanhealthordiseaseJ.JNeurochem,2020.2张万飞，叶建新人类17p-羟基类固醇脱氧酶的功能J.海南医学,2008(01):127-130.3苏文，许华敏，康继宏，等.17-羟基类固醇脱氧酶的功能J生理科学进展，
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