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1、IPBait-AbAi载体的构建(酵母报道子的构建)注：酵母报道子(pBait-AbAi)包含目的顺式作用元件的一个或多个拷贝，且插入到pAbAi载体4必报告基因的上游。大量研究表明最有效的构建应包含目的DNA三个以上的首尾连接的拷贝。首尾连接的拷贝产生方式很多，但对于长度小于20bp的调控元件，人工合成寡核甘酸是最方便可靠的途径。(1)设计并合成包含目的序列的两条反向平行的寡核昔酸序列，且两端加上与PAbAi载体酶切产物一致的粘性末端(建议合成一个目的序列的突变序列作为对照，以排除可能的假阳性)。(2)用TEbuffer溶解寡核甘酸至终浓度100molL(3)将正向链和反向链按照1:1的比例
2、混合(退火后的双链寡核甘酸最大浓度为50molL)o(4) 95。C保温30s,去除二级结构。(5) 72。C保温2min,37。C保温2min,25。C保温2min。注：缓慢退火，有助于双链寡核苜酸的形成。(6)冰上放置。退火后的产物可贮存在-20。C冰箱备用。(7)酶切1LpAbAi载体，用凝胶回收纯化或柱纯化的方式纯化酶切产物。注：回收前，可用琼脂糖凝胶检测是否酶切完全。(8)将退火后的寡核甘酸稀释100倍至终浓度为05molL0(9)在连接反应管中加入如下成分：pAbAi载体(50ngL)1.0Lannealedoligonucleotide(0.5molL)1.0L10T4DNAli
3、gasebuffer1.5LBSA(10mgmL)0.5LNuclease-freeHO10.5LT4DNAligase(400UL)0.5L总体积15L注：如果有必要，可用1Lnuclease-free凡0代替寡核甘酸作为阴性对照。(10)将反应体系室温放置连接3h,转化Ecoli,采用常规方法检测阳性克隆。注：可用酶切或测序进行检测。2质粒转化酵母细胞，生成Bait-RePorIer酵母菌株(图)图3Bait-Rcportcr酵母菌株生成原理示意图(1)用BstBI或者BbsI酶切2LpBait-AbAi,pMutant-AbAi,p53-AbAi质粒,使其在URA3基因处断开，纯化酶切产
4、物。(2)按MatchmakerYeastTransformationSystem2的步骤用1l酶切后的质粒转化YlHGold酵母。(3)稀释每个转化体系至1/10、1/100、1/1000,分别取每个稀释物均匀涂于SD-Ura琼脂平板上。3d后挑取5个单克隆，MatchmakerInsertCheckPCRMixl进行PCR检测阳性克隆，用YlHGOkI的单克隆做阴性对照。(4)在PCR管中力口25lPCR-gradeH2Oo(5)用干净的枪头轻轻接触酵母单克隆，以获得非常少量的酵母细胞。将枪头伸进PCR-grade也0中搅拌，使酵母细胞散开。注：切忌挑取整个酵母单克隆，因为细胞过多会阻止P
5、CR反应的进行。如果加入细胞后水变浑浊，证明加入了过多的酵母细胞。(6)向每个管中加入25lMatchmakerInsertCheckPCRMix,混匀，离心。每个PCR管中现已含有如下反应物：MatchmakerInsertCheckPCRMix25lH20yeast25l50 l总体积(7)按下述程序进行PCR反应；951min98IOs、5530SA30cycles682min.(8)取5lPCR产物，用1%的琼脂糖凝胶电泳分析。注：引物与4必基因以及UR43下游的YIHGold基因组结合，扩增片段长约1.4kbo图4PCR检测PBait-AbAi的插入情况正确的PCR检测结果应是：阳性
6、对照：1.4kb阴性对照：无条带诱饵菌株：1.35kb+insertsize(9)分别挑取PCR检测呈阳性的诱饵克隆和p53-AbAi对照克隆，在SDZ-Ura平板上划线培养。30孵育3d后，将平板置于4保存，即为新构建的YIHGoldBait/AbAi菌株和p53AbAi对照菌株。(10)经过长期放置后，挑取单克隆在YPDA液体培养基中过夜培养，离心收集菌体，用ImL预冷培养基(100ml灭菌的YPDA与50ml灭菌的75%甘油混合)重悬菌体，速冻后与-70。C保存。3检测诱饵菌株人必基因的表达在不存在捕获物的情况下，由于克隆到pAbAi载体中的诱饵序列不同，诱饵菌株报告基因的本底表达水平也
7、不相同。例如：p53-AbAi对照的最低aureobasidinA抑制浓度为100ngml0注：酵母单杂交实验成功的前提是没有内源转录因子能够与目的序列结合或者结合能力非常弱。因此在进行文库筛选之前，检测所构建的诱饵菌株b4基因的表达情况十分重要。所以需要进行实验以确定进行文库筛选时抑制诱饵菌株报告基因本底表达所需的AbA浓度。(1)分别挑取诱饵克隆和对照克隆，用0.9%Nael重悬细胞，调节A600到0.002(大约2000个细胞/100l)o(2)在下述培养基上分别涂布100l重悬后的菌液，30。(3培养23(1。SD-UraSD-UraW讪AbA(100ng/mL)SDZ-Urawith
8、AbA(150ng/mL)SDZ-UrawithAbA(200ng/mL)预期结果如下所示：表1力必基因预期本底表达结果AbA/(ng/mL)YlHGoldp53-AbAi克隆数YlHGoldpBait-AbAi克隆数0约2000约20001000Baitdependent1500Baitdependent2000Baitdependent(3)在进行文库筛选时，使用AbA的浓度应为最低抑制浓度，或使用比最低抑制浓度稍高的AbA浓度(高约50-100ng/mL),以彻底抑制诱饵菌株的生长。注：如果200ng/mLAbA不能抑制本底表达，可以尝试提高AbA浓度至5(X)-1000ngmLo然而，
9、在不存在捕获物的情况下，如果100ongmL的AbA浓度仍无法抑制Ab4基因的表达，那么很可能存在能够识别并与目的序列结合的内源调控因子，因而该目的序列无法用来进行酵母单杂交筛选。4文库CDNA的合成提取试材总RNA,进行反转录合成CDNAo合成的CDNA末端具有与pGADT7-Rec相同的酶切位点。(1)CDNA第一链的合成准备高质量的PolyA和/或总RNA,用humanplacentapolyA+RNA作为阳性对照。注：RNA的质量决定文库的质量，RNA应为所要研究的特定时期和特定组织的RNAo在微量离心管中加入如下反应物：RNA模板(0.025-1.0gpolyA和/或0.10-2.0
10、g总RNA)1-2lCDSIII(oligo-dT)orCDSIII6(random)引物LOlDeionizedH2O(使总体积达到4.0l)1-2l总体积4.0l在另外一支管中加入对照CDNA反应物，即RNA使用1l(1g)controlpolyA+RNAo72。C孵育2min。冰上放置2min,轻轻混匀，立即加入步骤中的试剂。每一个反应加入如下试剂，轻轻混匀离心。5first-strandbuffer2.0lDTT(100mmolZL)1.0ldNTPmixture(10mmol/L)1.0lSMARTM-MLVRT1.0l总体积5.0l注：步骤中的试剂可在步骤之前加好置于冰上。此步是C
11、DNA合成的起始关键步骤，变性后的RNA/引物mix冰上放置的时间不应超过2mino如果用的是CDS11I6随机引物，25-30Oe保温10min。如果用的是CDSIII引物，省略此步，进行步骤。42。C保温IOmino加入1lSMARTIIIoligo,充分混合,42。C保温Iho75。C保温IOmin终止第一链的合成。降至室温，加入1lRNaseH(2U)O11 37。C保温20mine12 CDNA第一链合成产物应于-20。C保存，可用3个月。(2)longdistancePCR(LD-PCR)合成CDNA第二链根据合成CDNA第一链时使用的RNA量，下表给出了进行LD-PCR时最佳的热
12、循环数。使用的热循环数越少，非特异性PCR产物越少。表2RNA量与最佳热循环数总RNAgPolyARNAg循环数1.0-2.00.5-1.015-200.25-0.50.125-0.250.05-0.250.025-0.12522-2424-26(I)LD-PCR反应混合物中加入如下物质(每个样品做2个100l体系，对照做1个100l体系)：First-strandcDNA(fromprotocolA)2lDeionizedH2O70l10Xadvantage2PCRbuffer10l50XdNTPmix2l5,RACE引物2l3,RACE引物2lMeltingsolution10l50adv
13、antage2polymerasemix2l总体积100l按照以下程序进行PCR反应：1个循环9530sX个循环95IOs686minA1个循环685min0.5-1.020-220.25-0.5取7lPCR产物用1.2%的琼脂糖凝胶检测，检测时使用IkbDNAladder。(2)使用CHRoMASPlN+TE-400柱纯化dscDNA为每一个要纯化的CDNA样品准备一个CHROMASPIN+TE-400tt)将纯化柱翻转几次，充分悬浮gelmatrix。移去柱的顶盖和底盖，将柱放入2ml收集管中。将柱放入离心机，70Og离心5min以消除平衡缓冲液，弃掉收集管中的液体。将柱放入新的收集管中，
14、把CDNA加到gelmatrix的中央，切勿使样品沿柱的内壁流下。注：加到边上易使样品沿柱内壁流下，易混有小片段CDNAo70Og离心5min,纯化的CDNA收集到管中。将两个纯化的CDNA样品合并到一管，测量体积。加入1/10体积3molL醋酸钠(pH5.3),混匀。加入2.5倍体积无水乙醇。(IO)-20。C冰冻lh。(ID室温，14000r/min离心20min。小心弃去上清液，切勿碰到沉淀。14000r/min瞬时离心，去除残留上清液。(M)沉淀于空气中干燥Iomin。注：一般干燥至无乙醇味，不可过度干燥，否则很难溶解。(15)用20l灭菌去离子水溶解沉淀，此CDNA可用来进行同源重组
15、构建文库。纯化后的CDNA用1%的琼脂糖电泳检测。5构建并筛选酵母单杂交文库(CDNA融合表达文库的构建及筛选)(1)构建并在SDALeuZAbA培养基上检测YlHGoIdBait/AbAi菌株。注：AbA的浓度根据构建诱饵教体时转入酵母抑制本底表达时的浓度而定。(2)按SMARTtechnology步骤合成dscDNA,其浓度为25g20L(3)用YeaStTranSformationSyStem2的方法转化酵母，在转化体系中加入如下物质：CDNA文库转化YlHGOkiBait/AbAi菌株20lSMART-amplifieddscDNA(2-5g)6lpGADT7-Rec,(Sma!-li
16、nearized)(3g)YIHGold53/AbAi的转化5lp53fragment(125g)2lpGADT7-Rec,(SmaI-Iinearized)(1g)将转化体系分别稀释至1/10、1/100、1/1000、1/10000后，各取100l涂100mm平板。文库转化涂SDALeu和SD-LeuAbA平板，对照p53转化涂SDALeu和SD-LeuAbA200平板。(4)将剩余的所有文库转化混合物(约15ml)涂在15OmmSD/-Leu/AbA平板上，每板涂150k(5)倒置培养35d。(6)3-5d后，通过统计SDZ-Leu100mm平板上的克隆数目来计算筛选的克隆数。注：所筛选
17、的克隆数至少应该达到1百万，否则会降低筛选到目的产物的可能性。筛选的克隆数=cfumlonSDZ-LeuJdilutionfactorresuspensionvolume(15ml)例如：resuspensionvolume=15mlPlatingvolume=100l250coloniesgrewonthe1/100dilutiononSD-LeuplatesThenumberofclonesscreened=250cfu0.1ml10015ml=3.75million(7)预期结果阳性对照试验：SDLeu和SD/Leu/AbA200培养基上的克隆数相近。文库筛选试验：根据SD-Leu平板上
18、的克隆数计算所筛选的克隆数，其结果应大于1百万且SD-LeuAbA平板上的克隆数远远少于1百万，阳性克隆数目取决于诱饵序列。6阳性克隆的鉴定及CDNA质粒的分离(1)阳性克隆重新划线培养，进行表型确认将阳性克隆在SD-LeuAbA培养基上重新划线，产生新的单克隆。24d后，选择能够正常生长的克隆进行后续分析。(2)酵母克隆PCR消除重复克隆用MatchmakerInsertCheckPCRMix2(Cat.No.630497)进行PCR,对插入到pGADT7载体中的CDNA片段进行扩增。PCR管中加入以下反应物：MatchmakerInsertCheckPCRMix25lH2OZYeast25
19、l总体积50l按下述程序进行PCR反应：941min98IOsI683min.PCR产物在1%的琼脂糖凝胶上进行电泳分析。产物不是单一的条带很正常，这表明在同一酵母细胞不存在一种捕获载体注：为了确认大小相近的条带是否是同一种插入片段，用AlUl或HaeIn或者其它常用的限制性内切酶消化PCR产物，产物用2%的琼脂糖凝胶进行电泳分析。如果大量的克隆含有同一插入片段，则另取50个克隆进行PCR分析。为了快速验证克隆，PCR产物可经过纯化后用T7引物测序。(3)阳性CDNA质粒的分离获取酵母中文库质粒的分开。与转化的大肠杆菌不同，转化的酵母细胞可以含多种相关质粒，这就意味着阳性克隆里不只含有能激活力
20、b4报告基因的质粒，还可能含有一种或多种不表达相互作用蛋白的cDNA质粒。如果不事先将非互作质粒分开出去而直接通过转化大肠杆菌获取质粒，那么很有可能获取到非相互作用的质粒。为了增加获取阳性克隆捕获质粒的几率，可以将阳性克隆在SD-LeuAbA培养基上重复涂布2-3次，每次都挑取单一的克隆进行下一步涂布。从酵母中获取阳性CDNA质粒为了鉴定阳性互作相关的基因，用EasyYeastPlasmidIsolationKit(Cat.No.630467)从酵母中获取阳性质粒。转化ECO并分离阳性CDNA质粒用常用的克隆菌株对阳性CDNA质粒进行克隆，用LB力U100g/mlampicillin进行选择。
21、(4)鉴别阳性和假阳性互作酵母单杂交筛选可能会检测到假阳性，用以下标准可以区分阳性和假阳性阳性：正确的诱饵序列和捕获物都是激活A必报告基因所必需的。假阳性：在诱饵序列突变的情况下，诱饵仍可以激活助4报告基因。用下述程序在选择培养基上对阳性和假阳性相互作用进行确认：用YeastmakerTransformationSystem2的试剂和small-scale转化程序将100ng获取的捕获质粒转化到YlHGoldlBaitZAbAilWYIHGOknMUtant/AbAi菌株中。注：阳性对照和阴性对照实验应该一起进行。SDALeu和SDZ-LeuZAbA培养基上涂100l转化混合物1/10和1/1
22、00的稀释物。30。C恒温培养3-5d后，预期结果如表所示。表3阳性和假阳性相互作用验证结果A阳性样品选择培养基2mm清晰的克隆酵母菌SD-Leu有YIHGokI诱饵/AbAi+靶SD-LeuAbA有酵母菌SD-Leu有Y1HGOId突变/AbAi+靶SDALeuZAbA无（或者很小）B假阳性样品选择培养基2mm清晰的克隆酵母菌SD-Leu有YIHGOld诱饵/AbAi+靶SD-LeuAbA有酵母菌SD-Leu有YlHGold突变/AbAi+靶SD-LeuAbA有（5）阳性克隆的测序分析一旦相互作用被验证为阳性，就可以测序鉴定捕获载体的插入CDNA片段，验证与GAL4AD序列融合的开放阅读框（ORF）序列，并与GenBank.EMBL或其他数据库中的序列进行比较。
