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1、2023/10/10,1,实 验 一氨基酸纸层析,2023/10/10,2,1、通过氨基酸的分离，学习并掌握纸层 析的原理和操作技术；2、掌握分配层析法；3、掌握影响分配系数的因素。,一、实验目的：,2023/10/10,3,层析技术(chromatography 色谱技术),一、发展史：层析分离技术在20世纪初就已得到应用：1903年用于植物色素的分离,各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”1931年用氧化铝柱分离了胡萝卜素的两种同分异构体；1944年出现了以滤纸作为支持物的纸层析；20世纪六十年代末出现了高效液相色谱(HPLC)。,2023/10/10,4,
2、二、定义 层析技术是根据被分离的混合物中各组分的理化性质（分子的形状和大小、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数等）的不同，使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中进行分配。,层析的基本概念,2023/10/10,5,固定相：固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液）。流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质移动的液体、气体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。,层析的基本概念,2023/10/10,6,三、层析技术的种类1、按流动相的状态分类：（
3、1）液相层析（色谱）（2）气相层析（色谱）；2、按固定相的使用形式分类：（1）柱层析（2）纸层析（3）薄层层析；3、按分离过程所主要依据的物理化学性质分类：（1）吸附层析（2）分配层析（3）离子交换层析（4）凝胶层析（5）亲和层析等。,2023/10/10,7,纸层析法：是以滤纸作为惰性支持物的分配层析。滤纸纤维上羟基具有亲水性，因此吸附水作为固定相，通常把有机溶剂作为流动相。将样品点在滤纸上，进行展层，样品中的各种氨基酸在两相溶剂中不断进行分配。由于它们的分配系数不同，不同氨基酸随流动相移动的速率就不同，于是就将这些氨基酸分离开来，形成距原点不等的层析点,二、实验原理:,2023/10/10
4、,8,分配层析法：利用物质在两种或两种以上不同的混合溶剂中的分配系数不同，而达到分离目的的一种实验方法。在一定条件下，一种物质在某种溶剂系统中的分配系数是一个常数。,2023/10/10,9,溶剂系统：正丁醇：甲酸：水=15：3：2 固定相：水和滤纸纤维素有较强的亲和力，因而其扩散作用降低形成固定相;流动相：有机溶剂和滤纸亲和力弱，所以在滤纸毛细管中自由流动，形成流动相。由于混合液中各种氨基酸的值不同，所以移动速率（即迁移率Rf值）就不同，从而达到分离的目的。,2023/10/10,10,移动速率(比移值)：原点到层析点中心的距离 Rf=原点到溶剂前沿的距离,2023/10/10,11,影响R
5、f值的主要因素：Rf决定于被分离物质在两相间的分配系数以及两相间的体积比。由于在同一实验条件下，两相体积比是一常数，所以主要决定于分配系数。不同物质分配系数不同，Rf也就不同。（1）物质的结构和分子极性：物质的结构不同极性不同，在两相中的溶解度也就不同，物质的极性决定了物质在水和有机溶剂之间的分配系数，极性大的易溶于水中即固定相中，Rf小；反之,Rf则较大。,2023/10/10,12,（2）层析溶剂：首先，溶剂的纯度要高。其次，溶剂系统选择应考虑被分离的物质在溶剂系统中的Rf在0.050.85。再次，溶剂系统必须新鲜配制，如正丁醇-甲酸-水系统久放易引起酯化。（3）pH值：溶剂、滤纸和样品的
6、pH值都会影响物质的解离，从而影响物质的极性和溶解度，使Rf改变；,2023/10/10,13,（4）滤纸：层析滤纸由高纯度棉花制成，要求滤纸要清洁，质地均一，厚薄一致，纤维松紧度适中，具有一定的机械强度，要被溶剂所饱和。不同型号的滤纸，其厚薄程度、纤维松紧度各不相同，因此，滤纸纤维结合水的量不一样，两相的体积比也就不同，Rf也不同；另外，滤纸的杂质也会影响Rf，必要时进行预处理（可用0.010.4M的HCl处理除去金属离子）.,2023/10/10,14,（5）室验室的温度和时间:温度影响物质在两相中的溶解度，即影响分配系数；也影响滤纸纤维的水合作用从而影响固定相的体积；也影响溶剂系统的含水
7、量，即影响流动相的组分比例。层析必须在恒温条件下进行。,2023/10/10,15,（6）展开方式：上行法Rf小；下行法（层析缸上部有一盛展开剂的液槽，滤纸点样端向上进入槽中，重现性差，斑点易扩散）Rf大；环行法（最好用无方向性的特制滤纸）用圆形滤纸层析时，由于内圈较外圈小，限制了溶剂的流动，Rf较小。（7）样品溶液中杂质：如氯化钠的存在会影响氨基酸的Rf值。,2023/10/10,16,1、实验材料：谷氨酸、组氨酸、脯氨酸、亮氨酸标准品2、仪器：(1)毛细管(2)电热吹风机(3)层析缸(4)层析滤纸(5)小型玻璃喷雾器(6)铅笔、直尺等。3、试剂：(1)氨基酸标准溶液：亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸
8、、组氨酸标准品。(2)溶剂系统：正丁醇：甲酸：水=15：3：2（体积比）摇匀；(3)显色剂：0.25%的茚三酮丙酮溶液。,三、实验材料、仪器和试剂：,2023/10/10,17,1、样品的准备：称取谷氨酸、组氨酸、脯氨酸、亮氨酸标准品各1mg混合溶于10%异丙醇中，0.01M。2、滤纸的准备：取一长方形滤纸，在滤纸横向对应的两边，距边沿2cm处，各画两条平行线，一条作前沿标志，一条作点样线，在点线上每隔2cm画一个“+”作为点样位置，共5个点。,四、实验步骤：,2023/10/10,18,2023/10/10,19,3、点样：用毛细管点样，中间点混合氨基酸，两侧点四种标准氨基酸；每个，每点一次
9、用晾干后再点下次，点样点的直径应控制在2mm左点样点重复点5次右，点样完毕用大头针将滤纸做成筒形，点样面向外。,2023/10/10,20,2023/10/10,21,2023/10/10,22,4、展层：向层析缸中加入层析溶剂，液面不要超过点样线，（高约1.5cm，约50ml溶剂）将滤纸点样点朝下放入层析溶剂中，将层析缸密闭，待溶剂到达标志线后取出冷风吹干。5、显色：用喷雾器将0.25茚三酮显色剂均匀喷在滤纸上，热风（加快反应）反应吹干显色。,2023/10/10,23,五、实验结果与计算：1、用铅笔将层析色谱轮廓和中心点描出来；2、测量原点至色谱中心和至溶剂前沿的距离，计算 各种已知氨基酸
10、和未知氨基酸的Rf值。3、分析混合样品中未知氨基酸的组分。,2023/10/10,24,2023/10/10,25,六、思考题：1、分析影响分配系数的因素有哪些？2、何谓分配层析法，分配系数？3、茚三酮丙酮溶液的作用机制？,七、思考题答案,1、答：质量比和pH都有影响。当萃取剂浓度、组成、水相成分以及温度等改变时，分离系数就要发生变化。,2023/10/10,26,七、思考题答案,2、答：利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数不同,使之分离。被分离物质在两相中都能溶解，但分配比率不同，展层时就会形成以不同速度向前移动的区带。指一定温度下，处于平衡状态时，组分在固定相中的浓度和在流动相中的浓度之比，以K表示。,2023/10/10,27,七、思考题答案,2023/10/10,28,3、氨基酸与茚三酮在弱酸性溶液中共热，反应后经失水脱羧生成氨基茚三酮，再与水合茚三酮反应生成紫红色，最终为蓝色物质。脯氨酸等仲胺氨基酸与茚三酮反应生成黄色物质。,
