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1、多肽与蛋白质,第二章,Peptides and Proteins,1833年，Payen和Persoz分离出淀粉酶。1864年，Hoppe-Seyler从血液分离出血红蛋白，并将其制成结晶。19世纪末，Fischer证明蛋白质是由氨基酸组成的，并将氨基酸合成了多种短肽。1938年，德国化学家Gerardus J.Mulder引用“Protein”一词来描述蛋白质。,1951年,Pauling采用X（射）线晶体衍射发现了蛋白质的二级结构-螺旋(-helix)。1953年，Frederick Sanger完成胰岛素一级序列测定。1962年，John Kendrew和Max Perutz确定了血红蛋
2、白的四级结构。20世纪90年代以后，后基因组计划。,什么是蛋白质?,蛋白质（protein）是由许多氨基酸（amino acids）通过肽键（peptide bond）相连形成的高分子含氮化合物。,分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含有蛋白质。含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体干重的45，某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达80。,蛋白质的生物学重要性,1.蛋白质是生物 体重要组成成分,1）作为生物催化剂（酶）2）代谢调节作用3）免疫保护作用4）物质的转运和存储5）运动与支持作用6）参与细胞间信息传递,2.蛋白质具有重要的生物学功能,3.氧化供能,肽和蛋白质
3、的一级结构,第一节,Primary Structure of Peptides and Proteins,（一）氨基酸通过肽键相连形成肽/蛋白质,存在自然界中的氨基酸有300余种，组成体内蛋白质的氨基酸（amino acid）有20种，均为L-氨基酸（除甘氨酸外）。,、肽和蛋白质是由氨基酸组成的多聚体,肽键是由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的化学键。氨基酸通过肽键(peptide bond)相互连接而形成多肽和蛋白质。,肽/蛋白质分子中的氨基酸通过脱水生成的共价键被称为肽键(peptide bond)，肽键是一种酰胺键，具有部分双键的性质。,*一分子氨基酸与另一分子氨基
4、酸脱去一分子水缩合成二肽。,*二肽通过肽键与另一分子氨基酸缩合生成三肽,*一般来说，由数个、十数个氨基酸组成的肽习惯称为寡肽(oligopeptide)，而很多氨基酸组成的肽称为多肽（polypeptide）。通常，多肽分子质量10 kD；而蛋白质则是由一条或多条肽链组成的更大分子，但两者两者经常通用。,肽链中的氨基酸分子因脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基(residue)。,氨基末端（amino terminal）或 N 末端：多肽链中有游离氨基的一端称氨基末端(amino terminal)或N-端。羧基末端（carboxyl terminal）或C 末端：多肽链中有游离羧基的一端称为
5、羧基末端(carboxyl terminal)或C-端。,多肽链具有方向性：,多肽链从氨基末端走向羧基末端。,N末端,C末端,牛核糖核酸酶,+,甘氨酰甘氨酸,肽键,肽是根据由N-端至C-端参与其组成的氨基酸残基命名的,（二）体内存在多种重要的生物活性肽,1.谷胱甘肽是体内重要的还原剂,谷胱甘肽(glutathione,GSH),GSH过氧化物酶,GSH还原酶,NADPH+H+,NADP+,2.体内有许多激素属寡肽或多肽,3.神经肽是脑内一类重要的肽,在神经传导过程中起重要作用的肽类称为神经肽(neuropeptide)。,较早发现的有脑啡肽(5肽)、-内啡肽(31肽)和强啡肽(17肽)等。,近
6、年发现的孤啡肽(17肽)，其一级结构类似于强啡肽。,组成蛋白质的元素：,主要有C、H、O、N和S。有些蛋白质含有少量磷或金属元素铁、铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有碘。,二、蛋白质的分子组成和结构极其复杂,各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16。,由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此，只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以下公式推算出蛋白质的大致含量：,100克样品中蛋白质的含量(g%)=每克样品含氮克数 6.25100,1/16%,蛋白质元素组成的特点：,(一)蛋白质的分子组成与结构特征是其分类的基础,1.蛋白质根据分子组成分为单纯蛋白质和结合蛋白质两类：,结合蛋白质及其辅基,3.蛋白质
7、根据其形状分为纤维状蛋白质和球状蛋白质两类，可分为：,2.蛋白质根据结构特点进行分类，可分为：,超家族（super family）家族（family）亚家族（subfamily）,(二)蛋白质分子结构可区分为4个层次,高级结构或空间构象(conformation),一级结构(primary structure)二级结构(secondary structure)三级结构(tertiary structure)四级结构(quaternary structure),三、氨基酸残基的排列顺序决定蛋白质的一级结构,肽键（主要化学键）二硫键,蛋白质一级结构(primary structure)是指蛋白质分
8、子中，从N端到C端的氨基酸排列顺序。形成一级结构的化学键：,一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础，但不是决定蛋白质空间构象的唯一因素。,目 录,四、多肽链中的局部特殊构象是蛋白质的二级结构,蛋白质二级结构(secondary structure)是指蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象。,五、蛋白质一级结构比对可用于同源 蛋白质分析,蛋白质一级结构（氨基酸序列）比对常被用来预测蛋白质之间结构与功能的相似性。,序列比对方法（sequence-comparison method）关键在于将2个序列准确地对齐，使之达到相同
9、序列最大化，插入或删除序列最小化的目的，然后计算相同的氨基酸数。,同源蛋白质仅指同一基因进化而来的蛋白质。,序列相似但非进化相关的2个蛋白质的序列，常被称为相似（analogy）序列。,第二节 肽、蛋白质的高级结构,Three Dimentional Structure of Peptides and Proteins,蛋白质的二级结构(secondary structure)是指组成蛋白质的肽链的主链的空间结构，也就是肽链主链骨架原子的相对空间位置，不涉及氨基酸残基侧链的构象。,一、多肽链中的局部特殊构象是蛋白质 的二级结构,肽链主链骨架原子包括N（氨基氮）、C（-碳原子）和CO（羰基碳）3
10、个原子依次重复排列。,-螺旋(-helix)-折叠(-pleated sheet)-环-转角(-turn)无规卷曲(random coil),蛋白质二级结构的主要形式：,维系二级结构的主要化学键：氢键,（一）肽键是一个刚性的平面,参与肽键的6个原子C1、C、O、N、H、C2位于同一平面，C1和C2在平面上所处的位置为反式(trans)构型，此同一平面上的6个原子构成了所谓的肽单元(peptide unit)。,（二）-螺旋是常见的蛋白质二级结构,（三）-折叠使多肽链形成片层结构,（四）-转角和无规卷曲在蛋白质分子中普遍存在,-转角,无规卷曲是用来阐述没有确定规律性的那部分肽链结构。,（五）模体
11、是蛋白质的超二级结构,在许多蛋白质分子中，由几个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近、相互作用，所形成的折叠模样，称为超二级结构（supersecondary structure），又称折叠（fold）或模体（motif）。,超二级结构形式有3种：，,钙结合蛋白中结合钙离子的模体,锌指结构,（六）氨基酸残基的侧链可影响二级结构的形成,蛋白质二级结构是以一级结构为基础的。一段肽链其氨基酸残基的侧链适合形成-螺旋或-折叠，它就会出现相应的二级结构。这是氨基酸残基的侧链的相互作用可稳定或去稳定相应的二级结构的原因。,一段肽链有多个谷氨酸或天冬氨酸残基相邻，则在pH7.0时，这些残基的游离羧基都带负电
12、荷，彼此相斥，妨碍-螺旋的形成。同样，多个碱性氨基酸残基在一肽段内，由于正电荷相斥，也妨碍-螺旋的形成。,天冬酰胺、亮氨酸的侧链很大，也会影响-螺旋形成。,脯氨酸的结构不利于形成-螺旋。,形成-折叠的肽段要求氨基酸残基的侧链较小，才能容许两条肽段彼此靠近。,二、多肽链在二级结构基础上进一步折叠形成蛋白质三级结构,蛋白质的三级结构(tertiary structure)是指整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置，包括一级结构中相距甚远的肽段的空间位置关系。,（一）三级结构是指整条多肽链的空间分布,肌红蛋白(Mb),肌红蛋白（myoglobin）是一个单个肽链
13、的球状蛋白质，由153个氨基酸残基构成，含有1个血红素（heme）辅基。,(二)维持三级结构稳定主要依靠非共价键,蛋白质三级结构的形成和稳定主要靠弱的相互作用力或称非共价键、次级键，主要有氢键、范德华力（Van der Waals force）、疏水作用（hydrophobic interactin）和盐键（salting bond）（又称离子键）等。,纤连蛋白分子的结构域,（三）三级结构可含有功能各异的结构域,在二级结构或超二级结构的基础上，多肽链可形成在三级结构层次上的局部折叠区，称为结构域(domain)。,（四）根据结构域可对蛋白质进行分类：,根据结构域可将球状蛋白质分为4类：反平行螺
14、旋结构域（全-结构）平行或混合型折叠片结构域（，-结构）反平行折叠片结构域(全-结构)富含金属或二硫键结构域（不规则小蛋白质结构）,A.全-结构域 B.平行或混合型折叠片结构域C.全-结构域 D.富含二硫键结构域,（五）分子伴侣参与蛋白质的折叠,分子伴侣(chaperon)通过提供一个保护环境从而加速蛋白质折叠成天然构象或形成四级结构。,*分子伴侣可逆地与未折叠肽段的疏水部分结合随后松开，如此重复进行可防止错误的聚集发生，使肽链正确折叠。,*分子伴侣也可与错误聚集的肽段结合，使之解聚后，再诱导其正确折叠。,*分子伴侣在蛋白质分子折叠过程中二硫键的正确形成起了重要的作用。,目前已知参与蛋白质折叠
15、的分子伴侣可分为3类：热激蛋白70(Hsp70)：Hsp70在真核和原核生物中高度保守，它可部分逆转变性或聚集的蛋白质。伴侣蛋白(chaperonin)：伴侣蛋白普遍存在于细菌、线粒体、叶绿体和真核生物，主要有2个家族：Hsp60（在大肠杆菌中又称为GroEL）和Hsp10。核质蛋白(nucleoplasmin),伴侣蛋白在蛋白质折叠中的作用,各亚基间的结合力主要是氢键和离子键。,三、多亚基的蛋白质具有四级结构形式,蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构。,体内有许多蛋白质分子含有二条或多条多肽链，每一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白质的亚基(su
16、bunit)。,（一）具有四级结构形式的蛋白质由多亚基组成,血红蛋白的四级结构,（二）亚基通过亚基间的相互作用联系在一起,由2个亚基组成的蛋白质四级结构中，若亚基分子结构相同，称之为同二聚体(homodimer)，若亚基分子结构不同，则称之为异二聚体(heterodimer)。,（三）生物体内有很多由多亚基组成的蛋白质,生物体内许多蛋白质往往由多个亚基组成，亚基之间凭借次级键形成蛋白质四级结构。,胰岛素受体：由4个亚基组成(22)，亚基与亚基形成单体(monomer)，2个单体形成二聚体(dimer)。,血红蛋白的一、二、三、四级结构,蛋白质结构与功能的关系Structure and Func
17、tion of Proteins,第三节,（一）一级结构是空间构象的基础,一、蛋白质一级结构是高级结构与功能的基础,天然状态，有催化活性,尿素、-巯基乙醇,去除尿素、-巯基乙醇,非折叠状态，无活性,（二）一级结构相似的蛋白质具有相似的高级结构与功能,氨基酸残基序号胰岛素 A8 A9 A10 B30 人 Thr Ser Ile Thr 牛 Ala Ser Val Ala 猪 Thr Ser Ile Ala 羊 Ala Gly Val Ala 马 Thr Gly Ile Ala 狗 Thr Ser Ile Ala,促肾上腺皮质激素(ACTH)和促黑激素(-MSH,-MSH)共有一段相同的氨基酸序列
18、，因此，ACTH也可促进皮下黑色素生成，但作用较弱。,(三)氨基酸序列提供重要的生物化学信息,一些广泛存在于生物界的蛋白质如细胞色素(cytochrome C)，比较它们的一级结构，可以帮助了解物种进化间的关系。,（四）重要蛋白质氨基酸序列的改变可引起疾病,例：镰刀形红细胞贫血,这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为“分子病”。,1.肌红蛋白/血红蛋白含有血红素辅基,二、蛋白质空间结构表现功能,血红素结构,(一)血红蛋白构象改变引起功能变化,肌红蛋白(myoglobin，Mb),肌红蛋白是一个只有三级结构的单链蛋白质，有8段-螺旋结构。血红素分子中的两个丙酸侧链以离子键形式与肽链中的两个碱
19、性氨基酸侧链上的正电荷相连，加之肽链中的F8组氨酸残基还与Fe2+形成配位结合，所以血红素辅基与蛋白质部分稳定结合。,血红蛋白(hemoglobin，Hb),血红蛋白具有4个亚基组成的四级结构。Hb各亚基的三级结构与Mb极为相似。Hb亚基之间通过8对盐键，使4个亚基紧密结合而形成亲水的球状蛋白。,Hb与Mb一样能可逆地与O2结合，Hb与O2结合后称为氧合Hb。氧合Hb占总Hb的百分数（称百分饱和度）随O2浓度变化而改变。,2.血红蛋白的构象变化影响结合氧的能力,肌红蛋白(Mb)和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线,协同效应(cooperativity),一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影
20、响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应。如果是促进作用则称为正协同效应(positive cooperativity)如果是抑制作用则称为负协同效应(negative cooperativity),血红素与氧结合后，铁原子半径变小，就能进入卟啉环的小孔中，继而引起肽链位置的变动。,别构效应(allosteric effect),蛋白质空间结构的改变伴随其功能的变化，称为别构效应。,（二）蛋白质构象改变可导致构象病,蛋白质构象疾病（Protein Conformational Diseases）：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能
21、，严重时可导致疾病发生。,蛋白质构象改变导致疾病的机制：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。,这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨丁顿舞蹈病、疯牛病等。,疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protein,PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。正常的PrP富含-螺旋，称为PrPc。PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为-折叠的PrPsc，从而致病。,疯牛病,三、蛋白质的化学修饰、相互作用可改变其功能,最初基因表达的产物蛋白质，并不一定为具有生物学功能的成熟蛋白质，新生蛋白质通常还需要进行蛋白
22、质翻译后的化学修饰（第十八章）。,四、生物信息学探讨蛋白质的结构与功能关系,生物信息学（bioinformatics）是一门基于信息学和计算的新兴交叉学科，应用计算机程序法将复杂的生物学数据进行整合与分析，从而阐明生命现象中难以解释的复杂分子机制。,第四节,蛋白质的理化性质Chemical and Physical Properties of Proteins,一、蛋白质具有两性电离性质,蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。,当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为
23、零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。,蛋白质的等电点(isoelectric point,pI),二、蛋白质具有胶体性质,蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100万之间，其分子的直径可达1100nm，为胶粒范围之内。,蛋白质胶体稳定的因素：颗粒表面电荷水化膜,水化膜,溶液中蛋白质的聚集和沉淀,三、很多因素可引起蛋白质变性,在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。,蛋白质的变性(denaturation),造成变性的因素,如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等。,应用举例临床
24、医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。此外,防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。,若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性。,蛋白质的复性(renaturation),天然状态，有催化活性,尿素、-巯基乙醇,去除尿素、-巯基乙醇,非折叠状态，无活性,在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。,蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。,蛋白质沉淀,蛋白质的凝固作用(protein coagulat
25、ion),四、蛋白质在紫外光谱区有特征性吸收峰,由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。,五、蛋白质呈色反应可用于溶液蛋白质测定,（一）蛋白质经水解后产生茚三酮反应,蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应(ninhydrin reaction)。,（二）肽链中的肽键可与双缩脲试剂反应,蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应(biuret reaction)。双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。,蛋白质的分离、纯化、鉴定和结构分析Isola
26、tion,Purification,Identificationand Structural Analysis of Proteins,第五节,一、透析及超滤法可清除蛋白质溶液中的小分子化合物,利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。,应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。,超滤法,透析(dialysis),二、丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀是常用的蛋白质沉淀方法,使用丙酮沉淀时，必须在04低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。,盐析(salt precipitation)
27、是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。,将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。,免疫沉淀法（immunoprecipitation）,三、电泳是蛋白质分离与鉴定的常用方法,蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术,称为电泳(elctrophoresis)。根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白
28、质分子量的测定。等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。双向凝胶电泳，蛋白质组学研究的重要技术。,几种重要的蛋白质电泳：,四、应用相分配或亲和原理可将蛋白质进行层析分离,待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的。,层析(chromatography),离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析，利用各蛋白质分子大小不同分离。,蛋白质分离常用的层析方法,五、利用
29、蛋白质颗粒沉降行为不同可进行超速离心分离,超速离心法(ultracentrifugation)既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。,蛋白质在离心场中的行为用沉降系数(sedimentation coefficient,S)表示,沉降系数与蛋白质的密度和形状相关。,因为沉降系数S大体上和分子量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状的高度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。,六、用化学或反向遗传学方法可分析或演绎多肽链的氨基酸序列,分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成（离子交换层析）,测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基,把肽链水解成片段，分别进行分析,
30、测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法,一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。,氨基酸和肽的末端测定法,通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列：,按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列,分离编码蛋白质的基因,测定DNA序列,排列出mRNA序列,七、应用物理学、生物信息学原理可进行蛋白质空间结构测定或预测,通常采用圆二色光谱(circular dichroism，CD)测定溶液状态下的蛋白质二级结构含量。-螺旋的CD峰有222nm处的负峰、208nm处的负峰和198nm处的正峰3个成分；而-折叠的CD谱不很固定。,（一
31、）圆二色光谱可估算蛋白质二级结构比例,X射线衍射法(X-ray diffraction)和核磁共振技术(nuclear magnetic resonance,NMR)是研究蛋白质三维空间结构最准确的方法。,（二）X射线衍射法和核磁共振技术用于 三维空间结构分析,*用分子力学、分子动力学的方法，根据物理化学的基本原理，从理论上计算蛋白质分子的空间结构。,（三）根据蛋白质的氨基酸序列预测三维空间 结构,*通过对已知空间结构的蛋白质进行分析，找出一级结构与空间结构的关系，总结出规律，用于新的蛋白质空间结构的预测。,第六节 血浆蛋白质 Plasma Proteins,一、采用电泳法可将血浆蛋白质分成若
32、干组分,电泳法是分离、分析血浆蛋白质的主要方法。采用醋酸纤维素膜电泳，可将血浆蛋白质分为5个组分。按泳动快慢依次为：清蛋白、1-、2-、-和-球蛋白（globulin）。而采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)可将血浆蛋白分离出100种以上。,血浆蛋白的电泳图,血浆蛋白质主要成分及功能,二、血浆中大多数蛋白质具有特殊的生物学功能,（一）血浆蛋白质大多数属于分泌性蛋白质,（二）清蛋白是血浆中含量最多的蛋白质,（三）很多血浆蛋白具有特殊的结合功能,（三）很多血浆蛋白具有特殊的结合功能,1前清蛋白运输视黄醇,2运铁蛋白是铁的转运载体,3甲状腺素结合球蛋白运输甲状腺素,4结合珠蛋白-血红蛋白复合物可防止血红 蛋白在肾小管沉积,5血浆铜蓝蛋白可结合铜,6免疫球蛋白与机体的防御机制,
