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1、第三章 氨基酸,一、氨基酸蛋白质的构件分子,二、氨基酸的分类,三、氨基酸的酸碱化学,四、氨基酸的化学反应,五、氨基酸的光学活性和光谱性质,六、氨基酸混合物的分析分离,一、氨基酸蛋白质的构件分子,（一）蛋白质的水解,蛋白质的水解可分为完全水解和部分水解两种情况。,（1）酸水解 常用H2SO4(4mol/L)和HCl(6mol/L)进行水解。色氨酸破坏，天冬酰胺、谷胺酰胺脱酰胺基。,（2）碱水解 用5mol/L的NaOH水解，氨基酸消旋，色氨酸稳定。,（3）酶水解 水解位点特异，为部分水解。用于一级结构分析。,（二）氨基酸的一般结构,1809年发现Asp，1938年发现Thr，目前已发现180多种
2、。但是组成蛋白质的aa常见的有20种，称为基本氨基酸或蛋白质氨基酸（编码蛋白质的氨基酸），还有一些称为稀有氨基酸，是多肽合成后由基本aa经酶促修饰而来。此外还有存在于生物体内但不组成蛋白质的非蛋白质氨基酸(约150种)。,（1）具有酸性的COOH基及碱性的NH2基，为两性电解质。（2）如果RH，则具有不对称碳原子，因而是光活性物质。,旋光性 在天然氨基酸中，只有甘氨酸无旋光性，因为只有含不对称碳的氨基酸才有旋光作用。甘氨酸无不对称碳故无旋光性。,极性 从氨基酸在不同溶剂中的溶解度和氨基酸的R基团在溶剂中的定位，可知有些氨基酸的R残基是亲水性的称极性基(如酸基、碱基、脂族醇、酰胺基)，有的是疏水
3、性的称非极性基(如脂族和芳香族支链)。含极性基团的氨基酸称极性氨基酸，含非极性基团的氨基酸称非极性氨基酸。,极性基可同其他相应基团形成氢键或离子键。非极性基团(疏水性基团)相互间的作用对天然蛋白质分子的空间构象和稳定性都起极大作用。,二、氨基酸的分类,（一）常见的蛋白质氨基酸,1、按照R基的化学结构,（1）脂肪簇氨基酸,中性氨基酸：Gly、Ala、Val、Leu、Ile含羟基或硫氨基酸：Ser、Thr、Cys、Met酸性氨基酸及其酰胺：Asp、Glu、Asn、Gln碱性氨基酸：Lys、Arg,（2）芳香簇氨基酸,Phe、Tyr、Trp,（3）杂环簇氨基酸,His、Pro,2.按R的极性性质,（
4、1）非极性R基氨基酸,Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、Met,（2）不带电荷的极性R基氨基酸,Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln,（3）带正电荷的R基氨基酸,（4）带负电荷的R基氨基酸,Lys、Arg、His,Asp、Glu,侧链极性(疏水性程度),胶原蛋白中的Lys侧链氧化时能形成很强的分子间(内)交联。Arg的胍基碱性很强，与NaOH相当。His是一个弱碱，是天然的缓冲剂，它往往存在于许多酶的活性中心。非极性aa一般形成蛋白质的疏水核心，带电荷的aa和极性aa位于表面。酶的活性中心：His、Ser、Cys,（二）不常见的蛋白质氨基酸,有些不常见的
5、氨基酸在某些蛋白质中存在，是由相应的常见氨基酸经修饰而来。,在结缔组织的胶原蛋白中有5-羟赖氨酸、4-羟脯氨酸；肌球蛋白含有甲基化的氨基酸（6-N-甲基赖氨酸）；凝血酶原中发现了羧基谷氨酸；细菌紫膜质中存在焦谷氨酸；甲状腺蛋白中Tyr的衍生物：3.5-二碘酪氨酸、甲状腺素；等。,（三）非蛋白质氨基酸,除参与蛋白质组成的20多种氨基酸外，生物体内存在大量的氨基酸中间代谢产物，它们不是蛋白质的结构单元，但在生物体内具有很多生物学功能。,（1）L-型氨基酸的衍生物：L-瓜氨酸和L-鸟氨酸（2）D-型氨基酸：D-Glu、D-Ala（肽聚糖中）、D-Phe（短杆菌肽S）（3）-、-、-氨基酸：-Ala（
6、泛素的前体）、-氨基丁酸（神经递质）。,三、氨基酸的酸碱化学,（一）氨基酸的兼性离子形式,-氨基酸都含有-COOH和-NH2，都是不挥发的结晶固体，熔点200-350，不溶于非极性溶剂，而易溶于水，这些性质与典型的羧酸（R-COOH）或胺（R-NH2）明显不同。,三个现象：晶体溶点高离子晶格，不是分子晶格。不溶于非极性溶剂极性分子 介电常数高（氨基酸使水的介电常数增高，而乙醇、丙酮使水的介电常数降低。）水溶液中的氨基酸是极性分子。,原因：-羧基pK1在2.0左右，当pH3.5，-羧基以-COO-形式存在。-氨基pK2在9.4左右，当pH8.0时，-氨基以-NH3+形式存在。在pH3.5-8.0
7、时，带有相反电荷，因此氨基酸在水溶液中是以两性离子离子形式存在。,（二）氨基酸的解离,氨基酸的两性解离性质及等电点（pI）,pH=pI 净电荷=0,pH pI净电荷为正,pH pI净电荷为负,(pK1),(pK2),当氨基酸溶液在某一定pH值时，使某特定氨基酸分子上所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的pH值即为该氨基酸的等电点(isoelctric point)。,在pH2.34和pH9.60处，Gly具有缓冲能力。起点：100%Gly+净电荷：+1第一拐点：50%Gly+，50%Gly 平均净电荷：+0.5 pH=pK+lgGly/Gly+=pK1=2
8、.34第二拐点：100%Gly 净电荷：0 等电点pI第三拐点：50%Gly，50%Gly-平均净电荷：-0.5 pH=pK2+lgGly-/Gly=pK2=9.6终点：100%Gly-净电荷：-1,His咪唑基的pKa值为6.0，在pH7附近有明显的缓冲作用。在生理条件下，只有His有缓冲能力。血红蛋白中His含量高，在血液中具很强的缓冲能力。,甘氨酸滴定曲线,甘氨酸盐酸盐（A+）,等电点甘氨酸（A）,甘氨酸钠（A-）,（三）氨基酸的等电点,氨基酸在等电点状态下，溶解度最小。,pHpI时，氨基酸带负电荷，-COOH解离成-COO-，向正极移动。pH=pI时，氨基酸净电荷为零。pHpI时，氨基
9、酸带正电荷，-NH2解离成-NH3+，向负极移动。,四、氨基酸的化学性质,（一）氨基参加的反应,1.与亚硝酸的反应,氨基酸的-氨基定量地与亚硝酸作用产生羟酸和N2，所生成的N2可用气体分析仪器加以测定，这是Van Slyke氏氨基氮测定法的原理。,2.与甲醛的反应,氨基酸两性离子的NH3+是弱酸，其pKa为9.7左右，完全离解时溶液的pH约为10，超出酸碱滴定指示剂的显色范围，不能用一般指示剂，例如酚酞，作酸碱滴定。但当氨基酸的氨基与中性甲醛结合成氨基酸二羟甲基衍生物后，其氨基的碱性即大大减少，反应向右进行，两性离子中NH3+基的离解度增加，释出H+质子，NH3+的pKa值降低到6.5左右，溶
10、液的pH降至6.7左右，此时NH3+离解释出的H+即可以酚酞作指示剂用标准NaOH溶液加以滴定。每释出的一个H+就相当于一个氨基酸。甲醛滴定可用来测定蛋白质的水解程度。当氨基酸溶液中存在1mol/L甲醛时，滴定终点由pHl2左右移至9附近，亦即酚酞指示剂的变色区域。这就是甲醛滴定法的基础。,3.酰基化和烃基化反应,氨基酸氨基的一个H可被酰基或烃基(包括环烃及其衍生物)取代，这些取代基对氨基酸的氨基有保护作用。,（生物体内）在酶和ATP存在条件下，羧酸也可与氨基酸的氨基作用，形成酰基化产物。苯甲酸与Gly的氨基的酰基化反应是生物体内解毒作用的一个典型的例子。苯甲酸是食品防腐剂，在生物体内转变成N
11、-苯甲酰-Gly后，可经尿排出。,-氨基中的氮是一个亲核中心，能发生亲核取代反应。强亲电的有机物能与-NH2发生烷基化反应。第一次大战中使用的芥子气，它的主要作用是使氨基酸的-氨基烷基化，从而破坏蛋白质的正常功能。,Sanger反应,二硝基苯基氨基酸（DNP-氨基酸），黄色，层析法鉴定，被Sanger用来测定多肽的NH2末端氨基酸。,Edman反应,PTH-氨基酸，无色，可以用层析法分离鉴定。被Edman用来鉴定多肽的NH2末端氨基酸。,4.形成西佛碱反应,氨基酸的氨基与醛类反应，生成西佛碱。,西佛碱是以氨基酸为底物的某些酶促反应例如转氨基反应的中间物。,5.脱氨基化学,氨基酸经氧化剂或酶(如
12、氨基酸氧化酶)的作用即脱出氨产生酮酸。,氨基酸的氨基还可通过酶的作用将氨基转移给酮酸以形成新氨基酸。,（二）羧基参加的反应,氨基酸在有HCl(干氯化氢气)存在下与无水甲醇或乙醇作用即产生氨基酸甲酯或乙酯。,1.成酯和成盐反应,如将氨基酸与NaOH起反应，则得氨基酸钠盐。当氨基酸的羧基变成乙酯(或甲酯)，或钠盐后。羧基的化学性质就被掩蔽了(或者说羧基被保护了)，而氨基的化学性质就突出地显示出来(或者说氨基被活化了)，可与酰基结合。,酰化氨基酸同PCl5或PCl3在低温下起作用，其COOH基即可变为COCl基：,2.酰氯化反应,这个反应可使氨基酸的羧基活化，使之易与另一氨基酸的氨基结合，在合成肽的
13、工作上是常用的。,在体外，氨基酸酯与氨(在醇溶液中或无水状态)作用即可形成氨基酸酰胺。,3.成酰胺反应,动、植物机体在ATP及天冬酰胺合成酶存在情况下可利用NH+4与天冬氨酸作用合成天冬酰胺；同样，谷氨酸与NH+4作用产生谷氨酰胺。,生物体内的氨基酸经脱羧酶(一种催化氨基酸脱羧反应的生物催化剂)作用就放出CO2和产生相应的胺。,4.脱羧反应,大肠杆菌含有一种谷氨酸脱羧酶专使谷氨酸脱羧。,人体和动物体中的胺也是由于氨基酸脱羧产生的。,氨基酸可以通过酰基化和酯化先将自由氨基酸变为酰化氨基酸甲酯，然后与联氨和HNO2作用使变成叠氮化合物。,5.叠氮反应,这个反应有使氨基酸的羧基活化的作用，在人工合成
14、肽的工作中也是常用的。,（二）氨基和羧基共同参加的反应,1.与茚三酮反应,从理论上讲，一个氨基酸的氨基与另一氨基酸的羧基可以缩合成肽，其键称肽键。,2.成肽反应,根据此原理，曾利用氨基酸氨基和竣基的某些特有反应合成了若干人工肽链。但必须指出，生物机体利用氨基酸合成肽链的方式并不如此简单，而是通过一系列复杂过程来完成的(详见蛋白质的生物合成)。,（四）侧链R基参加的反应,氨基酸的侧链基团R有下列几种：,1苯环(苯丙氨酸及酪氨酸)2酚基(酪氨酸)3OH基(丝氨酸、苏氨酸)4SH基及SS键(半胱氨酸及胱氨酸)5吲哚基(色氨酸)6胍基(精氨酸)7咪唑基(组氨酸),酪氨酸的酚基在3和5位上容易发生亲电取
15、代反应，例如发生碘化或硝化，分别生成一碘酪氨酸和二碘酪氨酸或一硝基酪氨酸和二硝基酪氨酸：,酪氨酸的酚基还可以与重氮化合物（如对氨基苯磺酸的重氮盐)结合生成桔黄色的化合物：,这就是Pauly反应，可用于检测酪氨酸。,组氨酸的侧链咪唑基与重氮苯磺酸也能形成相似的化合物，但颜色稍有差异，是棕红色。,精氨酸的侧链胍基在硼酸钠缓冲液(pH 89，2535）中，与1，2环己二酮反应，生成缩合物：,在胰蛋白酶水解肽段时，用于保护Arg的NH2，减少作用位点。,色氨酸的侧链吲哚基在温和条件下可被N溴代琥珀酰亚胺氧化。此反应可用于分光光度法测定蛋白质中色氨酸的含量，并能在色氨酸和酪氨酸残基处选择性化学断裂肽键。
16、,蛋氨酸侧链上的甲硫基是一个很强的亲核基团，与烃化试剂如甲基碘容易形成锍盐。,生成的侧链带有正电荷(+NH3)，它为胰蛋白酶水解肽链提供了一个新位点，这对氨基酸顺序测定是很有用的。同时此反应也可用来保护肽链上的SH基、以防止被重新氧化为二硫键。,半胱氨酸可与二硫硝基苯甲酸(缩写为DTNB)或称Ellman氏试剂发生硫醇二硫化物交换反应：,反应中1分子的半胱氨酸引起1分子的硫硝基苯甲酸的释放，它在pH 8.0时，在412nm波长处有强烈的光吸收，因此可利用比色法定量测定一SH基。,硫基很容易受空气或其他氧化剂氧化。硫醇一般遇到的只有两种氧化衍生物：二硫化物和磺酸。,2R-SH 1/2O2 R-S
17、-S-R+H2O2,半胱氨酸的SH基可与另一个SH基结合成二硫键(SS)。SH与SS成一氧化还原体系，在机体氧化还原作用中有一定作用。二硫键存在于多种肽和蛋白质分子中，胰岛素分子中有3个二硫键，核糖核酸酶分子中有4个二硫键。二硫键对蛋白质和多肽分子的立体结构有维系稳定的作用。二硫键可被还原剂破坏产生SH基。SH基可被氧化成磺酸基(HSO3基)。这两种反应在研究胰岛素和含二硫键肽的结构工作中都有用处。,丝氨酸、苏氨酸和羟脯氨酸的OH基能与酸结合成酯。在生物体蛋白质中，丝氨酸常与磷酸结合，酪蛋白中含有大量的丝氨酸磷酸酯。,五、氨基酸的光学活性和光谱性质,（一）氨基酸的光学活性和立体化学,Gly一种
18、构型,无旋光性Thr和Ile有四种光学异构体。其余17种氨基酸有两种光学异构体：L型、D型。构成蛋白质的氨基酸均属L-型（L-苏氨酸）。,蛋白质的酸或酶促水解得到的氨基酸都是L-型的，而用碱水解得到的都是无旋光性的DL-外消旋物。,胱氨酸可以形成内消旋胱氨酸。,外消旋物：D-型和L-型的等摩尔混合物。L-苏氨酸和D-苏氨酸组成消旋物。,内消旋物：分子内消旋胱氨酸有三种立体异构体：L-胱氨酸、D-胱氨酸、内消旋胱氨酸。L-胱氨酸和D-胱氨酸是外消旋物,构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(220nm)均有光吸收。在近紫外区(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸
19、有吸收光的能力。酪氨酸的max275nm，275=1.4x103;苯丙氨酸的max257nm，257=2.0 x102;色氨酸的max280nm，280=5.6x103;,（二）氨基酸的光谱性质,蛋白质最大紫外吸收峰在280nm处。,六、氨基酸混合物的分析分离,（一）分配层析法的一般原理,层析系统,固定相（静相）,流动相（动相）,混合物在层折系统中的分离决定于该混合物的组分在这两相中的分配情况，一般用分配系数来描述。,Kd=CA/CB,层析系统中的静相可以是固相、液相或固液混合相(半液体)；动相可以是液相或气相，它充满于静相的空隙中。并能流过静相。,有效分配系数：,Keff是Rv的函数，溶质的
20、有效分配系数可以调整两相的体积比而加以改变。,利用层析法分离混合物例如氨基酸混合物，其先决条件是各种氨基酸成分的分配系数要有差异，哪怕是很小的差异。一般差异越大，越容易分开。,目前在分析分离上使用较广的分配层析法，包括柱层析、纸层析和薄层层析等都是在分配分离的基础上发展起来的。,（二）分配柱层析,层析柱中的填充物或称支持剂都是一些具有亲水性的不溶物质，如纤维索、淀粉、硅胶等：支持剂吸附着一层不会流动的结合水，可以看作为固定相，沿固定相流动的与它不互溶的溶剂(如苯酚、正丁醇等)是流动相。,（三）（滤）纸层析,滤纸层析也是分配层析的一种。滤纸纤维素上吸附的水是固定相，展层用的溶剂是流动相。层析时，
21、混合氦基酸在这两相中不断分配，使它们分布在滤纸的不同位置上。,（四）薄层层析,把支持剂涂布在玻璃板上使成一个均匀的薄层，把要分析的样品滴加在薄层的一端，然后用合适的溶剂在密闭的容器中进行展层，使样品中各个成分分离开来，最后进行鉴定和定量测定。,（五）离子交换层析,分离氨基酸混合物经常使用强酸型阳离于交换树脂。在交换柱中，树脂先用碱处理成钠型，将氨基酸混合液(pH23)上柱。在pH23时，氨基酸主要以阳离子形式存在，与树脂上的钠离子发生交换而被“挂”在构脂上。氨基酸在树脂上结合的牢固程度即氨基酸与树脂间的亲和力，主要决定于它们之间的静电吸引，其次是氨基酸侧链与树脂基质聚苯乙烯之间的疏水相互作用。
22、在PH3左右，氨基酸与阳离子交换树脂之间的静电吸引的大小次序是碱性氨基酸(R2+)中性氨基波(R+)酸性笺基蹈(R0)。因此氨基酸的洗出顺序大体上是酸性氨基波，中性氨基酸，最后是碱性氨基艘。由于氨基酸和树脂之间还存在疏水相互作用，所以氨基康的全部洗出顺序如图326所示。为了使氨基酸从树脂柱上洗脱下来，需要降低它们之间的亲和力，有效的方法是逐步提高洗脱剂的pH和盐浓度(离子强度)，这样各种氨基酸将以不同的速度被洗脱下来。目前已有全部自动化的氨基酸分析仪。,（六）气相色谱,当层折系统的流动相为气体，固定相为涂渍在固体颗粒表面的液体时，此层析技术称为气液色谱(gas-liquid chromatog
23、raphy)或简称为气相色谱。利用气相色谱法进行分离也是基于分配过程，即利用样品组分在流动的气相和固定在颗粒表面的液相中的分配系数不同达到分离组分的目的。,气相色谱法具有微量快速的优点。它在分析生物成分方面的一个限制是要求样品能气化和热稳定性高。氨基酸由于含有各种极性基团，气化十分困难，必须把它转变成容易挥发的化合物才能进行气相层析。氨基酸与苯异硫氰酸酯反应生成PTH氨基酸，然后经三甲基硅烷基化，可得能很好气化的氨基酸衍生物。,（七）高效液相色谱（HPLC）,HPLC的特点是：(1)使用的固定相支持剂颗粒很细，因而表面积很大。(2)溶剂系统采取高压，因此洗脱速度增大，多种类型的柱层析都可用HPLC来代替，例如分配层析、离子交换层析、吸附层析以及凝胶过滤等。,
