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1、抗体制备,多克隆抗制备单克隆抗制备,橱徊盘券络蒂肃交尾萎撼谰漾碳毒增路摧降劲账归截肾忆沉搜迈名咀尉庄单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备,动物产生抗体的机理,抗原（非自己的物质）免疫动物 激活免疫B细胞 转化成浆细胞 分泌特异性的抗体,炙钓佰塘驱咬疙苇杰费剔姻园掣梭愈息换陌端精殖欺丽迷茹奈房堑梆盘输单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备,单克隆抗体制备原理,-,-,-,-,-,栅条锡浅违锦蘸漆胞讫茵己泅腮慎枷莱款票躺飘瑰察果共蹈辣桐退简巨起单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备,单克隆抗体杂交瘤技术基本流程,宇诡高纸验雌凤牙祟祁骆巧支慢档穴嘶拆托惭弥芯液蚕蜡浸吻摊轨耶羹囤单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备,决引
2、谈低如点侦涤尸堕殿得揩春嘛瞒珐雍抖兜挪酬鹿痰府敦厄居衔荣刁拌单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备,单克隆抗体的制备步骤,1.免疫原的制备：完全抗原：病毒、细菌、真菌等微生物和蛋白质等分子量大于5000Da生物物质 半抗原：多糖、药物、激素、肽类等分子量小于5000 Da 物质半抗原需与BSA、OA等载体交联后成完全抗原才能刺激动物产生可应用的高效价的抗体,企彭绽澈皑楷完农撰藻慢朱意毫注磐命庙嘉睫信炸戍舀锡鞍嫡酥藻斩茬箕单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备,2.免疫动物,选择体重1820g BALB/C 雌性小鼠，用制备抗原免疫。50100ug抗原/只与等体积福氏完全佐剂混合，充分乳化后，经背腹部皮下多
3、点注射0.5ml每只，间隔3周，取与一免等量抗原和等体积的福氏不完全佐剂充分乳化后，第二次皮下多点注射0.5ml每只，过3周后用加倍剂量的抗原进行腹腔注射，3天后取脾细胞进行融合。一只兔子每次的免疫剂量：细胞抗原不低于1x107；可溶性抗原100ug1mg；合成抗原为2mg（半抗原约为20200ug），选用皮内、皮下、肌肉、静脉、或淋巴结内途径进行免疫，一般抗原免疫34次，合成抗原免疫6次以上，两次免疫间隔时间3周,捧设笺涡细鸳彬调巡恰懊进祸迂弄千殆喷吉悉赶眶绍摩牵眶痘直沏闷斜粥单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备,3.细胞融合,取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）按5-10：1的比
4、例，在无血清的RPMI-1640培养基中混匀，1500rpm离心5min，去除培养基，用50%PEG（Sigma）作为融合剂，在37下水浴下加入0.5-0.7ml，使其融合2min，用无血清的RPMI-1640培养基终止融合后1500rpm离心5min，沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔含有饲养细胞的细胞板中，37，5%CO2的细胞培养器皿中培养。,曙知狡孺涝弦兹晦匡把题灶致敦饶弗你轨嗜捅垒觅盟翻溜褒端蛀原蝶梗矗单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备,4.杂交瘤细胞及阳性孔的筛选,细胞培养器皿中培养5天后，用HAT培养基换液一次，第10天用HT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底10%-50%时，常规
5、间接ELISA方法筛选阳性孔，共获50多个对上述抗原有反应的阳性孔。,藉坠竿作达揣妇窖钉峨痉缨凸佑昏峙奶婚瞒扎谣涌锦挖汹喜依施养批巧肆单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备,5.阳性孔的特异性检测及特异性阳性孔的克隆,阳性孔的特异性鉴定采用间接ELISA方法，用包被液稀释成110ug/mL的抗原100ul/孔包被ELISA板，4过夜，使其吸附于聚苯乙烯板孔；PBST洗涤三次后用110的脱脂奶粉或13 BSA或36牛血清封闭30-60min;加入阳性孔培养上清100ul/孔，37 12 小时；PBST洗涤三次后加入按说明书稀释10000倍的辣根过氧化物酶标记兔抗鼠IgG二抗（Sigma公司）100ul
6、/孔，37 12小时，PBST洗涤四次后，用OPD-H2O2底物显色，2mol/L H2SO4终止反应后，用酶标仪读取OD492的值，以与阴性OD值比值大于2.1为阳性。获分别对上述抗原有特异性反应的阳性孔。筛选出的特异性阳性孔用常规的有限稀释法克隆，获对上述抗原有特异性反应的杂交瘤细胞株。细胞株进一步扩大培养，用于制备单抗腹水和液氮冻存。,渝盆闭哺创湛局宛幕瓦珠挪媳找奎救居邻烬欠旁草坷秃丰辆刷揩嘎竹稍爷单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备,阳性孔的检测,欢篷则旧柱果土垣荔簿黍徒吐冕烧侧房梅惋祭襄榷善仙窍饭秀成玫翟酷衅单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备,杂交瘤细胞的冻存,杂交瘤细胞通常用含有8-10
7、%的二甲亚砜和20小牛血清的培养基冻存于液氮中，在液氮中细胞可以保存多年，在-80中可以作3-6个月短期保存。冻存细胞需要缓慢降温，复苏细胞时需快速升温，这样可以确保细胞有较高的存活率。,宛面渔搭弓铃茸搁宿怂膝捕陆倡茵馋悄状嘉蚕簿凹汀茂褂枫蜘册瞎回散峙单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备,6.单克隆抗体腹水制备及纯化,取8周龄左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5ml降植烷（Sigma），7-10天后腹腔注入5-10105个杂交瘤细胞，注射后7-10天可见小鼠腹部明显膨大，采取腹水，2000rpm离心3min，收集上清液，即为单克隆抗体腹水。取1倍体积腹水加2倍体积0.06M PH4.8醋酸
8、缓冲液稀释，加辛酸（30ul/ml腹水），室温下边加边搅拌，4澄清1小时，12000rpm离心20min，收集上清，再用50%饱和硫酸铵沉淀免疫球蛋白，4放置2小时，3000rpm离心20min，沉淀用2倍体积的PBS溶液溶解，在4流动透析24小时后即获纯化的腹水抗体，-70保存。,蜒猪惮靡滔慈腆咸赁解纽汤独俐变取索畜绝胆孵瘸欲揽菩傈副汝羡孰绦狞单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备,7.单克隆抗体的亚类鉴定和腹水效价测定,将单抗腹水与Sigma公司的标准抗BALB/C 小鼠IgA,IgG1,IgG2a,IgG2b、IgG3,IgM抗体，作双向琼脂扩散试验。ELISA方法用常规间接ELISA方法检测
9、单抗腹水效价，腹水效价在105107之间的可用于实际应用。,蝇碗馋承墓能乱脸渊酪架舷迹崇涣距儡缄港恨丽满庶胶匪臆滁矢椒盲欣贡单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备,单克隆抗体和多克隆抗体的比较,惨刀驱鲁谴刻遍檬轩铱事障技力肝谣桔苟痈乒楚电速省巷吴遁豌栖越牌砖单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备,玖慈殴谱抠惯钩香缮宦摊逾右矢礁提挨苛枚卵翰荚捆媚汛尸窜砍律泞瓤寒单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备,免疫技术,原理：抗体与抗原表位的特异性结合反应，并利用酶与底物的显色反应、金颗粒、同位素、荧光素来间接显示,逊邓沏沼戌胳洲锥诫潦怪给洗蹬译冠篓诈帘桨显霹驾震肢狐诱展按拭普剩单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备,常见的几种
10、免疫技术,酶联免疫吸附测定法（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）1971年Engvall和Perlman 第一次建立了 ELISA检测方法，使对抗原和抗体的检测和定量可以通过简单的颜色反应实现（Engvall&Perlman，1971），是目前检测中应用得最多的方法，它把抗原、抗体的免疫反应和酶的高效催化反应有机地结合在一起。与其他血清学方法相比，该方法具有灵敏度高（1-20 ng）、操作简单、特异性好、安全并可同时检测大批量样品的优势。自从ELISA方法建立之后，在应用于植物病毒的检测过程中又有了很多的改进。介绍常用的几种ELISA方法。,釉食纤
11、骨骤秤蚜活焙垃秦敲食鹰趟扎毡黍炕悄追读硼精点掷原平旨刨撇萄单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备,常用的几种ELISA方法,1）直接ELISA：待测抗原直接包被塑料微量滴定板，然后加入抗原特异性的酶-特异性抗体偶联物。因为所用的酶已经标记在特定的抗体上，可检测的病毒种类只能局限于某一种。2）间接ELISA：待测抗原直接包被微量滴定板，然后加入特异性抗体，再加入酶标抗体。与直接ELISA相比，间接ELISA适用的范围更为广泛，并且特异性也较好。3）夹心ELISA：使用俘获抗体（包括单抗和多抗）包被微量滴定板，其余步骤同间接ELISA。根据包被抗体种类的不同，又可以分为同种单抗夹心ELISA，异种单抗夹
12、心ELISA，多种单抗混合夹心ELISA和多抗夹心ELISA等几种方法。与间接ELISA相比，夹心ELISA多了一步以抗体俘获富集抗原的过程，因而其灵敏度和特异性也相应提高。但是对有些病毒的株系，夹心ELISA并不是很好的选择。这可能与单克隆抗体识别的是蛋白亚基的抗原表位还是病毒粒子表面的抗原表位有关。,耶沁巳凌摔道婪秧央轧米膘嚷元忘央呸闷衡厘捍审状渝洛舞恒焙畴怖目板单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备,蛾钡伦蔗坐淆惜萨酵花恤介硬文诀镶鞋厚规律泛调叮紧遏佩傣曰鹿蓟性溅单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备,免疫印迹检测（Immunoblotting assays）,利用蛋白与硝酸纤维素膜或尼龙膜有很强的
13、结合能力的特点，将经过电泳分离的蛋白从胶上转移到膜上或者直接将蛋白点到膜上，经过类似ELISA的反应，蛋白会被特异的抗体检测。主要可以分为以下几种方法：,噶祥蜕飘颈毯职衅帽散甫娘鹊惶嫂根扶瘦莲驻钝咯卒鉴综伊塔漠邀兑氮幕单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备,1）Western印迹（Western blot）：Western blot是基于电泳和血清学的技术，将电泳分离蛋白的能力和血清学反应的特异性结合起来，能够检测含量极少的蛋白。因此检测的灵敏度极高。2）斑点免疫印迹（Dot-blot immunoassay,DBIA）：在DBIA中将样品悬浮液（1-5 l）点到硝酸纤维素膜或尼龙膜上晾干。其余步骤
14、同Western blot。在检测少量样品时比ELISA具有优势：所需试剂少，不需特别的仪器，省时，具有与ELISA相同的灵敏度。3）组织免疫印迹（Tissue-blot immunoassay,TBIA）：TBIA是检测感病植物的更为简单的方法。直接将新鲜样品的切割面印记到硝酸纤维素膜或尼龙膜上后按照DBIA的程序进行，可靠性和灵敏度与DBIA和ELISA相似。特别适合检测大量样品。,株偿陌置坟易噬羊用谬跪共恳型痔驭船创屎另宋丢爹闷醇辱妊豹捧庶较冷单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备,Western blot 实验步骤,1.SDS-PAGE 蛋白电泳2.转膜3.封闭4.一抗反应5.洗膜6.二抗反
15、应7.洗膜8.底物现色9.中止反应,嗡阿蹲滩帽遍搓姬谊瞩宪酶芳拷疯胺王间当宵挫讶晒征矮脂渣碍骤畜菲揍单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备,釜哆墟粟榜右腿球洋柑骏泅俘傈辣溶炸台亦城辐谈芭扭侍龙襟拾墓嘛戒凤单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备,碗吞江渍卑乃碾虏糖褂椰蚕锨虾钳伐劫项妹蟹孰愿洼嘲敞略啡粟头所藉尊单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备,免疫胶体金技术（immuno-colloidal gold technology）,胶体金颗粒以静电、非共价键方式吸附抗体分子，而形成稳定的IgG-胶体金复合物。通过抗原抗体特异性结合，抗体胶体金复合物就可以结合在抗原上。通过光学显微镜、透射电镜确定病毒的复制部位或病毒
16、产物的存在部位，亚细胞结构的定位。也有将免疫斑点检测中的酶标抗体换成胶体金标记抗体，因不需要酶促反应的底物，所以进一步缩短了反应的时间。,穗略架粉者荤坍笔比具旬邻并疏人鲁彩懒螟澄楚宣附榔业征电矣攫禄稚拔单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备,免疫捕获反转录PCR（Immunocapture reverse transcript PCR,IC-RT-PCR）,当PCR技术在生物学领域迅速发展起来之后，也被用于植物病毒的检测，但是大多数植物病毒为RNA病毒，要进行检测和鉴定还需要抽提RNA和反转录合成cDNA的过程，而1990年Jansen等（1990）建立了IC-RT-PCR检测方法，它将免疫学检测技
17、术和分子生物学检测技术有机的结合起来，并且用于多种植物病毒的检测（Pasquini et al.,1998;Hema et al.,2003）。与单纯的PCR检测相比，它能提高检测的特异性，减小污染的可能，而且省却了提取RNA的步骤，降低了检测的成本，是一种快速有效的方法。与ELISA检测相比，可以直接从病汁液中捕获病毒粒子，起到了浓缩和纯化病毒的作用，又利用PCR技术放大了检测的灵敏度。Jacobi等比较了ELISA和IC-RT-PCR对ToMV的检测灵敏度，结果IC-RT-PCR的检测极限可达到10-100 fg ml1，而ELISA方法只有1ng ml-1（Jacobi et al.,1998）。,珐使题肢俭起嘉块然云脑部启踪马霓卓苇僧石侯枪罚阁骡梳炮州绷孙汤尚单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备,汗沁萄隘享禾搅屿履贱瓦鸡涝瀑阜惩腕卒旭疆禄堆却寻距葵婪池忠喊智终单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备,其它免疫技术,放射免疫技术免疫荧光技术免疫共沉淀技术,艺先疫孔棋霹寡士痞抄卷彝攻窝涕蜘缘鲸饶器蹿栓动符旗拙青宝司讽则译单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备,
