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1、第16章.示踪技术在植物病理学研究中的应用,第16章.示踪技术在植物病理学研究中的应用1 病原微生物的标记 1.1直接法 通过标记培养基而标记病原微生物的方法。将适合的放射性核素或其标记化合物,加入培养基,然后接种病原微生物,通过培养使其摄取放射性而获得标记,该法仅限于非专性寄生微生物的标记。,方法要点培养基 适合的普通培养基。标记核素 常用14C、32P、35S，如14C-葡萄糖，14C-蔗糖，32P-KH2PO4。放射性活度 MBq/ml的范围 为了避免刮取菌落时被放射性培养基粘污可用双层培养法。,平板培养时，先在含放射性的培养基上接种培养，待菌落铺满后，再在上面铺上一层非放射性培养基，经
2、过一段时间，菌絲将透过上层培养基，这样获得的标记菌落，可避免放射性培养基污染。,1.2 间接法 对专性寄生菌，如锈菌，白粉菌，病毒等应先标记寄主，通过寄生关系使病原微生物得到标记。1）寄主植物 先标记后接种，用一般植物标记法进行标记，干组织应具有0.37 104 3.7 104 Bq/ml。2）寄主真菌 如以真菌为食料的线虫体,先培养并标记交链孢霉菌,取得标记的孢霉菌后,在其体上接种线虫体进行标记。,3）寄主细菌 通过标记细菌使其专性寄生噬菌体得到标记。先标记细菌，洗去放射性粘污，配成放射性菌液，然后接种噬菌斑，经培养止混浊悬浮液变清，表明细菌已几乎被吞食，用细菌过滤器过滤，可获得纯的标记噬菌
3、体。,1.3标记检测 制备的标记病原微生物可用于病原微生物与寄主间相互关系、病害侵染规律、致病机理等方面研究。在应用前要洗净表面的放射性粘污和测定其浓度或比活度。1）洗涤 一般采用徒手振荡，减压抽滤或离心洗涤法，洗至下洗液无明显放射性或接近本底为止。2）测定 32P标记的真菌，可用固型闪烁倍杯法测量，14C-标记的真菌、线虫、细菌等病原生物，可取其悬浮液，用液闪测量，感病生物的患病部位，可用相应制样法制备样品并测量。,2 病害侵染途经的研究 探明病害的侵染途经可为制定防冶措施提供依据。通过一定方法接种病菌后，定时对客体进行空间取样检测或进行自显影，便可确定病菌的侵染途经、过程及规律。2.1 土
4、壤病害侵染途经 土传病害，主要由真菌或线虫引起。进行研究时，病原微生物常用直接拌土壤法,或制成菌液或孢子悬浮液浇灌植株周围土壤的方法引进,使其繁殖达到侵染的目的,然后定期对植珠取样进行放射测定或自显影,判明示踪菌的侵染途经及其在寄主中的分布。,2.2种子传播病害途经 种子传播的病害也为数不少,如水稻白叶枯病,小麦黑粉病,棉花炭疽病。通常用侵种法标记病原生物,检测病原菌由种子侵入幼苗及其过程,以揭示侵染规律和发病机制,开花期侵染的病菌,可在花期于穗部微喷孢子悬浮液方法接种,接种后要套代保湿。2.3 虫媒病害侵染途经 常用间接标记法,即先标记病原植物,再接种昆虫使其吸取标记毒原而标记,然后将其接种
5、于寄主,研究虫媒侵染过程。,2.4 其它病害侵染途经 主要通过杂草,空气与雨水等途经的传播。因为可能招致环境放射污染,使用受到限制,但在严格控制的条件下,一些研究可能提供有价值的信息。禹王树（1986）在稻株接种14C白叶枯细菌，不但当年发病期在田边杂草能检测出放射性，而且次年15种杂草也能检出，表明水稻白叶枯病可以通过田边杂草传播病害。,3 植物病害检测与诊断 植物病害诊断与植物检疫工作中，放射免疫分析以及后来发展起来的酶联吸附免疫分析（ELISA）法,因较传统的血清检验（琼脂糖平板）等方法要灵敏得多，可以检测已感染带毒而尚无症状的植物、定量检测病原菌侵染的数量或产生的代谢毒素，因此被作为病
6、害初期诊断与预报及检疫的重要手段，用于作为进一步进行其它研究的基础。,3.1检测的一般程序,1）试剂制备 培养病原菌 免疫 标记 普通 杂交瘤 标记抗原 多克隆抗体 单克隆抗体（PcAb）(McAb)标记 标记抗体,2)样品制备 植物试样经匀浆或液氮冷冻研磨用缓冲液提取，上清液用于测试。3)测试程序 测定可采用基于饱和竞争结合的放射免疫（RIA)或免疫放射分析。固相载体（聚乙烯）包被抗体（包被液）(V.T.t）拍干洗涤（洗涤液）封板（封闭液）加入样品或标准+抗原*（反应液）温浴（T.t）洗涤（洗涤液）测量B，B/B。=f(Ag):Ag=f-1(B/B。)。,3.2应用举例,4病理学研究的相关技
7、术 阐明病源微生物与寄主之间致病与抗病这一对矛盾的相互作用机理，对于充分利用抗病资源，克服植物病害具有重要意义。在分子水平上，病原微生物在侵染寄主时，首先会释放某种称为激发子的信号物质，通过与寄主细胞表面受体作用，启动相应的基因开关，使其表达并产生一系列次级代谢物，以决定寄主对侵染的反应，致病微生物可以避开寄主的防卫系统，而使其染病，产生诸如如下破坏：真菌产生破坏寄主细胞的酶类（如角质酶，果胶酶，纤维素酶，磷酸酶，蛋白酶等），,使寄主组织软腐坏死，利用寄主的蛋白和核酸合成系统进行自身繁殖，多数病毒属于此类；分泌毒素破坏寄主正常代谢；分泌阻塞寄主导管的物质，致使其枯萎；产生植物激素，破坏寄主的激
8、素平衡。而植物的诱导抗病性则是由植物抗病基因与病原无毒基因相互识别后，诱导的防卫反应决定的。寄主可以通过多种方式抵御病原侵染，如加固细胞进行屏蔽，合成植保素，诱导各种病程相关蛋白等。,在植物各个病理反应阶段的研究，可以使用的示踪相关技术如下：4.1显微免疫定位 利用放射性显影或荧光显像技术，对病源微生物或其激发子等配体的特异受体进行组织、细胞或分子水平的定位。方法是对配体进行放射性或荧光标记，经体内引入或体外组织或细胞孵育，利用显影技术，显示受体类型及分布情况，也可以利用免疫化学方法显示，即非标记配体-受体作用后，利用标记抗配体抗体进行显示。,标记配体（放射性，荧光）体内（引入）器官、组织显像
9、 体外 组织孵育 显微 单细胞孵育 显微、电镜,参考文献1)常青，用配体结合放射性自显影定位分析过敏性哮喘豚鼠肺M胆碱能受体的变化,中国病理生理杂志，1995，11（1）：11142)曾伸奎,棉花凝集素对枯萎病的抑制作用与受体的研究，四川大学学报,1995，32（3）：3283413)楼定安，用非放射性标记法研究低密度脂蛋白受体，科技通报，1994.10（3）：1311414）李前伟，肿瘤VIP受体显影的实验研究,核技术 1998，21（11）：641644,4.2配体受体结合分析原理：相互识别在植物与病原物相互作用中具有重要意义。识别中的信号交流及次级反应的启动与受体的亲合力密切相关，现已鉴
10、定了许多病原物的激发子，大体分为寡糖，糖肽，糖蛋白，多肽 和蛋白五大类。研究病原激发子的受体,对于了解致病过程或植物的抗性机制，以及搞清寄主抗病基因编码的产物是否是病原菌无毒基因编码产物的专化受体等重要研究领域具有重要意义。受体的亲合力和数目，由定量受体Re0与一系列不同稀释浓度的标记配体反应，相关数据stcatchard作图解析确定。即：,则因此，作图，斜率为K(l/mol),X截距(B/F 0),B=Re0。当受体有不同亲和力的位点时，Stcachard 作图不是直线，可通过最小二乘法或剥谱法求得各相应位点的亲和力常数。,操作程序 制备受体材料（组织、单细胞液）配基 孵育 分离B 与F 测
11、定 作Stcatchard图(B/FB),参考文献1)张 良,放射性配基结合分析对不同细胞uPAR表达的比较研究,上海第二医科大学学报,2000，20（2)：1021042)崔毓桂,红细胞胰岛素受体分析法的改良及其初步应用,，标记免役分析与临床,1996，3（4）：1851883)王雨田,消化系肿瘤细胞EGF受体放射分析 与 EGF的生长调节研究,第四军医大学学报,1996,17（5）：3363394)匡安仁,125I-G018 动物体内受体结合研究,华西医大学报，1994，25（2）：131133,4.3mRNA差示显示技术 病原微生物侵染寄主,将启动寄主基因选择性表达,利用mRNA差示显示
12、技术，可以鉴别出与对照表达有差异的基因，进而在分子水平上研究植物致病的病理或生理变化过程。mRNA差示显示原理如下：所有mRNA的3端都有一个Poly（A）尾，因此，利用 3端 引物 T12MN，即在OligodT后接2个选择碱基，M可能为（G、C 或T）三种，N可以为（G、或）四种，共十二种组合，每种覆盖1/12mRNA,通过反转录将把mRAN群体反转录为个个别的c亚群。然后用一个 5端任意引物对每个c亚群进行扩增。,在扩增时，可以掺入S标d或d或其它标记，经测序胶电泳(分辨500bp)，对光片暴光，可以鉴别出对比材料中有差异的DNA片段，将其从胶上切下，再扩增进行克隆分析，就能从c文库或基
13、组DNA文库筛选到全长c或基因克隆.。该方法较传统差异法有巨大的优势,但要使15000种m均可扩增，考虑测序胶能显示50多个带，则需至少20个引物，进行1220次组合PCR，工作量很大，通过对.简并和提高测序胶的容量,该法已有实用的试剂盒。,对照组织/细胞 处理组织/细胞 总RNA(少量）总RNA(少量）Oligo dT12MN cDNA cDNA PCR扩增 5端随机引物，35S PCR产物 PCR产物 变性测序胶 电泳 对照 处理 取下差异带 再次PCR 制备探针 Sorthern,检索 cDNA文库，基因,4.4 病理代谢研究 试验证实，植株感病部位代谢活动较正常部位更为活跃,通过离体培
14、养并饲喂放射性核素或标记前体,检查其惨入代谢物的过程,可进行病理代谢研究。Darokher(1983)将患病TMV烟草叶片下表皮,在含3.7MBq/ml 3H-尿苷中温育3h，下表皮经磨碎、抽提、过滤、离心等纯化,发现患TMV叶片有3H标记核蛋白,其浮力密度为1.231.45g/cm3,放射性出现一至数个峰值,这说明TMV专 化性核蛋白很高，推断TMV作用在寄主的核蛋白上。,5.分子标记在植病研究的应用5.1分子标记类型 分子标记是以DNA多态性为基础，以相应的DNA顺序片段为测度的遗传标记,是继形态标记、胞标记和生化标记后的一种新的标记,是联系遗传图谱和和物理图谱的桥梁，也是继分子杂交，PC
15、R之后迅速兴起并广泛应用的重要生物学实验技术。生物多样性 DNA多态性 顺序片段 分子特征图谱。,根据测度的不同，分子标记主要有：1）RFLP(Restriction fragment length Polymorphism DND marker,限制性片段长度多态性)，该法先用限制性内切酶消化基因组DNA,经琼脂糖凝胶电泳分离后，转移到支持膜上，再用探针（放射性或非放射性）进行杂交，通过显示相应的酶切片段，来表征不同遗传位点变异（多态性）的方法。其具有高度多态，高密度标记，标记共显性，无表型效应等特点，适应构建遗传标记图谱和QTL（数量基用座 Quantitative Trait loci）
16、定位。该法需一套一定数目的组合探针（可由相应基因文库cDNA获得）才能覆盖整个基因组DNA，并达到一定标记密度。方法操作程序相对复杂，且耗时耗钱，但结果可靠，准确。,RFLP过程：A1 A2 A1 A2 A1 A2 A1 A2,2）RAPD(Random amplified polymorphism DNA 随机扩增多态性DNA)RAPD是在PCR技术基础上发展起来的DNA分子多态性检测方法。基本方法是以基因组DNA为模板，使用一套随机核苷序列（通常10个碱基)单引物,通过PCR扩增产生出的不连续DNA片段,用以检测DNA的多态性。RAPD分析步骤简单,DNA用量少,不需要事先知道基因组的任何
17、序列信息,一套引物可用于不同生物的基因组,快速进行多态性的检测,常可用于标准DNA指纹图谱构建,用以分类研究或种质鉴定研究。,3）AFLP（amplification fragment length polymorphism 扩增片段长度多态性）该方法的基本原理是对基因组DNA的限制性内切酶的酶切片段进行选择性扩增。限制性内切片段与互补粘性末端双链通用人工接头连接，连接后的粘性末端顺序作为以后PCR引物的结合位点,实践中根据需要在引物3端可分别加入13个选择性核苷，以达到选择性扩增的目的。通过标记引入物，自显影仅显视选择扩增的片段。AFLP 结合了RAPD和RFLP 的优点，具有RFLP技术的
18、可靠和PCR技术的高效性，可在一个反应内检测大量的限制片段，一次可获得50100条谱带。AFLP对DNA的纯度和内切酶质要求较高。,4）SSR（micro satellite 微卫星）指分散在真核生物基因组序列中的2-4个碱基组成的简单重复序列，如（GA）n（GAA）n等。个体间简单重复序列数目的变化产生的多态性，比RFLP多态性高得多，被认为是继RFLP的第二代分子标记，其不足是必须针对每个染色体上的微卫星，发现其两端的单拷贝序列，据此设计引物，这给SSR标记带来方便，尚需进行进一步研究。,5.2 分子标记的 应用 1）分子标记遗传连锁图谱的构建 分子标记图谱是基因定位的基础，标记密度达到0
19、.1cm 时，可直接对基因定位。图谱构建以同源染色体基因交换重组为测度，交换重组率与基因间距离成正比，图谱单位距离厘摩（CM）大致相当于1%重组率。作图步骤：,建立作图群体 要绘制分子的遗传连续图谱,首先需建立多等位基因分布广泛分离的群体,且群体样本数符合统计要求,常用群体见图。RFLP 分析 对亲本和作图群体进行RFLP分析。先选择对亲本表现多态性的酶与探针组合（6种酶，100200个探针），然后对亲本和作图群体进行RFLP分析，根据自显影谱带，分离群体与母本的代型相同记为A，与父本相同记为B，杂合子记为C，缺失或模记为。图谱构建 Mapmarer/exp.3.0b,几种作图群体的特点,2)
20、QTL定位 数量遗传性状基因座位的定位。因数量遗传效应变化是连续的，常迭加有环境效应，因此一般用统计方法，通过检验某一标记基因型效应的差异是否显及其贡献来确定QTL，最常用的定位方法有方差分析法，（analysis of variance）,区间作图法。,3)种质资源RAPD指纹库 指纹作为研究材料的特征，可用于种质鉴定和分类。指纹库是所有研究个体特异分子标记带的集合，一般由一套引物构建，多态性带构成一个N维空间Rn引1，引2，某个体在某一位置有带为1，无带为零，其在空间有确定的位置，对空间进行聚类可进行分类。,4）质量性状标记的定位 选择有差异的材料进行对比分析，可以用近等基因池的原理，把大匹材料按某一性状有无分为二类，各类基因相混合，进行RAPD多态性分析找出特异性条带。,
