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1、20世纪90年代以来，对于植物细胞及其代谢产物的研究进入了新的发展时期，并出现了很多新技术和新方法，比如诱导子、前体饲养、两相培养法、质体转化、毛状根和冠瘿瘤组织培养等，显示了植物细胞培养工程制药的广阔发展前景。,第七节 进展与展望,一、诱导子在植物细胞工程研究中的应用利用诱导子进行有目的的次生代谢产物调控及生物合成，成为大幅度提高培养物中代谢产物含量的重要方法之一。诱导子（elicitor），是植物抗病生理过程中诱发植物产生植物抗毒素和引起植物过敏反应（hypersensitive reaction,HR,亦称抗性反应或自身防御反应）的因子，包括侵染植物的微生物及植物细胞内的分子。,诱导子在
2、植物与微生物的相互作用中，能快速、高度专一性地诱导特定基因的表达。诱导子可作为研究植物次生代谢信号识别及其细胞内信息传递的良好实验体系。,在植物细胞培养中加入诱导子(激发子Elicitor)可以提高次生代谢产物的产量，并可促进产物分泌到培养基中。,悬浮培养的西洋参细胞经刺盘孢菌丝状诱导子处理后，总皂甙产率由对照的296mg/L增长到了679mg/L，并且有85%排放到了培养基中。将果胶酶（0.2%）添加到青蒿素合成培养基中，处理黄花蒿培养细胞2天，青蒿素合成量比未加刺激的细胞提高了3.08倍。真菌寡聚糖诱导子作为信号分子在南方红豆杉细胞悬浮培养体系中 培养基中添加适量、适浓度CuCl2能够诱导
3、紫杉醇的合成，0.5-30vmol/L范围内，紫杉醇 含量随CuCl2浓度增加而增加，而低于0.5vmol/L时紫杉醇合成为零,1.诱导子的分类,（1）定义植物抗毒素是指在植物防御系统内能对抗微生物进攻的某些次级代谢产物，根据其功能又可称为后感染防御物质。触发形成植物抗毒素信号的物质称为诱导子，能够诱导植物细胞中的一个或几个反应，并能形成特征性自身防御反应的分子。诱导子可分为内源性诱导子和外源性诱导子（根据细胞内或外形成），或分为生物诱导子和非生物诱导子。生物诱导子是指植物在防御过程中为对抗微生物感染而产生的物质。所有不是植物细胞中天然成分但又能触发形植物抗毒素信号的因子称为非生物诱导子。,（
4、2）内源性诱导子内源性诱导子主要指来自植物细胞的分子，多为植物细胞壁在微生物作用下的降解产物（如复杂多糖、糖蛋白）及沉积在细胞壁上的木质素。多糖类又分为纤维素、半纤维素及果胶类。,（3）外源性诱导子外源性诱导子亦称真诱导子（genuine elicitor），是指病源微生物在入侵植物时自身被降解的产物及其代谢产物。目前应用最多的是真菌诱导子，根据其结构可分为4类。多糖类脱乙酰几丁质是真菌细胞壁被几丁质酶酶解的产物，是广泛使用的多糖类诱导子，它可诱导植保素的产生。木质素类及蛋白酶抑制剂，如大雄疫霉（Phytophthora megasperma）是由大雄疫霉细胞壁分离得到的多糖类诱导子，也是最常
5、用的诱导子之一。,糖蛋白类作为微生物细胞壁组成成分之一的糖蛋白类，可诱导引发防御反应。如在Lucene悬浮培养细胞中加入来源于植物病原性真菌的和-糖蛋白可产生具抗菌作用的次生代谢产物。蛋白质类包括一些酶类及具蛋白性质的物质如绿色木霉中的纤维素酶作为诱导子在Grapnine（真诱导子）的悬浮培养中可引起HR反应，另一来源于隐地疫霉的具有蛋白质性质的诱导子亦能诱导HR反应并大量积累植保素cryptogeion。不饱和脂肪酸类不饱和脂肪酸类作为一种诱导抗性反应的诱导子，对其研究不是很充分，但已发现多聚不饱和脂肪酸（花生四烯酸）及其部分酯类可诱导马铃薯植保素risnitin和lubimin的产生。,2
6、.诱导子的作用机制,诱导子在植物中的具体作用机制尚未形成一套详尽的理论体系。非生物诱导子（外部培养条件）协同诱导可增加特征酶群活性。生物诱导子除引起植物在其局部浸染部位做出迅速的过敏反应外，还诱导植物产生植保素，使植物得以免遭病原微生物的侵染和破坏。在此激活过程中，诱导子与细胞膜上受体的结合，改变了膜离子通道，促使诱导过程迅速完成。不同的诱导子可通过植物表面的不同部位而起作用，也是激活反应中有关基因的表现。,3.诱导子在组织和细胞培养及其次生代谢产物生合成研究中的应用,将诱导子应用于植物细胞培养中以提高目的产物产量，这些诱导子包括：（1）糖蛋白类诱导子：如在培养基中加入糖基化的氧化牛血清白蛋白
7、（BSA）和氧化溶菌酶可使烟草叶产生抗原性尼克碱次生代谢产物的产量增加10倍。（2）蛋白质类诱导子：使用果胶酶及链状蛋白酶作为诱导子来调节烟草细胞培养中酪胺代途径中某些的酶的活性。,（3）多糖类诱导子：用不同的诱导子，如镰刀霉菌丝体、乙烯、水杨酸、几丁质和脱乙酰几丁质及其低聚糖，分别作用于多种模型植物上，结果表明用植物病原体镰刀酶感染植株可诱导产生几丁质酶及其同工酶，并表达了强效抗病原体的细胞溶解活性，说明植物可识别病原体并可被诱导产生抗病原体的几丁质酶。天然多糖如几丁质、脱乙酰几丁质及其低聚糖也具有强效细胞溶解活性的几丁质酶及其同工酶的各种功能。另外，多糖类诱导子除诱导改善植物次生代谢产物的
8、产量外，还可通过多糖的胶化性质改变植物细胞膜的通透性及流动性。,（4）微生物类诱导子：通常是真菌诱导子，方法是将其悬浮培养的菌球匀浆处理，再将浆液高压灭菌处理，弃去残渣，得提取物或无菌真菌菌丝体粗提物.在无菌条件下将匀化产物加入到来源于不同组织、器官的细胞悬浮培养物中，同时作出作用时间曲线。在紫杉属植物细胞培养物中为提高紫杉醇、紫杉碱的产量而向培养基中添加的诱导子为灰黄霉素、灰葡萄孢、大丽轮枝孢和融黏带酶的混合培养滤液，还有人用葡萄孢属的无菌菌丝体匀化产物诱导处理罂粟细胞培养物来积累血根碱。不同诱导子作用于不同植物可以产生多种多样的次生代谢产物，可见从植物抗病生理角度来看，这些次生代谢产物多为
9、植保素(植物抗病物质)，而在人类生活中，这些代谢产物也多为有益于人类健康的活性成分.,另一方面，诱导子运用于植物组织培养中亦存在一些问题。如内源性诱导子及酵母提取物是无毒的，而来源于真菌的诱导子多有很强的毒性.随着植保素的诱导合成，植物病原性真菌也诱导了一个过敏反应，就是病毒与宿主细胞相互作用部位细胞的坏死，从而使细胞生长率下降，并可能影响次生代谢产物的产量。降低诱导子浓度可以减少生长的停止状态，然而在诱导子作用下形成次生代谢产物的过程中，低浓度的诱导子只能引起部分诱导，所以诱导的剂量不同，引起的效应也不同。诱导子在不同的作用时间都将在一定程度上影响次生代谢产物的含量，如桔青霉诱导子对红豆杉培
10、养细胞中紫杉醇生合成的影响实验显示，在红豆杉细胞中指数生长期末期时加入诱导子，对紫杉醇合成的促进作用最大。,对于影响植物细胞培养物的生物量的增长和次生代谢产物的积累因素的变化，可因某一因素的调整而影响其他因素，所以在培养过程中要不断的加以平衡和研究。植物具有其本身的特殊性，因此对一种植物细胞或一种次生代谢产物适合的条件不一定适合于其它的次生代谢产物和细胞。诱导子在植物细胞培养物中对次生代谢产物的作用还有待于更进一步的系统研究。,二、前体饲喂,前体饲喂是增加次级代谢产物产率的重要方法。次级代谢产物的合成依赖于三种主要原材料的供应：莽草酸是芳香氨基酸、肉桂酸和某些多酚化合物的前体；氨基酸，形成生物
11、碱及肽类抗生素；乙酸是聚乙炔类、前列腺素类、大环抗生素、多酚类、类异戊二烯等的前体。,基本出发点是在细胞外创造一个次级代谢产物的贮存单元。在培养时可入固相或疏水液相，形成相培养系统，从而达到收集分泌物的目的。该法可以减轻产物本身对细胞代谢的抑制作用，并可保护产物免受培养基中催化酶或酸的影响。可简化下游处理过程，降低生产成本。两相培养系统需满足下列条件：添加的固相或液相对细胞无毒害作用，不影响细胞生长和产物合成；产物易被固相吸附或被有机相溶解；两相易分离；如为固相不吸附培养基中的添加成分(植物生长调节剂或有机成分)。,三、两相法培养（two-phase culture）,四、转基本技术在次级代谢
12、产物生产中的应用,冠瘿组织和毛状根培养技术冠瘿组织是植物受发根农杆菌和根瘿农杆菌感染后，农杆菌将质粒中的一段转移DNA片段整合到植物细胞核的DNA编码基因上，从而作为表现型在感染处长出的冠瘿瘤/毛状根。将冠瘿瘤/毛状根作为培养系统，可进行有用化合物的生产。,毛状根培养 利用发根农杆菌的转化作用进行次级代谢产物的生产，极具发展前途，其生长快速和次级代谢产物含量高，特别适用于从木本植物和难于培养的植物中得到较高含量的次级代谢产物。毛状根具有如下特点：激素自养，不必加外源激素；次级代谢产物含量高且稳定；增殖速度快。,1）.毛状根和冠瘿瘤培养,有些药用植物的活性成分仅在叶片和茎轴中合成，利用冠瘿组织培
13、养易于得到这些物质，冠瘿组织的获得，是由根瘤农杆菌感染植物组织，Ti质粒转化后获得冠瘿瘤，经过除菌后，从冠瘿瘤培养获得的。该组织也具有激素自养、增殖速度快等特点，也可以进行液体培养。,冠瘿组织培养,人工设计新的植物性状用于改良作物的品质和抗性。此技术的关键在于用什么方法将外源基因导入植物的基因组，并能得到高效表达。用农杆菌做载体将外源基因导入植物基因组的方法比较成熟,2、转基因植物和活性成分生产,五、植物生物转化技术与生物制药,利用植物细胞培养以及植物酶对外源底物进行生物转化，从而得到人们想要的目标化合物，称为植物生物转化技术。许多利用植物细胞和酶系统进行的生物转化具有部位以及立体特异性，其反
14、应类型包括氧化反应、还原反应、羟化反应、甲基化反应、乙酰化反应、异构反应、糖基化反应以及酯化反应等。,生物转化（biotransformation,bioconversion），也称生物催化（biocatalysis），是指利用生物离体培养细胞或器官及细胞器等对外源化合物进行结构修饰而获得有价值产物的生理生化反应，其本质是利用生物体系本身所产生的酶对外源化合物进行酶催化反应。具有反应选择性强（立体选择性、位置选择性）、反应条件温和、副产物少、不造成环境污染和后处理简单等优点，并且可以进行传统有机合成不能或很难进行的化学反应。,1.概述,作为生物催化剂，植物细胞培养具有下列优点：可以在实验室中生
15、长，实验重现性好细胞可以无限制的生长，培养物可以大量累积生长循环周期短利用催生物及其产生的酶进行生物转化，所具有的的优点是生物量倍增时间短，微生物的基因操作方法已广泛建立。而植物生物转化系统与之相比，生物量倍增时间较长，产生酶的种类较少且酶量低微。但植物生物转化还是有它独特之处：植物中具有许多微生物中不存在的独特的酶。,利用植物进行生物转化的化合物可以是植物在其代谢过程中产生的中间体，也可以是人工合成的化合物。植物生物转化系统可以与有机合成结合使用，相得益彰。,植物细胞培养具有巨大的产生特定次生代谢产物的潜力，在某些细胞培养物中，虽然不能完成一些重要的次生代谢产物的形成和累积，但保留了将外源底
16、物转化为有用产物的能力。生物转化既可产生新的化合物，又可改造已有的化合物、增加目标产物的产量以及克服化学合成的缺点，而且可通过中间代谢产物的研究阐明化合物的生物合成途径。,许多因素都能影响植物细胞和器官培养物进行的生物转化，例如，前体物的溶解性、细胞的通透性、有活性的酶量、酶的存在位置、副反应的存在、参加降解目的产物的酶量、诱导作用、pH变化以及渗透作用等。通过引入环糊精可以使某些难溶或不溶于水的物质改进水溶性，使之更容易进行生物转化。使用有机溶剂（如异丙醇、二甲亚砜和多糖）都可能增大细胞的通透性，从而促进底物摄取及产物释放，此外还有超声波降解法、电极法和电泳释放以及高电场脉冲和超高压等。,2
17、.植物细胞和器官培养物的生物转化,植物细胞培养和毛状根培养所进行的生物转化为具有治疗活性的化合物的结构改造提供了一个重要工具。但是悬浮培养的最大缺点就是体细胞克隆不稳定，利用组织进行培养时也存在这一问题。而毛状根培养则属于器官培养，具有分化性，其遗传稳定性培养，因此代谢产量也非常稳定。许多因素会影响毛状根的药用次生代谢产物的产生，例如营养成分、诱导子、产物生物转化的前体以及对发根农杆菌Ri质粒的遗传改造等。,通过植物细胞培养物进行生物转化，是一种可以对分子进行结构修饰而使其成为活性化合物的工具。一些比较重要的生物转化类型有：羟基化；糖基化；醇和酮的氧化还原反应；水解反应；环氧化作用；羰基还原反
18、应；碳-碳双键的还原反应；硝基还原反应等。,细胞培养产生次生代谢产物的方法的改进通常与植物细胞的器官化和分化有关，而器官化和分化的理论则是固定化技术应用的基础。利用固定化细胞培养进行生物转化外源底物，具有突出优势：细胞抗剪切能力增强；可以长期重复使用；可能产生较多的生物材料，从而转化更多底物；细胞的恢复更容易；产品后期化学处理更容易。,3.利用固定化细胞培养进行生物转化,固定酶系统具有一定的局限制：被分离的酶在极限pH、加热和加入特定有机溶剂时很容易引起变性，在分离酶的过程中酶的活性会有损失，常常应用于单步反应中。而固定化植物细胞培养与固定酶系统相比，比起固定酶系统而言，作为生物催化剂更具独特
19、的优势。可实行多步酶反应；选择高效生物合成细胞，其催化活性也可增加；不需提供辅因子；更容易操作。全细胞固定化培养还可以创造一种类似全植物的有机组织的微环境，导致细胞分化并且产生较多的次生代谢产物。,4.基因工程方法在生物转化中的应用,植物转基因技术应用于生物转化的方法：将编码催化生物合成反应的关键酶基因转入到真菌或细菌细胞中去增殖，然后再把这个克隆的基因转入到植物当中，并在其中表达。植物转基因技术能够有效地产生和改造现有的生物转化过程，而且有利于研究基因功能和生理性调节及其发展过程。,5.利用植物酶进行生物转化,利用从植物中分离出来的以自由或固定状态存在的酶，也可以催化一些重要的反应，进行生物
20、转化。木瓜蛋白酶氧腈酶环化酶酚氧化酶卤化过氧化酶脂氧酶细胞色素P450单氧化酶。,1.Callus culture-creation of genetic variants via somaclonal variation and/or in vitro selection-elimination of pathogens esp.viruses-gene transfer(eg via Agrobacterium,microprojectiles,2.Meristem culture-clonal propagation-elimination of pathogens-germplasm
21、collection and long-term storage(eg cryopreservation),Virus elimination,virus elimination most useful for vegetatively reproduced species-banana,sugarcane,potato,strawberry,sweet potatochemotherapy and/or thermotherapy may also be usedNB:disease-free planting material may be rapidly rapidly re-infec
22、ted by insect vectors,contaminated soil or implementsthe only long-term solution is genetic resistance,3.Embryo culture-shortening breeding cycles-creating wide hybrids(interspecific/intergeneric)-haploid production via chromosome elimination4.Anther/pollen/ovule culture-production of haploids for g
23、enetic analysis and shortening breeding programmes-creation of genetic variants via gametoclonal variation,5.Protoplast culture-gene transfer-creating wide hybrids via somatic hybridization Plant protoplasts,植物细胞制药实例西洋参细胞培养,西洋参属于五加科人参属植物，为名贵中药材之一，具有降血脂、镇静、造血及健胃作用，其所含的主要有效成分为皂苷，目前尚不能人工合成，但可通过细胞培养技术来制
24、备。,植物细胞制药实例西洋参细胞培养外植体的处理,西洋参细胞种质选择与处理,取人工栽培的西洋参根，自来水充分冲洗、刷洗；切成50-100 mm的片段，浸入70%乙醇中30秒，取出浸于10%漂白粉或0.1%升汞溶液中10-20分，取出后用无菌水充分洗去消毒剂，备用。切成1mm厚，4-5mm见方的立方小块组,植物细胞制药实例西洋参细胞培养,愈伤组织的诱导,培养基：MS培养基添加 2.5 mg/L 2,4-D、0.8mg/L KT及0.7g/L酪蛋白水解物；50mL三角瓶装量为20mL，琼脂浓度0.8%，灭菌后备用。取已消毒的西洋参根的片段，切成1mm厚，4-5mm见方的立方小块组织，向每个培养瓶中
25、接种适宜块数，25-26度培养 20天后即长成愈伤组织。采用同样培养基进行移植继代培养，移植过程每瓶均用同一块愈伤组织切割分散和接种培养。如此往复循环，进行20-30次移植继代培养，即可获得多个西洋参愈伤组织无性系。,植物细胞制药实例西洋参细胞培养,西洋参细胞悬浮培养,培养基：MS培养基添加1.25mg/L 2,4-D、0.4mg/L KT及0.7g/L酪蛋白水解物。500毫升三角瓶装量为100毫升，pH5.8，在99-100KP压力下灭菌15-20分，冷却至室温备用。在无菌操作条件下用50 ml培养基将每瓶西洋参愈伤组织无性系洗下并通过筛网流入无菌量筒中，沉淀10-15分，倾去上清夜，下层细
26、胞倾入含100 ml培养基的500 ml培养瓶中，接种量为1-2 gCDW/L；然后至摇床中，于27-29以 120 rpm速度振荡，振幅为2.5 cm，培养20-25天后即得西洋参细胞悬浮培养物。,二、植物细胞制药实例西洋参细胞培养细胞大量培养,培养基与细胞悬浮培养相同；反应器为10升通气搅拌罐，培养基充满系数为0.7-0.8；将悬浮细胞培养物直接接种至搅拌罐反应器中，细胞接种量为1-2 g/L，27-29 50-70 rpm搅拌速度及 0.6-0.8 M3/M3min分通气速度培养18-20天，即得西洋参细胞培养物。,西洋参细胞大量培养,植物细胞制药实例西洋参细胞培养,细胞大量培养结束后，用过滤或离心方法收集细胞，用去离子水洗涤3-5次，每次抽干，然后于50以下真空干燥或冻干，即得培养的西洋参细胞干粉，收率为3-5 g/L。,细胞收获与干燥,第五章 复习题,1、解释：初级代谢产物、次生代谢产物、外植体2、说明培养基中的碳、氮、无机盐和生长因素。3、说明植物细胞培养基中的碳源来源及其作用。4、说明常用的植物生长素与细胞分裂素。5、培养基中生长素与细胞分裂素的配比的效应。6、举例说明诱导子在培养中的作用。7、举例说明什么是前体饲养？,
