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1、2023/11/7,Analytical Chemistry,第六章 吸光光度法,1、教学目的：掌握光度法的基本原理，了解光度分析条件的控制，分光光度法的应用范围。2、教学重点：Beer定律；光度分析的应用。3、教学难点：光吸收原理；光度分析的准确度。4、吸光光度法：基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法，包括比色法和分光光度法。5、分光光度法的优点：灵敏、准确、快速、选择性好、适于微量组分的测定。,2023/11/7,Analytical Chemistry,第六章 吸光光度法,6-1 概述6-2 光度分析法的设计 6-3 光度分析法的误差6-4 其他吸光光度法和光度分析法的应用,返回
2、,2023/11/7,Analytical Chemistry,6-1 概述,6-1-1 吸光光度法的特点6-1-2 光吸收的基本定律 6-1-3 比色法和吸光光度法及其仪器,返回,2023/11/7,Analytical Chemistry,6.1.1 吸光光度法的特点,波长范围：10-1 10nm 10400nm 400750nm 0.751000m 0.1100cm 11000m光谱区域：X射线 紫外光 可见光 红外 光谱 微波 无线电波,光是一种电磁波，根据波长或频率排列。,1.光的基本性质,2023/11/7,Analytical Chemistry,2.吸收光谱产生的原理,吸收光谱
3、有原子吸收光谱和分子吸收光谱,光的互补示意图,2023/11/7,Analytical Chemistry,2023/11/7,Analytical Chemistry,KMnO4溶液的吸收曲线(cKMnO4:abcd),2023/11/7,Analytical Chemistry,分子、原子、离子具有不连续的量子化能级，仅能吸收当照射光子的能量hv与被照射粒子的 E激 E基（hv）n因为不同物质微粒的结构不同，共有不同的量子化能级，其能量差也不相同,因此对光的吸收具有选择性。若固定某一溶液的浓度 C 和液层厚度 b，测量不同 下的 A，以吸光度 A 对吸收波长 作图，就得到吸收曲线，即吸收光
4、谱。初步定性分析：不同物质吸收曲线的形状与最大吸收波长不同。定量分析：不同 C 的同一物质在吸收峰附近的 A 随 C 而增大，吸收曲线是吸光光度法中选择测定波长的主要依据。,返回,2023/11/7,Analytical Chemistry,3.目视比色法和吸光光度法的特点,主要用于微量组分,特点:(1)灵敏度高：测定含量为 1%10-3%的微量组分及测定含量为10-4%10-5%的痕量组分。(2)准确度较高：比色法 相对误差 5%10%；分光光度法 相对误差 2%5%。(3)应用广泛，操作简便、快速。,2023/11/7,Analytical Chemistry,6.1.2 光吸收的基本定律
5、,1、朗伯比尔(LambertBeer)定律 光通过溶液的情况:Ia为吸收光强度 It为透过光强度 Ir为反射光强度 Io 表示入射光强度 Io=Ia+It+Ir,因为 Ir在测定试样和空白溶液时其影响可相互抵消，故可简化为:Io=Ia+It 透射比T（Transmittance）的定义 T=It/Io,2023/11/7,Analytical Chemistry,吸光度A（Absorbance）的定义：A=lgIo/It因为T=It/10所以 A=lg I0/It=lg1/T,LambertBeer 定律的数学表达式：A=K b c,2.摩尔吸收系数当 A=K b c 式中的 b 用 cm
6、为单位,c 用 molL-1 为单位时，K 用 表示；得 A=b c称为摩尔吸收系数mol-1 cm-1,与吸光物质的性质、入射光波长及温度等因素有关。,2023/11/7,Analytical Chemistry,6.1.3 比色法和吸光光度法及其仪器,1.目视比色法：比较透过光的强度 标准色阶：在相同条件下显色，目视比较。特点：灵敏度高，准确度低，不同人看，结果不同，不符合朗伯比尔定律也可用目视比色法，因为比较的是透过光。2.吸光光度法：与光电比色法的原理相同，只是二者获得单色光的方法不同，前者使用滤光片，后者使用光栅、棱镜，因而比光电比色法的准确度和选择性好。3.分光光度计及其基本部件：
7、光源单色器比色皿（吸收池）检测器显示器,2023/11/7,Analytical Chemistry,（1）光源:钨丝灯:可见、红外 4001000nm氢灯或氘灯：紫外 160350nm（2）单色器：a.滤光片：有机玻璃片或薄膜，利用颜色互补原理。b.棱镜：根据物质的折射率与光的波长有关。玻璃棱镜:可见,石英棱镜:紫 外、可见。c.光栅：在玻璃片或金属片上刻划均匀的线，1200条/mm,衍射、干涉原理。,（3）吸收池:玻璃:可见,石英:紫外、可见（4）检测器:光电转换器件（光电管、光电倍增光，光电二极管阵列）。利用光电效应，光照产生光电流，测定光电流的大小。（5）显示器:检流计：72型。数字显
8、示：722型。数字打印：UV-240,2023/11/7,Analytical Chemistry,6-2 分光光度法设计,6.2.1 显色反应6.2.2 显色条件的选择6.2.3 测量波长和吸光度范围的选择6.2.4 参比溶液的选择6.2.5 标准曲线的制作,返回,2023/11/7,Analytical Chemistry,6.2.1显色反应,1.定义：将待测组分转化成有色化合物的的反应。M LML2.要求:（1）选择性好；（2）灵敏度高，104；（3）有色化合物ML要稳定，不分解；（4）ML的组成要一定（只ML无 MLn）；（5）ML与L颜色差别大,吸收峰波长差：60nm.3.显色剂：要
9、满足以上要求。无机显色剂在光度分 中应用不多，这主要是因为生成的络合物不稳定，灵敏度和选择性也不高。在 分析化学中应用较多的是有机显色剂，有机显色剂及其产物与它们的分子结构有密切关系,返回,2023/11/7,Analytical Chemistry,6.2.2显色条件的选择,1、溶液的酸度：MLML（显色剂L存在酸效应L（H）a.影响显色剂的溶度 b.影响M的存在状态 c.影响ML的组成和稳定性，如Fe3磺基水杨酸pH组成颜色 2-3 1：1 紫红 4-8 1：2 棕褐 8-10 1：3 黄色,返回,2023/11/7,Analytical Chemistry,2.显色剂用量:显色剂过多有时
10、会引起副反应，加入量要严格控制，可通过实验确定。3.温度：通过实验确定温度范围，通常在室温下进行。4.溶剂：一般螯合物在有机溶剂中溶解度大，提高显色反应的灵敏度。如Cu(SCN)42在水中大 部分离 解，几乎无色；在丙酮中呈蓝色。,2023/11/7,Analytical Chemistry,5.显色时间：通过实验找出适宜的显色时间。6.干扰组分：共存组分与显色剂生成有色络合物，正干扰；生成无色络合物，负干扰。干扰的消除：a.制一定酸度，使干扰组分不生色。b.掩蔽剂，与干扰组分生成无色物。c.选择适当的波长。d.选择适当的参比液 e.分离干扰组分,返回,2023/11/7,Analytical
11、 Chemistry,6.2.3测量波长和吸光度范围的选择,1.测量波长的选择(1)“最大吸收原则”：选择被测物质的最大吸收波 长的光作为入射光。(无干扰)(2)”吸收最大，干扰最小”：在最大波长处有其他 物质干扰时。2.吸光度范围的选择：A:0.2-0.8（T为65%-15%）(相对误差较小),返回,2023/11/7,Analytical Chemistry,6.2.4参比溶液的选择,1.M、L均无色，可用蒸馏水作参比。2.L无色，M有色，可用不加显色剂的被测试液作参比溶液。3.L有色，M无色，可选择不加试样溶液的试剂空白作参比溶液。4.L、M均有色，可将一份试液加入适当掩蔽剂，将被测组分
12、掩蔽起来，使之不再与显色剂作用，而显色剂及其他试剂均按试液测定方法加入，以此作为参比溶液。5.改变加入试剂的顺序，使被测组分不发生显色反应，可以此溶液作为参比溶液消除于扰。,返回,2023/11/7,Analytical Chemistry,6.2.5标准曲线的制作,配制一系列标准溶液，作Ac曲线，待测组分的含量可以从标准曲线上查出。,返回,2023/11/7,Analytical Chemistry,6-3 光度分析法的误差,6-3-1 对朗白比耳定律的偏离6-3-2 吸光度测量的误差,返回,2023/11/7,Analytical Chemistry,6.3.1 对朗白比耳定律的偏离,20
13、23/11/7,Analytical Chemistry,1.由于非单色光引起的偏离,因物质对不同波长的光的吸收程度不同，而导致偏离,A 1=A 1-A 2 A 2=A 3-A 4A 1 A 2 直线偏向 c 轴,所以：Beers Law 应在一定的浓度范围内使用 1 不等于2不等于3 A不等于bc A不与 c成线性关系,2023/11/7,Analytical Chemistry,2.溶液本身的化学和物理因素引起的偏离,(1)溶液介质不均匀引起的(2)溶液中的副反应发生而引起的,例如 橙色 黄色 1max=350nm max=375nm 2max=450nm,等吸收点：335 和445的曲线
14、相交处 此点两吸收物质的吸光度相等,2023/11/7,Analytical Chemistry,6.3.2吸光度测量的误差,光度分析的准确度，由仪器本身决定的，对一台仪器来说读数误差T为定值。一定的T，对应的c不同，相对误差c/c不同。c小，T引起的c小，c/c大；c大，T引起的c大，c/c大。,2023/11/7,Analytical Chemistry,相对误差：,返回,2023/11/7,Analytical Chemistry,6-4 其他吸光光度法和光度分析法的应用,6-4-1 示差吸光光度法6-4-2 双波长吸光光度法6-4-3 弱酸和弱减解离常数的测定6-4-4 络合物组成的测
15、定,返回,2023/11/7,Analytical Chemistry,6.4.1 示差吸光光度法,一.标准曲线法测单一组分,1.选择合适的显色反应和显色条件 2.绘出被测组分的 吸收光谱曲线(用标液)3.在max下测一系列标准溶液的A值，绘制工作曲线A-c4.与工作曲线相同的方法，测未知物AX，从工作曲线上查cX,2023/11/7,Analytical Chemistry,例1用Phen测微量Fe：,(1)c fe(标)=100g/mL,10010-6=1.7910-3mol/L M 1000,b=1cm：VFe(标)(mL)：0.20，0.40，0.60，0.80，1.0/50mL容量瓶
16、 A508：0.080，0.150，0.225，0.300，0.375,(2)试样水泥 50ml显色与标准曲线方法相同，测A=0.770,2023/11/7,Analytical Chemistry,例2称钢样0.500g，溶解MnO4-50mL容量瓶，摇匀，从中取5.00mL50mL容量瓶定溶，用2cm比色皿在525nm，=2235，测A=0.124，计算Mn%=？(Mn=54.94),解,A 0.124 c2=2.7710-5mol/L b 22352,Mn c2 50 1000 Mn%=100=0.152 5.00 0.500 50,返回,2023/11/7,Analytical Che
17、mistry,6.4.2双波长吸光光度法,1原理：当没有合适的参比溶液时可选择双波长吸 光光度法；广泛运用于环境试样和生物试 样的分析。2应用：a.混浊试液中组分的测定；b.单组分的测定；c.两组分共存时的分别测定。,返回,2023/11/7,Analytical Chemistry,6.4.3 弱酸和弱减解离常数的测定,HB=H+B-在某波长下，测量溶液吸光度（设酸HB和碱B均有吸收，液层厚度b=1cm）则,返回,2023/11/7,Analytical Chemistry,6.4.4 络合物组成的测定,1.饱和法（又称摩尔比法）固定一种组分（通常是金属离子M）的浓度，改变络合剂（R）的浓度，得到一系列R/M比值不同的溶液，并配制相应的试剂空白作参比液，分别测定其吸光度。以吸光度A为纵坐标，R/M为横坐标作图。,2023/11/7,Analytical Chemistry,2023/11/7,Analytical Chemistry,2.连续变化法(又称等摩尔系列法)cM+cR=c，改变cM和cR的相对量，配制一系列溶液，在有色络合物的最大吸收波长处测量这一系列 溶液的吸光度。当溶液中络合物 MRn浓度最大时，cR/cM比值为n。当cM/c为0.5时，络合比为1:1；当cM/c为0.33，络合比为1:2；,2023/11/7,Analytical Chemistry,返回,
