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1、第八章微生物遗传与变异,第一节遗传变异的物质基础第二节微生物的基因突变第三节 细菌基因转移和重组第四节菌种保藏,遗传：亲代与子代相似。变异：亲代与子代、子代间不同个体不完全相同。遗传（inheritance）和变异（variation）是生命的最本质特性之一。表现型（phenotype）：生物可见的或可测定的性状。遗传型（genotype）：决定生物表现型的遗传因子。,几个概念：,表型是由遗传型所决定，但也和环境有关。适应或饰变(modification)：相同遗传型的生物在不同的外界条件下呈现出的不同表型。特点：暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为。,Serretia marcescen
2、s25下培养时，产生深红色的灵杆菌素，37下时，群体中所有细胞都不产色素。重新降温至25，产色素能力又得到恢复。,一、证明核酸是遗传变异的物质基础的经典 实验（一）转化实验 肺炎球菌的转化现象（英国Griffich1928年首次发现），1944年美国Avery等人进一步阐明了转化因子的本质。（二）噬菌体的感染实验（Hershey和Chase 1952年用大肠杆菌进行了这类实验）（三）病毒的拆开与重建实验（美国法朗克-康勒特1956年发表了这方面的结果）。,第一节遗传变异的物质基础,R,S,S,S,R,肺炎球菌的转化试验（一）,加热杀死,加热杀死,转化试验（二）第一节,S,R,转化因子本质的阐明
3、,噬菌体感染实验,放射性32P85%在沉淀中，放射性35S75%在上清液中,病毒的拆开与重建实验,真核生物 DNA分子与组蛋白结合构成染色体，每条染色体有单一线性双链DNA分子。一个真核生物细胞内有多条染色体（脉孢菌7条，人23条）。高等生物中有2至多套染色体（动物2倍，水稻4倍），真菌有双倍体，但多数微生物是单倍体。真核细胞核物质外有核膜包围，形成完整细胞核。,二、遗传物质在细胞中的存在方式,原核生物 DNA不与组蛋白结合，染色体仅由一条DNA组成，DNA为共价闭合环状双链，一个细胞内只有一条染色体（单倍体haploid）。无核膜包围，只在细胞中央形成核区。质粒（plasmid）原核生物中，
4、除染色体以外，能够自主复制的共价闭合环状DNA分子。它们携带少量遗传基因，决定细胞的某些性状，并非细菌生活必需。,细胞水平：存在于细胞核或核质体，单核或多核 细胞核水平:原核与真核生物的细胞核结构不同；核外DNA 染色体水平:倍性(真核)和染色体数 核酸水平：存在部分二倍体DNA或RNA，复合或裸露，双链或单链 基因水平：具自主复制能力的遗传功能单位，分结构基因和调节基因 密码子水平：信息单位,起始和终止 核苷酸水平：突变或交换单位，四种碱基,核酸存在的七个水平及质粒,微生物的独特生物学特性：,（1）个体的体制极其简单；（2）营养体一般都是单倍体；（3）易于在成分简单的组合培养基上大量生长繁殖
5、；（4）繁殖速度快；（5）易于积累不同的中间代谢产物或终产物；（6）菌落形态特征的可见性和多样性；（7）环境条件对微生物群体中各个个体作用的直接性和均一性；（8）易于形成营养缺陷型；（9）各种微生物一般都有相应的病毒；（10）存在多种处于进化过程中的原始有性生殖方式。,第二节微生物的基因突变,基因突变是重要的生物学现象，它是一切生物变化的根源，连同基因转移、重组一起提供了推动生物进化的遗传多变性。突变：指DNA顺序上核苷酸发生置换或其它顺序上的改变。,突变,自发突变 环境因素的影响，DNA复制过 程的偶然错误等而导致，一般 频率较低，通常为10-610-9。诱变 某些物理、化学因素对生物体 的
6、DNA进行直接作用，突变以 较高的频率产生。,（一）形态突变型（二）营养缺陷型（三）条件致死突变型（四）抗性突变型（五）其他突变型,一、基因突变的类型（表现形式）,形态突变型（morphological mutant）,造成形态改变的突变型。突变株和野生型菌株均可生长，但可从形态特征上进行区分。非选择性突变。如：菌落颜色变化、形成芽孢缺陷菌株等。细胞水平上的形态突变，突变株的检出更加困难。,营养缺陷型（auxotroph）,特点：在选择培养基（一般为基本培养基）上不生长，负选择标记。表示方法：基因型，所需营养物的前三个英文小写斜体字母表示：hisC（组氨酸缺陷型，其中的大写字母C同一表型中不同
7、基因的突变），在具体使用时多用hisC-和hisC+，分别表示缺陷型和野生型。表型，同上，但第一个字母大写，且不用斜体：HisC,影印平板（Replica plating）法是Lederberg夫妇在1952年建立,条件致死突变型（conditional lethal mutant）,在某一条件下具有致死效应，而在另一条件下没有致死效应的突变型。常用的条件致死突变是温度敏感突变，用ts（temperature sensi-tive）表示，这类突变在高温下（如42）是致死的，但可以在低温（如2530）下得到这种突变。负选择标记。,抗性突变型（resistant mutant）,基因突变使菌株对某
8、种或某几种药物，特别是抗生素，产生抗性。突变株可直接从抗性平板上获得-在加有相应抗生素的平板上，只有抗性突变能生长。所以很容易分离得到，正选择标记。表示方法：所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上“r”表示。strr 和 strs 分别表示对链霉素的抗性和敏感性,其它突变类型,毒力、生产某种代谢产物的发酵能力的变化等在实际应用中具有重要意义。突变类型一般都不具有很明显或可直接检测到的表型，其突变株的获得往往需要较大的工作量。,（一）不对应性（二）稀有性（三）独立性（四）诱变性（五）稳定性（六）可逆行 自发突变：环境因素的影响，DNA复制过程的偶然错误等而导致，一般频率较低，通常为10-6-10-
9、9。诱变：某些物理、化学因素对生物体的DNA进行直接作用，突变以较高的频率产生。,二、基因突变的规律（自发突变特点）,三、基因突变的三经典实验（不对应性和自发性的证明）,1943年S.E.Luria与M.Dlbruck进行了Fluctuation test。1949年H.B.Newcombe的Respreding plated incubacion。1952年J.Lederberg夫妇用Replica-plating结束了争论。,甲10ml,乙10ml,大肠杆菌,0.2ml,培养2436h,涂有噬菌体,涂有噬菌体,变量试验,大肠杆菌 1 2 11 12,培养5h 12.3代,直接喷T4培养过夜
10、,重新涂布喷T4培养过夜,抗性菌落 共28个菌落 共353个菌落,各皿菌数相同5 104,5100个菌落,涂布试验,（一）诱变 很多种化学物质能以各种机制导致DNA的突变，这类化学物质称“诱变剂”。DNA突变的利弊：a）利用各种诱变剂获得各类遗传突变，进行诱变育种；b）对有害微生物进行控制；c）危害人类自身的健康。,四、突变的机制,人和细菌在DNA的结构及特性方面是一致的，能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA，使其发生突变，最后造成癌变或其他不良的后果。,“生物化学统一性”法则：,诱变剂的共性原则：,化学药剂对细菌的诱变率与其对动物的致癌性成正比。超过95%的致癌物质对微生物有诱
11、变作用。90%以上的非致癌物质对微生物没有诱变作用。,1.点突变（指DNA顺序上核苷酸发生置换或其它顺序上的改变)的机制：碱基对置换。包括：转换：DNA链中嘌呤被嘌呤、嘧啶被嘧啶所置换。颠换：嘌呤被嘧啶或嘧啶被嘌呤所置换。发生的原因主要是互变异构。对一种诱变剂来说，可同时产生转换和颠换，或只产生一种。,四种碱基的配对原则（华生Wafson和克里克Crick提出）：A一条单链上的嘌呤必须和另一条单链上的嘧啶相配对；B一个6位上是氨基的嘌呤必须和4位上是酮基的嘧啶配对，6位上是酮基的嘌呤必须和4位上是氨基的嘧啶配对，因此AT、GC。,A,T(酮式),T(烯醇式),A:T,T:A,C:G,G:C,A
12、,T,C,G,双链DNA,单链DNA,碱基对的置换,实线代表转换虚线代表颠换,转换示意图,嘌呤嘧啶,嘧啶嘌呤,嘌呤嘧啶,直接与核酸碱基发生化学变化的诱变剂 如硝酸、羟胺和各种烷化剂。以亚硝酸为例：,亚硝酸诱变机制,通过代谢掺入到DNA分子中，间接引起碱基对转换的诱变剂 这是一些碱基类似物，如5-溴尿嘧啶（5-BU）、5-氨基尿嘧啶（5-AU）、8-氮鸟嘧啶（8-NG）和2-氨基嘌呤（2-AP）等。以5-溴尿嘧啶（5-BU）为例，它是胸腺嘧啶的代谢类似物。,同理，5-BU的掺入也可引起GC回复到AT（回复突变），而且只对正在代谢和繁殖的微生物起作用，而对休止细胞游离的噬菌体或离体的DNA分子不起
13、作用。,2.移码突变 少数核苷酸的增加或缺失，造成突变点以后的全部遗传密码的转录和翻译发生错误。丫啶类染料和一类称为ICR（美国肿瘤研究所）类化合物是有效的移码突变的诱变剂。正常DNA链上的三联密码:|ABC|ABC|ABC|ABC|ABC|插入一个碱基：|ABC|AB+|CAB|CAB|CAB|缺失一个碱基：|ABC|BCA|BCA|BCA|BCA|插入一个缺失一个碱基：|ABC|AB+|CAB|CAC|ABC|加进三个碱基：|ABC|+AB|CAB|+CA|BC+|ABC|ABC|,3.染色体畸变 某些理化因子如X射线和亚硝酸等除了引起点突变外，还会产生DNA的大损伤，即染色体的倒位、易位
14、、缺失和重复。使遗传信息发生改变：CGG精氨酸同义突变CGA CAA谷氨酸错义突变精氨酸GGA甘氨酸错义突变 UGA终止无义突变,自发突变是指某些微生物在没有人工参与下所发生的那些突变。1.多因素低剂量的诱变效应 如宇宙间的短波辐射、自然界中普遍存在的一些低浓度诱变物质的作用等。2.微生物自身代谢产物的诱变 过氧化氢是微生物的一种正常代谢产物。它对脉胞霉具诱变作用。3.互变异构效应 4.环出效应,（二）自发突变的机制,基因重组gene recombination 两个不同来源的遗传物质进行交换，经过基因重新组合，形成新的基因型的过程。原核微生物没有有性生殖，其基因重组通过转化、接合、转导方式进
15、行。,第三节 细菌基因转移和重组,接合作用：指供体菌和受体菌的完整细胞经直接接触而传递大段DNA（包括质粒）遗传信息的现象（美国科学工作者莱德伯格和塔图姆1946年发现）。,一、细菌的接合作用,1.实验证据,1946年，Joshua Lederberg 和Edward L.Taturm细菌的多重营养缺陷型杂交实验,中间平板上长出的原养型菌落是两菌株之间发生了遗传交换和重组所致！,证实接合过程需要细胞间的直接接触的“U”型管实验（Bernard Davis，1950）,大肠杆菌的接合机制:接合作用是由一种被称为F因子的质粒介导。F因子的分子量通常为5107，上面有编码细菌产生性菌毛(sex pi
16、li)及控制接合过程进行的20多个基因。,2.机制,F+菌株:含F质粒，细胞表面产生性毛sex pili，与F细胞相连，在接合后转移DNA。F菌株:无F质粒，不产生性毛，可接受外来F质粒。,F（雄性）菌株：细胞有F因子，表面具性伞毛。F（雌性）菌株：Hfr（高频重组）菌株：在Hfr细胞中，F因子整合在染色体的特定位点，因此只要发生接合转移过程，就可以把部分甚至全部细菌染色体传递给F-细胞并发生重组，由此而得名为高频重组菌株。但F因子进入F细胞的机会很少。,在大肠杆菌中，存在着四种接合类型：,FFFF,F菌株：是一种介于F与Hfr之间的菌株。细胞中有游离的但带有一小段染色体基因的环状F因子。FF
17、F。,HfrFHfrF（多数情况下）HfrFHfrHfr（极少情况下）,转导transduction：遗传物质通过噬菌体的携带而转移的基因重组称转导。通过转导获得供体细胞部分遗传性状的重组受体细胞，称为转导子（trans-ductant）。携带供体部分遗传物质（DNA 片段）的噬菌体称为转导噬菌体或转导颗粒。,二、细菌的转导,1952年Zinder 和Lederberg在验证鼠伤寒沙门氏菌是否也存在接合现象时发现了转导现象。S.typhimurium：LT2LT22A；LT22A溶原性噬菌体P22感染LT2（非溶原性）可能释放带AB+的P22LT22A呈原养型。,1.意外的发现,2.转导模型,
18、子代病毒,普遍性转导 结果：形成转导子；流产转导；DNA降解。,3.转导的类型,温和噬菌体,溶源性细菌,被诱导而发生裂解,受体细菌,局限性转导,溶源转变（一个与转导相似又不同的现象）：当温和噬菌体感染其寄主而使之发生溶源化时，因噬菌体的基因加入寄主的基因组而使后者获得除免疫性以外的新性状的现象，称为溶源转变。,溶源转变与局限性转导的不同：首先，在溶源转变中，噬菌体不携带供体菌的任何基因；其次，在溶源转变中的噬菌体都是正常的温和噬菌体，而在局限性转导中，具转导能力的噬菌体却是缺陷噬菌体，它的一部分基因因与寄主基因发生重组而丧失，同时却获得了寄主的部分基因。,三、细菌的遗传转化,转化：是游离DNA
19、片段的转移和重组。游离的DNA片段称为转化因子。两个菌株间是否可以进行转化，这与它们的亲缘关系有关。能进行转化的细胞必须是感受态细胞（凡能吸收外来DNA片段，并能把它整合到自己的染色体组上以实现转化的受体细胞，叫感受态细胞，它由遗传性和生理状态所决定）。,自然感受态与人工感受态的不同？自然感受态的出现是细胞一定生长阶段的生理特性，受细菌自身的基因控制；人工感受态则是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取DNA的能力，或人为地将DNA导入细胞内。（该过程与细菌自身的遗传控制无关！）,1928年，Griffith发现肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）的转化现象 目前已知有二
20、十多个种的细菌具有自然转化的能力。进行自然转化，需要二方面必要的条件：建立了感受态的受体细胞 外源游离DNA分子,1.自然遗传转化（简称自然转化）,自然遗传转化被认为是名副其实 的细胞水平基因转移途径。目前的研究热点：1）细菌为什么要耗费如此多的染色体遗传资源来进行自然转化，即该过程的生物学意义到底何在？它对细菌自身有什么好处？2）自然转化过程的很多细节仍不清楚，包括细菌如何协调感受态的建立，外源DNA进入和重组的具体过程等等。3）细菌中具有自然转化能力的范围，到底有哪些菌具有自然转化能力？4）转化DNA的来源和在自然环境中发生的自然转化。,接合(conjugation)：,细胞与细胞的直接接
21、触（由F因子介导）,转导(transduction)：,由噬菌体介导,自然遗传转化(natural genetic transfor-mation)：,游离DNA分子+感受态细胞,“接合”“转导”及“自然转化”这三种在自然界中存在的细菌遗传重组过程各自的特点：a）外源DNA的来源及进入途径有差异；b）决定因素也各有不同；如何设计实验对三种途径进行区分？,2.人工转化,在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手段，是基因工程的奠基石和基础技术。其“感受态”不是由细菌自身的基因所控制；而是用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一种可以摄取外源DNA的“人工感受态”。用CaCl2处理细胞
22、，电穿孔等是常用的人工转化手段。质粒的转化效率高；,1.有性杂交：即性细胞间的接合和重组过程。凡能产生有性孢子的酵母和霉菌，一般都可用有性杂交育种。2.准性生殖：通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合，不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子。为半知菌育种提供了一个重要手段。,真核微生物的基因重组,菌丝联结 异核体形成（质配）核配形成杂合二倍体体细胞交换和单倍体化。,准性生殖的过程：,准性生殖与有性生殖的比较,微生物育种早先所利用的原理是微生物的自发突变，变异过程十分缓慢。随着科学技术的进步，微生物育种趋向于采用更快、更有效的方法。,四、微生物育种,含抗生素的营养琼脂,不含抗生素的营养
23、琼脂,高 浓度梯度 低,强抗性突变体,中等程度抗性突变体,弱抗性突变体,筛选抗性突变体的梯度 培养皿法,诱变育种就是利用理化因素处理微生物细胞群体，促使其中少数细胞的遗传物质的分子结构发生改变，从而引起微生物的遗传性发生变异，然后设法从群体中选出少数优良性状的菌株。,（一）诱变育种,诱变育种具有极其重要的实践意义:当前发酵工业和其他微生物生产部门所使用的高产菌株，几乎毫无例外地都是通过诱变育种而明显提高其生产性能的。,原始菌种,纯化,斜面/肉汤培养,单孢子/单细胞悬液,诱变剂处理,平板分离,移至斜面,小试,中试,初筛,复筛,计算存活率,观察形态变异，挑单菌落,良种保藏,原菌种特性鉴定,诱变育种
24、的步骤：,诱变育种的主要环节：,以选育高产突变株为例，诱变育种的基本环节概括如下：,变异菌的一般筛选方法,1.平皿快速检测法变色圈法透明圈法生长圈法抑菌圈法梯度平板法2.摇瓶培养法,体内基因重组：指采用接合、转化、转导和原生质体融合等遗传学方法和技术使生物细胞内发生基因重组。1.原生质体融合 2.杂交育种,（二）体内基因重组,苏氨酸缺陷型原生质体的制备原生质体的融合原生质体再生融合子选择,丙氨酸缺陷型聚乙二醇不含苏氨酸不含丙氨酸两者都不含,溶壁酶,原养型菌株,基因工程的基本过程：1、基因的分离与切割 2、体外重组 3、载体传递，导入受体 4、复制表达 5、筛选繁殖,（三）基因工程,基因的分离与
25、切割体外重组载体传递，导入受体复制表达筛选繁殖,基因工程,一、目的：性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。影响微生物菌种稳定性的因素：a）变异；b）污染；c）死亡；,第四节 菌种保藏,菌种衰退的特点：大量群体中的自发突变 菌种的复壮：1.从衰退的菌种群体中把少数个体再找出来，重新获得具有原有典型性状的菌种。a.纯种分离；b.通过寄主体进行复壮；2.有意识地利用微生物会发生自发突变的特性，在日常的菌种维护工作中不断筛选“正变”个体。,二、菌种的衰退与复壮,1.减少传代次数；2.创造良好的培养条件；3.经常进行纯种分离，并对相应的性状指标进行检查；4.采用有效
26、的菌种保藏方法；,三、防止衰退的措施,1.基本要求：在一定时间内使菌种不死、不变、不乱 2.方法 生活态 培养基传代培养 斜面、平板 寄主传代培养 休眠态 冷冻 低温冰箱、斜面低温保藏、液体石蜡封存、液氮 干燥 沙土管、冷冻真空干燥,四、方法,思考题：1.请设计一个实验来决定在一种特定的细菌中发生的遗传转移过程是转化、转导还是接合?说明每一种的预期结果。设想有下列条件和材料可以利用：1.合适的突变菌株和选择培养基；2.Dnase；3.两种虑板：一种能滞留细菌和细菌病毒，但不能滞留DNA分子；另一种只能滞留细菌；4.“U”型管。2.根据你所学的关于诱发突变的知识，你认为能否找到一种仅对某一基因具有特异性诱发作用的化学诱变剂为什么?,
