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1、Protein,第6章蛋白质的功能与进化,一、肌红蛋白的结构与功能二、血红蛋白的结构与功能三、血红蛋白分子病四、免疫球蛋白五、蛋白质的氨基酸序列与生物学功能,（一）、蛋白质功能的多样性,1.催化功能-酶2.调节功能-激素、基因调控因子3.转运功能-膜转运蛋白、血红/血清蛋白4.贮存功能-乳、蛋、谷蛋白5.运动功能-鞭毛、肌肉蛋白6.结构成分-皮、毛、骨、牙、细胞骨架7.支架作用-接头蛋白8.防御功能-免疫球蛋白9.异常功能,一、肌红蛋白的结构和功能,（一）三级结构,myoglobin，Mb,肌红蛋白（myoglobin，Mb）主要存在于肌肉中，是哺乳动物细胞主要是肌细胞贮存和分配氧的蛋白质。肌
2、红蛋白由一条多肽链和一个辅基血红素（heme）构成，相对分子量16700，含153个氨基酸残基。除去血红素后仅剩下的肽链部分称为脱辅基蛋白质（apoprotein),又叫珠蛋白，它和血红蛋白的、亚基有明显的同源性，它们的构象和功能也极为相似。血红素非共价地结合在珠蛋白的疏水空穴中。,抹香鲸肌红蛋白的三级结构,（二）辅基,血红素由原卟啉（protoporphyrin）中间结合一个Fe原子构成，原卟啉是由4个吡咯环通过甲叉桥连接而成的扁平环状化合物。,丙酸基,乙烯基,乙烯基,甲基,乙烯基,血红素,卟啉环中央结合Fe原子，Fe原子通常是八面体配位，应该有6个配位键，其中4个与4个吡咯环的N原子相连，
3、另两个配位键分布在卟啉环的上下。Fe原子可以是二价的或三价的，相应的血红素称为亚铁血红素（ferroheme，heme）和高铁血红素（ferriheme，hematin），相应的肌红蛋白称为亚铁肌红蛋白（ferromyoglobin）和高铁肌红蛋白（ferrimyoglobin，metmyoglobin）。,（三）O2与Mb的结合,近端组氨酸,远端组氨酸,空间位阻,CO的毒性作用,第6个配位位置的空间位阻很重要。游离在溶液中的铁卟啉结合CO的能力比结合O2强25000倍，但在肌红蛋白中，血红素对CO的亲和力仅比对O2的亲和力大250倍。肌红蛋白（还有血红蛋白）降低对CO的亲和力，可以有效地防止
4、代谢过程中产生的少量CO占据它们的O2结合部位。尽管如此，当空气中CO的含量达到0.06%0.08%即有中毒的危险，达到0.1%则会导致死亡。,O2和CO与肌红蛋白血红素Fe（）的结合,肌红蛋白的蛋白质部分的作用,通常情况下，O2分子与Fe（）紧密接触会使Fe（）氧化成Fe（），溶液中游离的亚铁血红素很容易被氧化成高铁血红素，但在肌红蛋白中，由于血红素处于疏水环境中，血红素Fe（）不容易被氧化。同样是血红素，与不同的蛋白质结合后，具有不同的功能，如在细胞色素C中，血红素起可逆电子载体的作用，过氧化氢酶中，血红素催化H2O2歧化成水和O2。,肌红蛋白血红素Fe原子的位移,肌红蛋白血红素在没有与O
5、2结合时，铁原子是向第 5 配位体方向（His F8）突出的。当与O2结合时，铁原子被拉回到卟啉平面。,肌红蛋白血红素Fe原子的位移,肌红蛋白血红素在没有与O2结合时，铁原子是向第 5 配位体方向（His F8）突出的。当与O2结合时，铁原子被拉回到卟啉平面。,（四）Mb的氧结合曲线,MbO2,Mb+O2,氧合Mb,去氧Mb,氧合Mb与去氧Mb的浓度比与氧浓度成正比,氧分数饱和度（fractional satuation）,肌红蛋白分子总数,氧合肌红蛋白分子数,Y=1 Mb被氧完全饱和Y=0.5 p(O2)=K=P50,P50：Mb被氧半饱和时的氧分压,Y,Mb氧结合/解离曲线,Hill图,氧
6、与肌红蛋白结合的Hill图,二、血红蛋白的结构和功能(hemoglobin，Hb),1、结构：1、2、1、2亚基,卟啉铁,肌红蛋白 血红蛋白 血红蛋白,远端组氨酸,近端组氨酸,肌红蛋白/血红蛋白/血红蛋白AA序列不相同，结构相似结构决定功能（载氧）,血红蛋白是一个四聚体蛋白，它与肌红蛋白相比，出现了一些新的性质。血红蛋白的氧合具有正协同同促效应，即一个O2的结合促进同一分子其它亚基与O2的结合。具有这种性质的蛋白质称为别构蛋白（也有负协同效应的）。,血红蛋白的别构效应,别构效应：多亚基蛋白质一般具有多个配体结合部位,一个配体与蛋白质上的一个结合部位的结合影响同一个蛋白质上其他结合部位的亲和力,
7、称为别构效应别构蛋白：多是寡聚蛋白，每个亚基除了有正常的配体结合部位（结合配体）外，还有别构部位（结合调节物），有时配体结合部位和别构部位分属不同的亚基（活性亚基和调节亚基），配体结合部位之间以及配体结合部位和调节部位之间通过蛋白质构象的变化而相互作用。同促(别构)效应：别构蛋白与一种配基的的结合对于和后续同种配基结合能力的影响，包括（正）协同效应和负协同效应。,正协同效应：一种配基的结合促进后续同种配基的结合，S型结合曲线。负协同效应：一种配基的结合抑制促进后续同种配基的结合。异促(别构)效应：就是别构效应，正常配体的结合行为受到另一种配体(调节物)与另一种部位(别构部位)结合的影响。,（二
8、）氧结合引起的Hb的构象变化 变构脱氧血红蛋白 氧合血红蛋白对氧的亲和力低 对氧的亲和力高 1、氧合作用改变Hb四级结构,装配接触,滑动接触,2211,2112,可变,氧合时，每个二聚体半分子作为一个刚体移动，这两个二聚体彼此滑动。我们将其中一个二聚体看作不动，另一个二聚体将绕一个设想的偏心轴旋转15，并平移0.08nm。,血红蛋白氧合时亚基的移动,去氧血红蛋白 11的移动过程 氧合血红蛋白,2、Hb的两种不同构象态,tense state,relaxed state,虽然氧R态和T态的血红蛋白结合，但与R态的亲和力明显高于T态，并且氧的结合稳定了R态。R态是氧合血红蛋白的主要存在形式,T 型
9、血红蛋白肽链之间的8个盐桥 链C末端有Tyr-OH可与C=O形成氢键,（三）Hb氧结合曲线,对于具有n个结合位点的蛋白P：,肌红蛋白和血红蛋白氧结合曲线比较,等轴双曲线,S形曲线,Hill 方程,nH=1非协同,nH 1正协同,nH=n完全协同,Hill系数与配体的结合,Y,(R)relaxed state,(T)tense state,血中氧分子的运送：,静脉,动脉,环境氧高时Hb 快速吸收氧分子,环境氧低时Hb 迅速释放氧分子,释放氧分子后Hb 变回 T state,（四）Hb结合氧的调节,1、H+、CO2促进O2的释放,碳酸酐酶,H+Hb氧合的拮抗物pH降低时：促进氧的释放 缓冲血液pH
10、,CO2与Hb的结合,释放的H+有助于Bohr效应氨甲酸可形成额外的盐桥：稳定T态 促进氧的释放,在氧分压不变时，低pH能促进更多的氧释放,Bohr效应,2、BPG降低Hb对氧的亲和力,2，3-二磷酸甘油酸 Hb异促别构调节的效应物,Hb四聚体只有一个BPG结合部位4个亚基缔合形成的中央空穴内,BPG,离子键稳定T态,O2和BPG与血红蛋白的结合是互相排斥的，虽然它们有自己的结合部位并相隔较远,氧合Hb中央空穴太小，容纳不了BPG,BPG对R态Hb亲和力的大小顺序为:HbO2Hb(O2)2Hb(O2)3 BPG与Hb(O2)4不结合,fetal hemoglobin 胎儿血红蛋白 HbF(22
11、)对氧的亲和力比成人高，从母体的HbA中获得O2 Ser取代His 与BPG结合能力减弱,氧分数饱和度Y,分子病：由于基因突变，导致蛋白质中氨基酸种类发生变化，并引起功能降低或丧失。镰刀型贫血症（sickle-cell anemia）,三、血红蛋白分子病,镰刀状贫血病血液中大量出现镰刀红细胞，患者因此缺氧窒息,正常细胞 镰刀形细胞,它是最早认识的一种分子病死亡率极高由于遗传基因突变导致血红蛋白分子结构突变,镰刀状细胞贫血病,镰刀状细胞贫血病是一种致死性疾病，它的纯合子患者有的在童年就死亡。杂合子患者的寿命也不长，但它能抵抗一种流行于非洲的疟疾。这种疟疾也是一种致死性疾病，甚至对于具有正常血红蛋
12、白的人死于这种疟疾的比例也很高，常常在还没有繁殖后代就已死去。Hbs杂合子患者对这种疟疾有一定的抵抗能力，尚能繁殖后代，这是因为杂合子患者加速被感染红细胞的破坏而中断疟原虫的生活周期的缘故。,HbA和HbS的胰蛋白酶消化液的指纹图谱,HbA（先垂直方向滤纸层析，后水平方向电泳）HbS,正常型-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Lys-链 谷氨酸镰刀型-Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Lys-链 缬氨酸,（极性）（非极性）,N,五、与免疫有关的蛋白质,（一）体内参与免疫反应的淋巴细胞,骨髓,胸腺,T 淋巴细胞,巨噬细胞,B 淋巴细胞,细胞免疫,抗体,体液免疫,2、免
13、疫球蛋白（immunoglobulin）可溶性血清糖蛋白,（1）分类,A、IgA：存在于身体的分泌物中,B、IgD：存在于B细胞表面,C、IgE：与过敏反应有关,D、IgM：初次免疫反应初期产生,E、IgG：体内最多的一类,（2）结构特点 两条轻链（L）、两条重链（H）每条链都有可变区（V）、恒定区（C）可变区都在N端,Fab：Fragment antigen binding,Fc：Fragment crystallizable,（Fab）2和Fc,反平行折叠片,Fab与抗原的结合,IgG是血液中参与免疫反应的最主要的抗体 IgG+抗原 巨噬细胞结合、吞噬,IgM 五聚体，只存在于血液中,（3
14、）基于抗原-抗体反应的生化分析方法,ELISA,免疫印迹,样品纯化 前 后,六、蛋白质结构和功能的进化,1.蛋白质的功能是由空间构象决定的2.蛋白质空间构象由关键部位AA顺序决定3.关键部位AA的变化会引起功能改变,同源蛋白质：来自不同生物体、执行同一/相似功能的蛋白质 同种蛋白质：来自相同生物体、执行同一功能的蛋白质,1、同源蛋白质,蛋白质的AA序列与生物功能,（一）同源蛋白质的物种差异与生物进化,在不同生物体中行使相同或相似功能的蛋白质称为同源蛋白质，例如各种脊椎动物体内的血红蛋白就属于同源蛋白质。同源蛋白质的氨基酸序列具有明显的相似性，这种序列上的相似性叫做同源性。同源蛋白质中有许多氨基
15、酸残基是相同的，称为不变残基，而在不同物种的同源蛋白质中发生了变化的氨基酸残基称为可变残基。亲缘关系越近的同源蛋白质的同源性越强。,一百多个AA残基 MW约12.5103 2 8个不变残基 细胞色素C的AA序列差异可用于核对各物种间的分类学关系以及绘制系统树/进化树。,2、细胞色素C与系统树,细胞色素C,细胞色素C是一种含血红素的蛋白质，在线粒体中起电子传递的作用。大多数细胞色素C含一百零几个氨基酸残基，40多个物种的细胞色素C氨基酸序列分析表明，有28个残基是不变的，所有细胞色素C在第14位,第17位上都是一个Cys残基，这个残基是血红素结合的部位。,invariant residues(y
16、ellow)conservative substitutions(blue)nonconservative or variable residues(unshaded),Conservation and variation of cytochrome c sequences,细胞色素C的不变残基,不同物种细胞色素C的差异残基数,1、氧合血红蛋白,（二）同源蛋白质具有共同的进化起源,氧合血红素蛋白质,肌肉中的氧合血红素蛋白质肌红蛋白由一条肽链组成，含153个氨基酸残基，红细胞中的血红蛋白是一个由两条链（每条141个氨基酸残基），两条链（每条146个氨基酸残基）组成的四聚体蛋白。肌红蛋白、血红蛋白
17、的链和链都是珠蛋白（globin），它们有很高的序列同源性，通过血红素结合氧的能力都被这3种多肽链保留下来了。,氧合血红素蛋白的进化树,该酶类活性中心的Ser残基起关键作用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、凝血酶和纤溶酶它们有足够的序列同源性，在它们的活性中心都有丝氨酸，说明它们可能是由祖先丝氨酸蛋白酶基因发生多次复制和突变进化而来。对底物偏爱不同,2、丝氨酸蛋白酶类,卵清中的溶菌酶（lysozyme）-乳清蛋白（lactalbumin）三级结构很相似 也可能具有共同的祖先。,3、一些功能差异很大的蛋白质,卵清中的溶菌酶（含129个残基，水解细菌细胞壁的多糖成分）和人乳汁中的-乳清蛋白（含123个残基，调节乳糖合成）功能和来源都很不相同，但它们有48个残基是相同的，三级结构也很相似，说明它们具有共同的蛋白质祖先。,
